Analyzing In Vivo Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion eines Kandidatengens bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration durch Zelltransplantation in Kombination mit Live-Bildgebung im Zebrafischembryo zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellmigration zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Rolle und Bedeutung neuer Kandidatengene bei der in vivo-Zellmigration. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Mosaikembryonen erzeugt, die eine gute Bildgebung und Zelladenomyose ermöglichen.

Zur Vorbereitung von Zelltransplantationsnadeln verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um eine Glaskapilare zu ziehen. Schneiden Sie dann mit einer Mikroschmiede die Spitze der Nadel an der Stelle ab, an der der Innendurchmesser 35 Mikrometer beträgt. Mit einer Mikroschleifmaschine das abgeschnittene Ende der Kapillare in einem Winkel von 45 Grad abschrägen.

Um Glasreste zu entfernen, führen Sie die Nadel in einen Nadelhalter ein, der an einer Spritze montiert ist, und spülen Sie dann mit 2%iger Flusssäure das Innere der Nadel dreimal ab, indem Sie die Lösung ein- und ausziehen. Spülen Sie die Nadel anschließend dreimal mit Aceton aus. Um Gerichte für die Injektion oder Zelltransplantation zuzubereiten, bereiten Sie 1%Agarose zu, indem Sie 50 Milliliter Embryomedium mit 0,5 Gramm Agarose in der Mikrowelle eine Minute lang bei voller Leistung erhitzen.

Kühlen Sie das Agarose-Gel auf etwa 60 Grad Celsius ab und gießen Sie das gesamte Volumen in eine 90 Millimeter große Petrischale. Setzen Sie eine Form ein, um Injektionslinien oder Vertiefungen für die Zelltransplantation zu erstellen. Wenn das Agarose-Gel fest ist, verwenden Sie eine Pinzette, um den Schimmel zu entfernen.

Um Spenderembryonen zu injizieren, verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Pinzette, um gesammelte transgene Embryonen vorsichtig in die Leitungen einer mit Embryomedium gefüllten Injektionsschale zu drücken. Richten Sie die Embryonen mit einer Pinzette mit den Zellen nach oben aus und inkubieren Sie die Schale bei 28 Grad Celsius, bis die Embryonen das Vierzellstadium erreicht haben. Als nächstes wird eine Injektionsnadel mit zwei Mikrolitern einer zuvor hergestellten Injektionslösung beladen, die die Aktin-Bindungsdomäne des an mcherry gebundenen Hefe-Aktin-bindenden Proteins 140 enthält.

Führen Sie dann die Nadel in einen Nadelhalter ein, der an einem Mikromanipulator befestigt und mit einem Luftauswerfer verbunden ist. Öffnen Sie die Nadel, indem Sie die Nadelspitze mit einer feinen Pinzette sanft berühren oder indem Sie die Extremität einklemmen. Führen Sie dann die Nadel in eine der vier Zellen ein und injizieren Sie die Lösung, um 70 % des Zellvolumens zu füllen.

Injizieren Sie 30 Embryonen auf ähnliche Weise. Wenn die Embryonen das Kugelstadium erreicht haben, verwenden Sie eine Weidepipette aus Kunststoff, um transgene Gänsehaut-GFP-Embryonen des Wirts und zuvor injizierte Spenderembryonen in separate 35-Millimeter-Petrischalen zu übertragen, die mit einem Millimeter Agarose im Embryomedium beschichtet und mit Pen/Streptokokken-Embryomedium gefüllt sind. Mit einer feinen Pinzette werden die Embryonen manuell aus ihren Chorionen entnommen.

Legen Sie dann die Embryonen bei 28 Grad Celsius in den Inkubator. Wenn die Embryonen das Schildstadium erreicht haben, wählen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop Spenderembryonen aus, die ABP140 mcherry innerhalb des grünen Schildes exprimieren. Mit einer feuerpolierten Weidepipette werden die Wirtsembryonen in eine Reihe von Vertiefungen in der Zelltransplantationsschale überführt, die mit Pen/Strep EM gefüllt sind. Platzieren Sie dann die Spenderembryonen in der benachbarten Reihe.

Richten Sie dann mit einer Wimper die Embryonen vorsichtig mit dem Schild nach oben aus. Spülen Sie dann mit einem Nadelhalter, der an einer Spritze befestigt ist, die Spitze der Nadel aus, indem Sie 70 % Ethanol ein- und ausstoßen. Trocknen Sie die Nadel, indem Sie Luft in die Nadel ziehen.

Wenn die Nadel trocken ist, führen Sie sie mit der Fase nach oben in den Nadelhalter ein, der mit der Hamilton-Spritze verbunden ist. Um eine Schild-zu-Schutzschild-Transplantation durchzuführen, dringt man mit der Transplantationsnadel in das Schild des Spenderembryos ein und entnimmt etwa 10 bis 20 Zellen, die mit ABP140 mcherry markiert sind. Vermeiden Sie vorsichtig das Ziehen von Eigelb.

