Name: Analyzing In Vivo Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Zellmigration in vivo durch Zelltransplantation und Zeitraffer-Imaging in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Kandidatengenen in der Entwicklungsbiologie.

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Wir danken F. Bouallague und der IBENS Tiereinrichtung für die hervorragende Pflege der Zebrafische. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde von der Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, den Stipendien N° SFI20111203770 und N° PJA 20131200143 unterstützt.

Hinweis: Die Abbildung 1 zeigt den Umriss des Protokolls. 1. Herstellung der Nadeln für die Injektion und Transplantation Hinweis: Nadeln können jederzeit gespeichert und hergestellt werden. Halten Sie sie in einer Petrischale, auf einem Band aus Knetmasse. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm vor Staub zu schützen. <ol><li> Für Injektionsnadeln, ziehen eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Abzieher (siehe Materialliste). Bevorzugen kurzen und dünnen Nadeln (verjüngte Teil von etwa 5 mm), da sie effizienter zum Durchdringen der Chorion sind. Hinweis: Die Injektionsnadeln sind Einmalgebrauch. </li><li> Nadel für Zelltransplantation <ol><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser von 0,78 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Puller. </li><li> Usingen ein Mikroschmiede (siehe Liste der Materialien), an der Stelle der Spitze der Nadel geschnitten, wo der Innendurchmesser 35 &amp; mgr; m (etwas mehr als der Durchmesser der Zellen transplantiert werden) ist. </li><li> Bevel das geschnittene Ende der Kapillare mit einer microgrinder (siehe Materialliste) mit einem Winkel von 45 °. </li><li> Gegebenenfalls einen Widerhaken am Ende der Nadel ziehen eine Mikroschmiede verwenden. Dazu drücken Sie die Hot-Filament mit der Spitze der Schräge und ziehen Sie sie schnell weg, einen Haken zu schaffen, die das Eindringen des Embryos helfen kann. </li><li> Montieren Sie die Nadel an einem Nadelhalter an einer Spritze befestigt. Mit der Spritze, spülen Sie das Innere der Nadel dreimal mit 2% iger Flußsäure Glasreste zu beseitigen, und spülen Sie dann dreimal mit Aceton. Achtung: Flusssäure ist giftig, zu manipulieren unter der Haube, mit Handschuhen. Hinweis: Die Zelltransplantation Nadeln mehrmals verwendet werden kann. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung desGeschirr für die Injektion und Zelltransplantation <ol><li> Wärme 50 ml Embryo Medium 11 , das 0,5 g Agarose in einer Mikrowelle für 1 min bei voller Leistung 1% Agarose in Embryo - Medium zu erhalten. Kühle das Agarosegel auf etwa 60 ° C und gießt die 50 ml in einer 90 mm Petrischale. An der Oberfläche des Gels eine speziell entwickelte Form (siehe Liste des Materials), entweder mit Linien für die Injektion Schale oder mit Vertiefungen für die Zelltransplantation Gericht. <ol><li> Beachten Sie die Form Schwimmer auf der Agarose, wenn die Agarose nicht zu heiß ist. Nachdem die Agarose - Gel eingestellt ist, entfernen Sie die Form mit einer Pinzette (2A - B). Hinweis: Gerichte können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu ein paar Wochen. Halten Sie sie in einem geschlossenen nassen Feld, um ein Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li><li> Die Schale in einem 28 ° C Inkubator 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Sammlung von Embryonen und Injection <ol><li> Injektionslösung Vorbereitung Hinweis: Actin-Bindungsdomänedes Hefe-Actin-bindendes Protein 140 (ABP-140), wie LifeAct zu mCherry gebunden (nachstehend als ABP140-mCherry) verwendet wird polymerisierten Actin innerhalb der Zelle, um die protrusive Aktivität zu analysieren, um zu veranschaulichen. Fügen Sie eine weitere Verbindung , die die Funktion eines Kandidatengens zu testen (zB mRNA von dominant negative oder konstitutiv aktiven Konstrukt oder Morpholino - Oligonukleotide). Um die Funktionen von Sin1 beurteilen , wie in den Ergebnissen beschrieben (Figur 3), wir Morpholino - Oligonukleotide verwendet. Als Kontrolle verwendeten wir eine morpholino identisch mit dem sin1 morpholino aber für 5 Nukleotiden entlang der Sequenz verteilt , so daß diese Steuer morpholino RNA nicht das Ziel übereinstimmt. <ol><li> Thaw