Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend Plasmodium Sporozoiten

Das übergeordnete Ziel dieser Reihe von Verfahren ist es, Mäuse mit strahlenabgeschwächten Plasmodienparasiten zu immunisieren. Zur Erleichterung der Analyse der Rekrutierung myeloischer Zellen in der Haut der Maus und der Drainage von Lymphknoten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Malaria zu beantworten, z. B. welche zellulären Akteure an der angeborenen Immunantwort auf lebende, abgeschwächte Parasiten beteiligt sind.

Zwischen 18-25 Tagen nach der Infektion werden infizierte Mücken in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis bluten, sammeln und kalt betäubt. Drehen Sie dann das Röhrchen vorsichtig in eine Petrischale auf Eis um und setzen Sie die Insekten einer Dosis von 12 Kilorad Gamma- oder Röntgenstrahlung aus. Sammeln Sie die bestrahlten Speicheldrüsen der Mücke in 15 Mikrolitern DPBS auf Eis.

Zerdrücke dann vorsichtig die Drüsen, um die Sporozoiten freizusetzen. Die Injektion einer hochkonzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen ist von entscheidender Bedeutung, daher ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von gut infizierten Mücken zu gewinnen, was durch eine robuste Expression der grünen Fluoreszenz belegt wird. Die Parasitensuspension wird vor der Filtration durch ein 35-Mikrometer-Sieb, das an ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen angepasst ist, wieder suspendiert.

Zählen Sie mit Hilfe einer Zählkammer unter Verwendung eines Mikroskops die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten und stellen Sie die Parasitensuspension auf eine 8,3-fache Zehner- bis Viertelkonzentration von Sporozoiten pro Mikroliter in kaltem DPBS auf Eis ein. Vor der Injektion der Sporozoiten ist der richtige Sedierungsgrad des Versuchstieres durch Zusammenkneifen der Zehen zu bestätigen und Augensalbe aufzutragen, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Verwenden Sie dann schnell ein durchsichtiges Klebeband, um die ventrale Seite der Ohrmuschel vorsichtig unter einem Stereomikroskop zu fixieren, und laden Sie eine Zehn-Mikroliter-Spritze, die mit einer 35-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 0,6 Mikrolitern resuspendierten Parasiten.

Führen Sie dann die Nadel vorsichtig mit der abgeschrägten Seite nach oben unter die Epidermis auf der dorsalen Seite des Ohrs ein und injizieren Sie 0,15 Mikroliter Sporozoiten in die Stelle. An der Injektionsstelle ist eine charakteristische Papel zu beobachten. Nachdem Sie die Dermis noch dreimal injiziert haben, wie gerade gezeigt, entfernen Sie vorsichtig das Klebeband und überwachen Sie die Maus, bis sie vollständig wiederhergestellt ist.

Töten Sie die Maus zum gewünschten Zeitpunkt nach der Sporozoiten-Inokulation und beginnen Sie sofort mit dem Vorgang. Stellen Sie sicher, dass die Maus Anzeichen eines klinischen Todes zeigt. Desinfizieren Sie das Ohr und die entsprechende Halsregion mit 70 Prozent Ethanol.

Machen Sie anschließend mit einer sterilen Schere und Pinzette einen Schnitt in den jugulo-karotiden Bereich. Dehnen Sie dann den Schnitt mit zwei Pinzetten, um den grau aussehenden drainierenden Lymphknoten freizulegen. Kneifen und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe direkt über dem Lymphknoten und ziehen Sie es mit einer zweiten Pinzette heraus, die darunter platziert wird.

Übertragen Sie den Lymphknoten in ein 70-Mikron-Sieb in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte, die 4,5 Milliliter Standardmedium enthält, ergänzt mit Kollagenase und DNase. Entnehmen Sie als Nächstes das gesamte geimpfte Ohr und verwenden Sie zwei Pinzetten, um das Ohr in den dorsalen und ventralen Teil zu kneifen und zu trennen. Legen Sie dann jede Seite des Ohrs in eine Vertiefung mit einer zweiten Sechs-Well-Platte, die 4,5 Milliliter pro Vertiefung Medium enthält, das mit Verdauungsenzymen ergänzt ist, und achten Sie darauf, dass jedes Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht ist.

Um die Immunzellen aus den Lymphknoten zu isolieren, inkubiert man die Platte aus lymphatischem Gewebe bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 unter sanftem Rühren. Nach 15 Minuten zehn millimolare EDTA in jede Vertiefung geben und die Platte auf Eis legen. Verwenden Sie anschließend für jeden Lymphknoten das Ende eines neuen Fünf-Millimeter-Spritzenkolbens und drücken Sie den Lymphknoten mit kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, um das Gewebe zu dissoziieren.

Wenn nur noch weißes Bindegewebe übrig ist, spülen Sie das Sieb zweimal mit 500 Mikrolitern DPBS aus, das FBS und EDTA enthält, und geben Sie die Wäsche in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann die Mulde noch zwei weitere Male mit 500 Mikrolitern des zugesetzten DPBS und geben Sie die Wäsche in das auf Eis gestellte Röhrchen. Um die Immunzellen aus dem Ohr zu isolieren, inkubieren Sie die Ohrsegel bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 unter leichtem Rühren.

Schneiden Sie das Gewebe nach 20 Minuten in kleinere Stücke, um die Verdauung zu erleichtern, und geben Sie die Proben wieder in den Inkubator. Stoppen Sie nach 40 Minuten die Verdauung mit zehn Millimolar EDTA und stellen Sie die Platte auf Eis. Übertragen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze den gesamten Inhalt jeder Vertiefung in neue Vertiefungen mit 70-Mikron-Sieben.

Und verwenden Sie einen Fünf-Milliliter-Spritzenkolben, um die Ohrgewebefragmente mit kreisenden Bewegungen zu dissoziieren, wie gerade gezeigt. Wenn nur weißes Bindegewebe und Haare übrig sind, waschen Sie die Siebe und Vertiefungen wie gerade gezeigt mit DPBS plus FBS und EDTA und bündeln Sie die Waschungen in einer 50-Milliliter-Tube auf Eis. Zum Schluss waschen Sie die Mulde zweimal mit zugesetztem DPBS und geben Sie die Wäsche in das auf Eis gestellte Rohr.

In diesem Video ist die Migration von strahlenabgeschwächten Sporozoiten in die Maushaut 15 Minuten nach der intradermalen Injektion der Parasiten zu sehen. 24 Stunden nach der intradermalen Sporozoiten-Injektion werden die Gesamtzellen aus der Haut und dem drainierenden Lymphknoten isoliert. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, ist die Häufigkeit myeloischer Zellen in der Haut und im drainierenden Lymphknoten im Vergleich zu naiven Mäusen stark erhöht.

Sobald die ersten Schritte des Protokolls für die Bestrahlung von Mücken bis zur Sporozoiten-Injektion gemeistert sind, können sie in vier Stunden abgeschlossen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sporozoiten, die aus den Speicheldrüsen der Mücke isoliert werden, schnell ihre Infektiosität verlieren. Sie müssen also so schnell wie möglich injiziert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie myeloische Zellen aus der Haut der Maus und dem drainierenden Lymphknoten isoliert werden können, um die Immunantwort auf die intradermale Injektion von lebenden abgeschwächten Plasmodium-Parasiten zu untersuchen.