Transplantieren Sie die Zellen in den Schild des Wirtsembryos und wiederholen Sie den Zelltransfer, bis alle Wirtsembryonen transplantiert sind. Wenn die Transplantation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine feuerpolierte Weidepipette, um beschädigte Embryonen zu entfernen. Inkubieren Sie die transplantierten Embryonen etwa 30 Minuten lang bei 28 Grad Celsius, damit sie sich erholen können.

Um einzelne prächordale Platten-Vorläuferzellen nach der Dechorionierung von Embryonen zu transplantieren, verwenden Sie, wie bereits gezeigt, eine feuerpolierte Weidepipette, um drei Spenderembryonen in eine Zelltransplantationsschale zu übertragen, die mit kalziumfreien Pen/Strep-Ringern gefüllt ist. Mit einer feinen Pinzette für jeden Embryo wird ein Explantat mit den injizierten ABP140-mcherry-markierten Zellen präpariert und der Rest der Embryonen schnell verworfen. Rühren Sie die Explantate mit einer Wimper vorsichtig um, bis sich die Zellen dissoziieren.

Ziehen Sie dann eine einzelne, isolierte Zelle in die Transplantationsnadel und transplantieren Sie sie in den Schild eines Wirtsembryos, wie zuvor im Video gezeigt. Für eine optimale Kontrolle der Aspiration und Transplantation halten Sie den Luft-Wasser-Abstand etwa 20 Zentimeter vom Ende der Nadel entfernt. Um die Embryonen zu fixieren, füllen Sie ein Glasbodenfläschchen mit einem Millimeter heißer 0,2%iger Agarose in EM. Stellen Sie das Fläschchen bei 42 Grad Celsius in einen Wärmeblock.

Übertragen Sie einen ausgewählten Embryo in die Agaroselösung und verwerfen Sie das überschüssige Embryomedium aus der Pipette. Ziehen Sie dann den Embryo in die Pipette mit Agarose und geben Sie ihn zusammen mit einem Tropfen Agarose in eine zuvor vorbereitete Bildgebungskammer. Bevor die Agarose aushärtet, verwenden Sie eine Wimper, um den Embryo auszurichten, indem Sie die perspektivische prächordale Platte für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop nach oben oder für die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop auf den Glasboden legen.

Es gibt etwa 40 Sekunden, um den Embryo auszurichten, bevor das Agarosegel je nach Raumtemperatur aushärtet. Richten Sie den Embryo schnell aus, indem Sie das Blastoderm anstelle des Eigelbs manipulieren, das sehr zerbrechlich ist. Nachdem alle Embryonen eingehängt und die Agarose ausgehärtet ist, verwenden Sie einen Pen/Strep EM, um die Kammer zu füllen, um ein Austrocknen der Embryonen zu verhindern.

Führen Sie Live-Zell-Imaging- und Zelldynamik-Experimente gemäß dem Textprotokoll durch. Die in diesem Video demonstrierte Technik wurde verwendet, um die Rolle von Sin1, einer der Kernkomponenten des TOR-Komplexes zwei, bei der Kontrolle der in vivo-Zellmigration zu analysieren. Dieser Film zeigt die Migration von transplantierten prächordalen Plattenvorläuferzellen.

Die Aktinmarkierung ermöglicht die Visualisierung von aktinreichen zytoplasmatischen Vorsprüngen. Durch die Analyse der Häufigkeit und Orientierung wurde beobachtet, dass Wildtyp-Zellen häufig große zytoplasmatische Ausstülpungen produzieren, die in Richtung des tierischen Pols ausgerichtet sind, und der Migration. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, führt der Funktionsverlust von Sin1 zu einer drastischen Verringerung der Anzahl der Protrusionen und einer Randomisierung der verbleibenden Protrusionen, was die Bedeutung von Sin1 bei der Kontrolle der aktinreichen Protrusionsbildung zeigt.

Interessanterweise kann der Sin1-Phänotyp durch die Expression einer konstitutiv aktiven Form von Rac1 gerettet werden, was stark darauf hindeutet, dass TOR C2 die Aktindynamik und die Zellprotrusionsbildung durch Rac1 steuert. Diese Technik wurde auch verwendet, um die Rolle von Arpin, einem Inhibitor des ARP2/3-Komplexes, bei der Zellmigration zu analysieren. Wie hier gezeigt, führt der Funktionsverlust von Arpin zu einer Erhöhung der Protrusionshäufigkeit, entweder aufgrund einer häufigeren Protrusionsbildung oder einer Erhöhung der Protrusionsstabilität.

Die Messung der Lebensdauer der Protrusion in Abwesenheit von Arpin zeigte, dass sich die zeitliche Persistenz der Protrusionen verdoppelte, was auf eine Erhöhung der Stabilität hindeutet. Sobald die Transplantation von etwa 30 Embryonen in 45 Minuten durchgeführt werden kann. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Entwicklung der Embryonen im Auge zu behalten, da alle Schritte zeitlich abgestimmt sind.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die konfokale Lebendmikroskopie durchgeführt werden, um eine bessere Bildgebung zu ermöglichen und Fragen zur Subzellorganisation von zytoskotischen Elementen, Polaritätsmarkern, Additionsproteinen oder anderen Zellbestandteilen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Transplantate von prächordalen Plattenvorläufern verwenden können, um die Rolle eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.