sin1 und 5-Mismatch Kontrolle Morpholinos (2 mM Stammlösungen) und ABP140-mCherry mRNAs auf Eis. In 375 ng von mRNAs (75 ng / pl final) und 0,75 ul entweder sin1 oder 5-Mismatch Kontrolle Morpholin (0,3 mM final) in Danieau Puffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6) mit einem Gesamtvolumen von 5 &amp; mgr; l zu erreichen. </li></ol></li><li> Besamungs Hinweis: Für diese experimentelle Spender und Wirt Embryonen eingerichtet sind transgene Expression der GFP unter der Kontrolle des goosecoid (gsc) Promotor, um die potenzielle Prächordalplatte 11 sichtbar zu machen. <ol><li> Sammeln Tg (gsc: gfp) Eier. Jeweils etwa 80 Eier in einer 90 mm Petrischale mit Embryo Medium gefüllt und Inkubation bei 28 ° C. </li></ol></li><li> Injizieren Spenderembryonen <ol><li> Unter einem Stereomikroskop, drücken Sie sanft gesammelter Embryonen mit einer Pinzette in die Leitungen eines Injektionsform mit Embryo Medium gefüllt. Mit einer Pinzette, orientieren die Embryonen mit den Zellen nach oben. Platzieren das Injektionsschale in den Inkubator bei 28 ° C, bis die Embryonen, die 4-Zellen-Stadium (1 h nach der Befruchtung) erreicht haben. </li><li> Legen Sie eine Injektionsnadel mit 2 ulInjektionslösung. Führen Sie die Nadel in einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die in einem Mikromanipulator angeordnet ist (Liste der Materialien sehen) und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche (siehe Materialliste) zu einer Luft Transjector (siehe Liste der Materialien verbunden ). </li><li> Öffnen Sie die Kapillare vorsichtig die Spitze mit einer feinen Pinzette berührt. Falls erforderlich, schneiden Sie die Kapillare offen von seinem Ende Kneifen. </li><li> Geben Sie eine der vier Zellen mit der Nadel und die Injektion der Lösung in der Zelle, um 70% des Zellvolumens (2 nl) zu füllen. Injizieren 30 Embryonen. Hinweis: Werden die Nadel in der Zelle kann schwierig sein, da die Plasmamembran weich ist. Ziel an der Verbindung zwischen der Zelle und dem Eigelb erleichtert Nadelpenetration. </li><li> Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Kugel Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Embryonen für die Zelle TransplantatIon <ol><li> Es werden 20 ml Embryo-Medium mit 200 &amp; mgr; l Penicillin / Streptomycin (siehe Liste der Materialien) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation der Embryonen im Bereich der Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung) Hinweis: dechorionated Embryonen sehr zerbrechlich sind und bei Kontakt mit Luft oder Kunststoff explodieren. Sie müssen also in Agarose-beschichteten Schalen gelegt werden, und übertragen mit feuerpolierten Pasteur-Glaspipetten. <ol><li> Mit Hilfe einer Pasteurpipette aus Kunststoff, übertragen Host Embryonen im Schritt gesammelt 3.2 und Spender in Schritt 3.3 in zwei 35-mm-Petrischalen mit 1% Agarose in Embryo-Medium beschichtet injizierten Embryonen und mit Pen / Strep EM gefüllt. Halten Sie Host-Embryonen und Spenderembryonen in zwei getrennten Gerichten. </li><li> Extrahieren Sie manuell die Embryonen aus ihrem Chorion mit einer feinen Pinzette (siehe Liste der Materialien). </li><li> Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Schildstufe (6 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben. </li></ol></li></ol>5. Cell Transplantation <ol><li> Ordnen Sie die Embryonen für die Zelltransplantation. <ol><li> Unter einem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Spender Embryonen exprimieren ABP140-mCherry (rot) innerhalb der Abschirmung (grün). </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in den Vertiefungen der Schale Zelltransplantation mit Pen / Strep EM gefüllt. Legen Sie die Host-Embryonen in einer Reihe und die Spenderembryonen in der benachbarten Reihe. </li><li> Mit einem Wimpern orientieren sorgfältig die Embryonen mit dem Schild nach oben. Hinweis: die Position der Abschirmung kann durch GFP-Expression oder anatomisch beurteilt werden. </li></ol></li><li> Transplantation System Set-up. Hinweis: Das Transplantationssystem besteht aus einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die mit PTFE - Schlauch (siehe Materialliste) und einem Rohrverbinder (siehe Materialliste) mit einer Spritze Hamilton mit einem Microdrive (siehe Liste of Materials). Der Nadelhalterangebracht ist , auf einem 3-Wege - Mikromanipulator (siehe Materialliste). <ol><li> Mit Hilfe eines Nadelhalters an einer Spritze befestigt ist, spülen Sie die Nadel für die Zelltransplantation mit 70% Ethanol. Dry von Luft in die Nadel aufsaugt. Nicht trocken durch Blasen, da dies in Staub auftreten kann in dem konischen Teil der Nadel stecken zu bleiben. </li><li> Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter an der Spritze Hamilton verbunden ist, mit der Fase nach oben. </li></ol></li><li> Schild-to-shield Cell Transplantation <ol><li> Geben Sie den Schirm eines Spenders Embryo mit der Nadel Transplantation und ziehen bis etwa 10-20 mit ABP140-mCherry markierten Zellen. vermeiden vorsichtig Dotter zu ziehen. </li><li> Transplantation der Zellen in der Abschirmung des Wirtsembryo. Wiederholen, bis alle Host-Embryonen transplantiert wurden. </li><li> Entfernen Sie alle beschädigten Embryonen mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Legen Sie die transplantierten Embryonen im Inkubator bei 28 ° C und lassen Sie sie für etwa 30 Minuten zu erholen. </li><li> Verwendung einer NadelHalter an einer Spritze befestigt, spülen Sie die Zelltransplantation Nadel mit Wasser und legen Sie es auf einem Band aus Knetmasse in einer Petrischale zurück. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm. </li></ol></li></ol> 6. (Optional) Single Cell Transplantation Hinweis: Im Embryo haften Zellen miteinander, so dass es schwierig ist, nur eine Zelle in der Transplantationsnadel zu ziehen. Wir entwickelten ein modifiziertes Protokoll auf einfache Weise einzelne Prächordalplatte Vorläuferzellen transplantiert. Die Idee besteht darin, Zellen vor der Transplantation zu dissoziieren. Da isolierte prächordalen Zellen Platte Vorläufer neigen dazu, ihre Identität zu verlieren, wir verhängen sie genetisch eine prospektive Identität Prächordalplatte, durch die Nodal-Signalweg zu aktivieren, in Abwesenheit des Sox32 Transkriptionsfaktor. Wir haben bestätigt , dass diese induzierten Zellen wie endogene Prächordalplatte Vorläuferzellen verhalten 8. Im Folgenden sind die einzelnen Schritte Einzelzelltransplantationen durchzuführen. Handy dissociation ist , indem Embryonen in Calcium-Ringer 11, sezieren eine Explantation und mechanisch Rühren erreicht. <ol><li> Im Schritt 2.1 Vorbereitung der Transplantation Schale mit 1% Agarose in Calcium-Ringer anstelle von Embryo Medium. </li><li> Im Schritt 3.1, zusätzlich zu ABP140-mCherry RNA und sin1 Morpholino, fügen Sie 3 ng RNAs codieren , um die aktive Form des Nodal Rezeptor Taram-A (0,6 ng / ul final) und 1,25 ul Morpholin gegen sox32 (Stammlösung bei 2 mM, also 0,5 mM final). </li><li> Nach Schritt 4 Transfer drei ausgewählten Spenderembryonen in der Schale für mit Pen / Strep Calcium-Ringer gefüllt Zelltransplantation eine feuerpolierte Pasteur-Pipette. Mit einer feinen Pinzette, sezieren eine Explantation die injizierten Zellen (ABP140-mCherry markierten Zellen) enthält. Schnell den Rest der Embryonen verwerfen. </li><li> Mit einer Wimpern, rühren Sie vorsichtig die Explantation, bis die Zellen distanzieren. </li><li> Zeichnen Sie eine einzelne isolierte Zelle in der Transplantation Nadel nach obenund verpflanzen sie in die Abschirmung eines Host-Embryo. </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in einem Agarose-beschichtete Schale gefüllt mit Pen / Strep EM. Platzieren Sie die Embryonen in den Inkubator bei 28 ° C für 30 min. </li></ol> 7. Embryo Montage <ol><li> Imaging-Kammer <ol><li> Methode 1: Verwenden Sie eine Imaging - Kammer aus einem Kunststoffschieber zusammengesetzt (75 * 25 * 0,5 mm) durchbohrt mit 4 Löchern (5,5 mm Durchmesser), mit 3 mm hohen Rändern auf einer Seite (2C - D). Kleben Sie ein Deckglas auf der Rückseite, mit Sekundenkleber (Superkleber). Hinweis: Am Ende des Experiments, legen Sie die Kammer in Wasser für eine Nacht das Deckglas zu entfernen und loszuwerden Klebstoffreste mit Sandpapier erhalten. </li><li> Methode 2: verwenden 35 mm MatTek Glasbodenschalen (siehe Materialliste) mit einem 10 - mm - Loch. </li></ol></li><li> Embryo Montage <ol><li> Füllen Sie eine Glasflasche mit 1 ml heißem 0,2% Agarose in Embryo Medium auf.Halten Sie es bei 42 ° C in einem Wärmeblock. </li><li> Unter dem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Sie ein Embryo , in dem rot transplantierten Zellen Teil der potenziellen Prächordalplatte in grün markiert sind (dh rot transplantierten Zellen sind im grünen prospektiven Prächordalplatte, und haben die Migration in Richtung des Tier Pole gestartet). </li><li> Übertragen eines ausgewählten Embryos in die Agarose-Lösung mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Entsorgen Sie die mehr als Embryo Medium aus der Pipette. Zeichnen Sie den Embryo in der Pipette mit Agarose und übertragen den Embryo in der Imaging-Kammer, einen Tropfen Agarose abscheidet. Bevor Agarose gesetzt ist, orientieren, den Embryo mit einer Wimpern. Legen Sie die prospektive Prächordalplatte nach oben für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop oder auf dem Glasboden für die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop. Warten Sie, bis die Agarose eingestellt ist (ca. 1 min, je nach Raumtemperatur), bevor ein anderer Embryo in der nächsten Vertiefung der Kammer Montage. Hinweis: ein Abbildungs ​​chamber 4 Vertiefungen, die erlaubt zu 4 Embryonen bis Montage. </li><li> Wenn die Agarose eingestellt ist, füllen Sie die Kammer mit Pen / Strep EM ein Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li></ol> 8. Live-Imaging <ol><li> Verwenden Sie ein 40-facher Wassertauchlangstrecken-Objektiv. Verwenden Sie geeignete Filtersets Bild GFP und mCherry (für GFP: Anregung BP 470/40, Strahlteiler FT 510 und Emission BP 540/50; für mCherry: Anregung BP 578/21, Strahlteiler FT 596 und Emission LP 641 / 75). Stellen Sie Expositionsdauer, um die Bilddynamik zu optimieren. </li><li> Um das Bild zu allen Zellen in der Platte, zu erwerben z-Stapel, um nur einige um über der prospektiven Prächordalplatte beginnen (im Ektoderm) und ein paar &amp; mgr; m unterhalb der prospektiven Prächordalplatte endet (im Dotter). Verwenden Sie einen z-Schritt von 2 um. Zur Optimierung der Erfassungsgeschwindigkeit, wechseln Farben zwischen z-Stacks statt zwischen Frames. Hinweis: Diese zu geringe Unterschiede zwischen den grünen und roten Bilder führen können, aber es ist kein Problem, da keine genauen Co-localization zwischen den grünen und roten Signale erforderlich. Zur weiteren Abbildungszeit und Belichtung verringern, grün darf nur einmal alle 5 Zeitpunkten erworben werden, die Prächordalplatte Vorläuferzellen zu identifizieren, ausreichend ist. </li><li> Unter Verwendung solcher Einstellungen Bild bis zu 4 Embryonen innerhalb der Zwei-Minuten-Zeitintervall, das notwendig ist, Vorsprung Frequenz und Orientierung zu analysieren. Für die Analyse der Vorsprung Lebensdauer, Zeitintervall auf 30 Sekunden reduzieren, um höhere zeitliche Auflösung erhalten. Bild von 60% epiboly zu 80% epiboly. </li></ol> 9. Zelldynamik Analyse <ol><li> Laden Sie 4D-Bilder in ImageJ Hinweis: Je nach der Software für den Erwerb verwendeten Bilder gespeichert sind, in verschiedenen Formaten (eine Datei pro Bild, eine Datei pro Z-Stapel, eine Datei für das ganze Experiment). Einige ImageJ Plugins sind online verfügbar 4D Stapel zu öffnen. Unsere Daten werden als eine Datei pro Z-Stapel gespeichert. Da die Datenmenge groß sein können, kann es zweckmäßig sein, nur einen Teil davon zu öffnen (einige time Punkte oder ein Unterpunkt der z-Stapel oder 8-Bit konvertiert Bilder ...). Wir verwenden eine maßgeschneiderte ImageJ-Plugin, so zu tun, was wir gerne auf Anfrage zu verteilen. </li><li> Die Analyse der Orientierung und Häufigkeit der Zell Vorsprünge <ol><li> Verwenden Sie GFP Bilder die Hauptrichtung der zukünftigen Prächordalplatte Migration zu bestimmen. Nehmen Sie diese als Referenz für die Zell Vorsprünge Winkelmessungen. Drehen, um den Stapel, so daß diese Bezugsrichtung zu einer Seite des Bildes parallel ist. </li><li> Folgen Sie einer Zelle. Wählen Sie Winkel-Tool. Für jeden Rahmen und jedes Vorsprungs, verwenden , um die Winkel - Werkzeug um den Winkel zwischen dem Vorsprung und der Bezugsrichtung (3A) zu messen. Verwenden Sie die Analyse / Messen Befehl, um den Wert zu speichern (oder drücken Sie M auf der Tastatur). Speichern Sie die Ergebnisse als txt-Datei. Wiederholen Sie mit der nächsten Zelle. </li><li> Importieren Sie die Daten in R und Plotten Winkelverteilung als Histogramme. Verwenden Sie den Kolmogorov-Smirnov-Test (ks.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. Hinweis: Der Winkel Werkzeug stellt Werte zwischen 0 ° und 180 °, was die Verwendung der klassischen statistischen Tests ermöglicht und nicht kreisförmig Tests. </li><li> Mit diesem Datensatz, Emissionsfrequenz als die Anzahl der Vorsprünge pro Zelle pro Minute zu berechnen. Verwenden Student T-Test (t.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. </li></ol></li><li> Die Analyse der Zell Vorsprünge Lebensdauer <ol><li> Für jede Zelle und jeder Vorsprung, messen Vorsprung Dauer (Anzahl der Rahmen, in dem der Vorsprung vorhanden x Zeitintervall zwischen den Bildern ist). </li><li> Importieren Sie die Daten in R. Verwenden Student T-Test (t.test in R) zu unterschiedlichen Bedingungen zu vergleichen. Hinweis: Andere Migrationsfunktionen können interessant sein, zu analysieren, um die Zellmigration zu charakterisieren. Dazu gehören Zellspuren, für Geschwindigkeit, Richtung und Persistenz Messungen oder Zellmorphologie. Einige kommerzielle Software-Anwendungen sind verfügbar, um diese Funktionen zu messen, aber eine große Anzahl von Open-Source-Software-AnwenKationen und ImageJ Plugins auch zur Verfügung stehen, wie zum Beispiel Morphodynamik 12 zu analysieren ADAPT Diper zu betrachten Zelle Trajektorien und Richtungs Persistenz 13, 14 Celltrack während der Migration Zellgrenzen zu verfolgen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll stellt eine einfache Möglichkeit , die Rolle eines Kandidaten - Gen in die Zellmigration in vivo zu untersuchen, durch die Schaffung von Chimären - Embryonen Kombination Zelltransplantation mit Live - Bildgebung. Erstellung von Mosaik-Embryonen Untersuchung der Dynamik einer Zelle erfordert die Visualisierung seiner Kontur zytoplasmatischen Erweiterungen zu analysieren. oder anders bezeichnet - - Dies kann durch Markierung isolierten Zel...

In vielzelligen Organismen, ist die Zellmigration wesentlich sowohl für die Entwicklung des Embryos, wo sie die Organisation von Zellen in Geweben und Organen, und für das Erwachsenenleben gewährleistet, wo es Teil Gewebshomöostase (Wundheilung) und Immunität nimmt. Neben diesen physiologischen Funktionen, ist die Zellmigration in verschiedenen pathologischen Situationen beteiligt, einschließlich, insbesondere Krebsmetastasen. Die Zellmigration ist seit Jahrzehnten in vitro untersucht, ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen , die Bereitstellung zu gewährleisten Zellbewegungen auf ebenen Flächen. In vivo jedoch Zellen werden durch eine komplexere Umgebung konfrontiert. Es ist deutlich in den vergangenen Jahren zeigte sich, dass die Migration innerhalb eines Organismus kann durch externe Signale, wie beispielsweise die extrazelluläre Matrix beeinflusst werden, Zellen oder sezernierte Chemokine benachbarten Migration führen, und dass die Mechanismen der Zellmigration Antriebs von variieren, was beschrieben wurde &lt;em&gt; in vitro 1,2. Die Mechanismen in vivo Zellmigration sichergestellt haben weniger Aufmerksamkeit bisher, vor allem wegen der erhöhten technischen Schwierigkeit, im Vergleich zu in - vitro - Untersuchungen. In vivo - Analyse der Zellmigration insbesondere migrierenden Zellen direkten optischen Zugang erfordert, Techniken einzigartige Zellen zu markieren in um ihre Dynamik und Morphologie sowie Gewinn oder Verlust der Funktion zu sehen, nähert sich die Rolle der Kandidatengene zu testen. Bisher sind nur wenige Modellsysteme diese Merkmale beherbergen wurden 3 verwendete in vivo Zellmigration zu sezieren. Wir haben vor kurzem die Migration der prospektiven Prächordalplatte in frühen Genaktivität als neues praktisches System - Modell bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration 4,5 die Funktion der Kandidaten - Gene zu untersuchen. Prospective Prächordalplatte (auch als vordere mesendoderm bekannt) ist eine Gruppe von Zellen bei Beginn der gast bildenrulation auf der dorsalen Seite des Embryos. Während der Gastrulation wandert diese Gruppe kollektiv gegenüber dem Tier Pol des Embryos 6-8, die Prächordalplatte zu bilden, eine mesendodermal Verdickung, anterior der Chorda und die neurale Platte zugrunde liegt. Der vordere Teil der Prächordalplatte führen zur Schraffur Drüse geben, während sein hinterer Teil trägt wahrscheinlich Mesoderm 9 Kopf. Dank der externen Entwicklung und optische Klarheit des Fischembryo, Zellmigration unmittelbar werden kann und leicht in dieser Struktur beobachtet. Zelltransplantation ist eine sehr potente Technik , die 10 für die schnelle und einfache Erstellung von Mosaik-Embryonen erlaubt. Exprimieren fluoreszierenden Marker Zytoskelett in transplantierten Zellen führt zur Markierung von isolierten Zellen kann die Morphologie und die Dynamik, die leicht beobachtet werden. dies zu einem Verlust oder Gewinn von Funktions Kombination Ansätze ermöglicht die Analyse von Zell-autonome Funktionen einer Dosetritts Gen. Das dargestellte Protokoll beschreibt , wie wir die Funktion des TORC2 Komponente Sin1 in Steuerung der Zellmigration und Aktindynamik in vivo 5 beurteilt. Aber, wie in den Ergebnissen genannten und weiter diskutiert, könnte es verwendet werden , um die potentiellen Auswirkungen jeder Kandidatengens Migration in Steuern Zelle in vivo zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Glaskapillaren (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,58&nbsp; mm)</td><td>Harvard Apparat</td><td>300085</td><td>Standarddicke</td></tr><tr><td>Glaskapillaren (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,78 mm)</td><td>Harvard Apparat 300085</td><td></td><td>dünnwandiges</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333 10</td><td>&nbsp; 000&nbsp; Einheiten Penicillin und 10&nbsp; mg Streptomycin pro ml</td></tr><tr><td>feine Pinzette</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>Glasbodenschalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Lufttransjektor</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (zur Injektion)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator (für Zelltransplantation)</td><td>Leica</td><td>Leica Mikromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Spritze</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantationsform</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchverbinder</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Schlauch</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing<em&gt; in vivo</em&gt; zellmigration unter verwendung von zelltransplantationen und zeitraffer-imaging in zebrafischembryonen

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Zellmigration ist der Schlüssel zu vielen physiologischen und pathologischen Zuständen, einschließlich Krebsmetastasen. Die zellulären und molekularen Grundlagen der Zellmigration wurden in vitro gründlich analysiert. Die In-vivo-Zellmigration unterscheidet sich jedoch in gewisser Weise von der In-vitro-Migration und hat sich als schwieriger zu analysieren erwiesen, da sie für direkte Beobachtung und Manipulation weniger zugänglich ist. Dieses Protokoll nutzt die Migration der prospektiven prächordalen Platte im frühen Zebrafischembryo als Modellsystem, um die Funktion von Kandidatengenen bei der Zellmigration zu untersuchen. Die Vorläuferzellen der prächordalen Platte bilden eine Gruppe von Zellen, die während der Gastrulation eine gerichtete Wanderung vom embryonalen Organisator zum tierischen Pol des Embryos durchläuft. Das vorgeschlagene Protokoll verwendet eine Zelltransplantation, um Mosaikembryonen zu erzeugen. Dies bietet die kombinierten Vorteile der Markierung isolierter Zellen, was der Schlüssel zu einer guten Bildgebung ist, und der Begrenzung von Gewinn-/Verlusteffekten auf die beobachteten Zellen, wodurch zellautonome Effekte gewährleistet werden. Wir beschreiben hier, wie wir die Funktion der TORC2-Komponente Sin1 bei der Zellmigration bewertet haben, aber das Protokoll kann verwendet werden, um die Funktion jedes Kandidatengens bei der Kontrolle der Zellmigration in vivo zu analysieren.

Die vorgestellte Technik wurde verwendet , um die Rolle der Sin1, einer der Kernkomponenten des Tor - Komplex 2 (TORC2), bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration zu analysieren. Die Verwendung von Zelltransplantation ermöglicht die Kennzeichnung von isolierten Zellen und Analyse von Zell-autonome Effekte. Film S1 zeigt die Migration von transplantierten Prächordalplatte Vorläuferzellen. Aktin Kennzeichnung mit ABP140 ermöglicht die einfache Visualisierung von Aktin-reichen Cy...

Durch die Kombination von Zelltransplantation, Zytoskelettmarkierung und Funktionsverlust/-gewinn beschreibt dieses Protokoll, wie die migrierende Zebrafisch-prospektive prächordale Platte verwendet werden kann, um die Funktion eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion eines Kandidatengens bei der Kontrolle der Zellmigration in vivo mithilfe von Zelltransplantation in Kombination mit Live-Bildgebung im Zebrafischembryo zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellmigration zu beantworten, beispielsweise die Rolle und Bedeutung neuer Kandidatengene bei der Zellmigration in vivo zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie mosaikartige Embryonen erzeugt, was eine gute Bildgebung und die Beobachtung der Zelladenomyose ermöglicht.Zur Herstellung von Zelltransplantationsnadeln verwenden Sie einen Mikropipettenzug, um eine Glas-Kapillare zu ziehen. Anschließend schneiden Sie mit einem Mikroschleifer die Nadelspitze an der Stelle ab, an der der Innendurchmesser 35 Mikrometer beträgt. Beveln Sie das abgeschnittene Ende der Kapillare mithilfe eines Mikroschleifers in einem Winkel von 45 Grad.Um Glasrückstände zu entfernen, setzen Sie die Nadel in einen Nadelhalter, der an einer Spritze befestigt ist, und spülen Sie das Innere der Nadel dreimal mit 2 %iger Flusssäure aus, indem Sie die Lösung hinein- und herausziehen. Anschließend spülen Sie die Nadel dreimal mit Aceton. Um Schalen für die Injektion oder Zelltransplantation vorzubereiten, stellen Sie 1 % Agarose her, indem Sie 50 Milliliter Embryomedium, das 0,5 Gramm Agarose enthält, in einer Mikrowelle eine Minute lang bei voller Leistung erhitzen.K&uuml;hlen Sie das Agarosegel auf etwa 60 Grad Celsius ab und gie&szlig;en Sie das gesamte Volumen in eine 90 Millimeter gro&szlig;e Petrischale. Setzen Sie eine Form ein, um Linien f&uuml;r die Injektion oder Vertiefungen f&uuml;r die Zelltransplantation zu erzeugen. Wenn das Agarosegel erstarrt ist, entfernen Sie die Form mit einer Pinzette.Um Spenderembryonen zu injizieren, drücken Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig die gesammelten transgenen Embryonen mit einer Pinzette in die Rillen einer Injektionsschale, die mit Embryomedium gefüllt ist. Orientieren Sie die Embryonen mit der Pinzette so, dass die Zellen nach oben zeigen, und inkubieren Sie die Schale bei 28 Grad Celsius, bis die Embryonen das Vier-Zellen-Stadium erreicht haben. Laden Sie anschließend eine Injektionsnadel mit zwei Mikrolitern einer zuvor hergestellten Injektionslösung, die die Aktin-bindende Domäne des Hefe-Aktin-bindenden Proteins 140, gekoppelt an mcherry, enthält.Danach die Nadel in einen Nadelschaft, der an einem Mikromanipulator befestigt und mit einem Luftinjektor verbunden ist, einführen. Die Nadel öffnen, indem man mit feiner Pinzette vorsichtig die Nadelspitze berührt oder deren Ende einklemmt. Anschließend die Nadel in eine der vier Zellen einführen und die Lösung injizieren, bis 70 % des Zellvolumens gefüllt sind.Injizieren Sie 30 Embryonen auf ähnliche Weise. Sobald die Embryonen das Sphärenstadium erreicht haben, überführen Sie mithilfe einer Pasteur-Pipette aus Plastik transgene Wirtsembryonen mit Goosecoid-GFP und zuvor injizierte Donorembryonen in getrennte 35-Millimeter-Petri-Schalen, die mit einer Millimeter dicken Agarose-Schicht in Embryomedium beschichtet und mit Pen/Strep-Embryomedium gefüllt sind. Entfernen Sie die Embryonen mit feinen Pinzetten manuell aus ihren Chorionen.Danach die Embryonen in den Inkubator bei 28 Grad Celsius geben. Wenn die Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop das Schild-Entwicklungsstadium erreicht haben, Spenderembryonen auswählen, die ABP140-mCherry innerhalb des grünen Schilds exprimieren. Mit einer angeschmolzenen Pasteurpipette die Wirtsembryonen in eine Reihe von Vertiefungen in der Zelltransplantationsschale übertragen, die mit Pen/Strep-EM gefüllt ist. Danach die Spenderembryonen in die benachbarte Reihe bringen.Danach mit einer Wimper die Embryonen vorsichtig so ausrichten, dass der Schild nach oben zeigt. Anschließend die Nadelspitze mit einem an eine Spritze angeschlossenen Nadelhalter spülen, indem 70 % Ethanol angesaugt und wieder ausgestoßen wird. Die Nadel trocknen, indem Luft in sie hineingezogen wird.Wenn die Nadel trocken ist, setzen Sie sie in den Nadelaufsatz ein, der mit der Hamilton-Spritze verbunden ist, wobei die Schräge nach oben weist. Um eine Schild-an-Schild-Transplantation durchzuführen, bringen Sie die Transplantationsnadel in das Schild eines Spenderembryos ein und saugen etwa 10 bis 20 Zellen auf, die mit ABP140 mcherry markiert sind. Vermeiden Sie sorgfältig, Dotter aufzusaugen.Transplantieren Sie die Zellen in das Schild des Wirtsembryos und wiederholen Sie die Zellübertragung, bis alle Wirtsembryonen transplantiert wurden. Wenn die Transplantation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine an der Flamme geglättete Pasteurpipette, um beschädigte Embryonen zu entfernen. Inkubieren Sie die transplantierten Embryonen bei 28 Grad Celsius für etwa 30 Minuten, um ihnen die Erholung zu ermöglichen.Um einzelne prächordale Platte-Vorläuferzellen zu transplantieren, nachdem die Embryonen wie zuvor gezeigt dechorioniert wurden, verwenden Sie eine feuerpolierte Pasteurpipette, um drei Donorembrbyonen in eine Zelltransplantationsschale zu überführen, die mit Pen/Strep-kalziumfreiem Ringerlösung gefüllt ist. Dissezieren Sie mit feinen Pinzetten für jeden Embryo ein Explant, das die injizierten, mit ABP140 mCherry markierten Zellen enthält, und verwerfen Sie den Rest der Embryonen schnell. Rühren Sie die Explantate vorsichtig mit einer Wimper um, bis sich die Zellen lösen.Anschließend eine einzelne, isolierte Zelle in die Transplantationsnadel aufziehen und in den Schild eines Wirtsembryos transplantieren, wie zuvor im Video gezeigt. Um eine optimale Kontrolle der Aspiration und Transplantation zu gewährleisten, sollte die Luft/Wasser-Grenzfläche etwa 20 Zentimeter vom Ende der Nadel entfernt gehalten werden. Zum Montieren der Embryonen ein Glasbodenröhrchen mit einem Millimeter heißen 0,2 %igen Agarose in EM füllen. Das Röhrchen bei 42 Grad Celsius in einen Wärmeblock stellen.Übertragen Sie ein ausgewähltes Embryo in die Agaroselösung und entsorgen Sie das überschüssige Embryomedium aus der Pipette. Danach saugen Sie das Embryo gemeinsam mit der Agarose in die Pipette auf und übertragen es zusammen mit einem Tropfen Agarose in eine zuvor vorbereitete Bildgebungskammer. Bevor die Agarose erstarrt, richten Sie das Embryo mit einer Wimper aus, indem Sie die prächoridale Platte nach oben weisen lassen, um sie mit einem aufrechten Mikroskop abzubilden, oder legen Sie es auf den Glasboden, um es mit einem invertierten Mikroskop abzubilden.Es stehen etwa 40 Sekunden zur Verfügung, um das Embryo auszurichten, bevor das Agarosegel je nach Raumtemperatur erstarrt. Richten Sie das Embryo schnell aus, indem Sie das Keimblatt und nicht das sehr empfindliche Eiweiß manipulieren. Nachdem alle Embryonen montiert sind und die Agarose erstarrt ist, füllen Sie die Kammer mit Pen/Strep EM, um zu verhindern, dass die Embryonen austrocknen.Führen Sie Live-Cell-Imaging- und Zelldynamik-Experimente gemäß dem Textprotokoll durch. Die in diesem Video demonstrierte Technik wurde verwendet, um die Rolle von Sin1, einer der kerneigenen Komponenten des TOR-Komplexes zwei, bei der Kontrolle der Zellmigration in vivo zu analysieren. Dieser Film zeigt die Migration transplantierten prächordalen Platten-Vorläuferzellen.Die Aktinmarkierung ermöglicht die Visualisierung aktinreicher zytoplasmatischer Fortsätze. Durch die Analyse von Häufigkeit und Orientierung wurde beobachtet, dass Wildtyp-Zellen häufig große zytoplasmatische Fortsätze bilden, die in Richtung des animalen Pols und der Migrationsrichtung ausgerichtet sind. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, führt der Funktionsverlust von Sin1 zu einer drastischen Verringerung der Anzahl der Fortsätze und zu einer Zufallsverteilung der verbleibenden Fortsätze, was die Bedeutung von Sin1 bei der Steuerung der Bildung aktinreicher Fortsätze verdeutlicht.Interessanterweise kann das Sin1-Phänotyp durch die Expression einer konstitutiv aktiven Form von Rac1 gerettet werden, was stark darauf hindeutet, dass TORC2 die Aktindynamik und die Bildung von Zellfortsätzen über Rac1 steuert. Diese Technik wurde ebenfalls verwendet, um die Rolle von Arpin, einem Inhibitor des ARP2/3-Komplexes bei der Zellmigration, zu analysieren. Wie hier gezeigt, führt der Funktionsverlust von Arpin zu einer erhöhten Frequenz von Fortsätzen, entweder aufgrund häufigerer Bildung von Fortsätzen oder einer Zunahme der Stabilität der Fortsätze.Die Messung der Lebensdauer von Ausstülpungen in Abwesenheit von Arpin zeigte, dass die zeitliche Beständigkeit der Ausstülpungen verdoppelt war, was auf eine erhöhte Stabilität hindeutet. Sobald die Technik beherrscht ist, können etwa 30 Embryonen innerhalb von 45 Minuten transplantiert werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Entwicklung der Embryonen im Auge zu behalten, da alle Schritte kritisch zeitlich abgestimmt sind.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die lebende konfokale Mikroskopie angewendet werden, um eine verbesserte Bildgebung zu erzielen und Fragen zur subzellulären Organisation von zytoskeltischen Elementen, Polaritätsmarkern, assoziierten Proteinen oder anderen zellulären Bestandteilen zu beantworten. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Transplantate von Prächordalplattprogenitoren verwendet werden können, um die Rolle eines beliebigen Kandidatengens bei der Zellmigration in vivo zu analysieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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