Name: Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend Plasmodium Sporozoiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung myeloischer Zellen aus Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten nach intradermaler Impfung mit attenuierten Plasmodium-Sporozoiten. Diese Methode ermöglicht die Analyse der angeborenen Immunantwort.

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Die Autoren danken Patricia Baldacci, Vanessa lagal und Sabine Thiberge für das kritische Lesen, Irina Dobrescu und Sabine Thiberge um Hilfe in Bildern und Pauline Formaglio für den Unterricht in - vivo - Bildgebung von Sporozoiten - Motilität in der Mäusehaut nehmen. Wir möchten auch Marek Szatanik und das Zentrum für Produktion und Infektion von Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) für Mückenzucht zu danken. Diese Studie wurde von der AXA Research Fund und Mittel aus dem Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Integrative Biologie der Emerging Infectious Diseases&quot; unterstützt (Förder-Nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).

<html> und durchgeführt in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften:; Alle Verfahren wurden vom Ausschuss des Pasteur-Institut und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (2012-0015 Vertragsnummer Ethikkommission IDF-Paris 1, Paris, Frankreich) genehmigt. 1. Materialien und Reagenzien <ol><li> Verwenden weiblichen Anopheles - Mücken stephensi (Sda500 Stamm) , die auf infizierten Mäusen ernähren 3-5 Tage nach dem Auflaufen und hinten wie zuvor 21 beschrieben. </li><li> Verwenden Parasiten Plasmodium berghei ANKA Klon mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Heat Shock Protein 70 (HSP70) Promotors. Dies ergibt helle Fluoreszenz während des gesamten Lebenszyklus Parasit 22. </li><li> Verwenden weibliche C57BL / 6JRj Mäuse (7 Wochen alt). HINWEIS: Alle Reagenzien in dem beschriebenen Protokoll verwendet werden , in der T aufgeführt Lage von Materialien / Ausrüstung. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-attenuierten Sporozoiten-Isolation von Mosquito Speicheldrüsen <ol><li> Zwischen 18-25 Tage nach dem infektiösen Blutmehl, sammeln und kalt betäuben Stechmücken in einen 15 - ml - Röhrchen auf Eis , wie zuvor 21 beschrieben. übertragen Sie sie vorsichtig auf eine Petrischale durch das Rohr zu invertieren. Pflegen Sie die Insekten auf Eis und entlarven die Mücken zu einer 12 krad Dosis von γ- oder Röntgenbestrahlung. </li><li> Isolieren abgeschwächten Sporozoiten aus bestrahlten Moskitospeicheldrüsen , wie zuvor beschrieben 21. Sammeln infizierten Speicheldrüsen in einem kleinen Volumen (etwa 15 ul) 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und sanft zerdrücken sie Sporozoiten freizusetzen. HINWEIS: Die Injektion einer stark konzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen kritisch, es ist daher wesentlich, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von einer hohen Anzahl von vorgewählten gut infizierten Mücken zu ernten, wie durch ihre robuste ExpressionGrün-Fluoreszenz. </li><li> Filtern Sie die Sporozoiten-Suspension durch eine 35 &amp; mgr; m Zellsieb Kappe angepasst auf eine niedrige Adhäsion 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu beseitigen, um Klumpen und Moskito Schutt. </li><li> Zählen Sie die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten wie zuvor 21 beschrieben und stellen Sie die Konzentration der Parasiten Suspension mit kaltem 1x DPBS 83.000 Sporozoiten / ul zu erhalten. Lagern Sie die Parasiten auf Eis, während die nächsten Schritte fort. </li><li> Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Speicheldrüsen von nicht infizierten Moskitos, die als Negativkontrolle verwendet werden und verarbeiten, um die Probe wie in den Schritten 2.2 und 2.3. Verdünne die Probe wie oben angegeben ähnliche Konzentration der Speicheldrüsenextrakten in der Suspension zu erhalten. HINWEIS: Sporozoiten können für maximal 2 Stunden auf Eis gelagert werden. Allerdings, im Idealfall sind sie innerhalb einer Stunde eingespritzt, nachdem die Speicheldrüsen zerdrücken. </li></ol> 3. Die Injektion von Sporozoiten in die Dermal Layer des Ohres <ol><li> Anästhesieren Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (50 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) -Mischung. Warten 5-8 min für die Maus in einen Zustand der Bewusstlosigkeit sein und gelten Augensalbe für die Augen kornealen Austrocknen zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch eine sanfte Zehe Prise an beiden hinteren Füße durchführen. HINWEIS: Die Dosis der Anästhesie dauert weniger als 20 Minuten, so dass die nächsten Schritte müssen schnell ausgeführt werden. </li><li> Stabilisieren Sie die Ohrmuschel der Maus durch die Bauchseite mit durchsichtigem Klebeband Befestigung zuvor unter einem Stereomikroskop (1A) angeordnet. Drücken Sie vorsichtig die Ohrschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine 10 ul Spritze / 35 Gauge abgeschrägte Nadel mit 0,6 ul resuspendiert Parasiten 10. </li><li> Liefern den Sporozoiten - Suspension in 4 Injektionsstellen (0,15 &amp; mgr; l pro Stelle) durch vorsichtiges die Nadel auf der Rückenseite des Ohres (1A) Einsetzen unter der Epidermis, mitdie Schräge nach oben, Pflege keine Blutgefäße zu vermeiden,. Erlauben die Nadel in der Dermis zu verbleiben einige sec Rückfluss des Injektats zu verhindern, bevor es entfernt wird. Beobachten einer Charakteristik papule an jeder Injektionsstelle am Ende des Verfahrens (1B und 1C). </li><li> Nach der Injektion entfernen Sie vorsichtig das Ohr vom Band. </li><li> Spritzen Sie das kontralaterale Ohr mit der gleichen Dosis von Parasiten durch die Schritte 3,2-3,4 folgen. </li><li> Injizieren Sie 2 zusätzliche Mäuse entweder mit 0,6 ul 1x DPBS oder 0,6 ul 1x DPBS + Speicheldrüsenextrakt von nicht infizierten Mücken, um die Entzündungsreaktion zu bewerten allein durch die Injektion vermittelt und die Ablagerung von Moskitomaterial in der Dermis. </li><li> Überwachen Sie die Maus aus der Narkose, bevor es wieder in den Käfig legen. HINWEIS: Die richtige Sporozoiten - Ablagerung in der Haut kann durch Fluoreszenzmikroskopie (2A und 2B überwacht werden), Wobei die Maus previsously 23 beschrieben , hergestellt. </li></ol> 4. Haut und ableitenden Lymphknoten Dissektion <ol><li> Bereiten Standardmedium (SM), wie folgt: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), ergänzt mit 400 U / ml Kollagenase und 50 ug / ml Deoxyribonuclease (DNase) . </li><li> Bereiten Sie zwei 6-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten auf Eis mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb pro Vertiefung für dLN Proben (Tafel A) und 4,5 ml SM pro Vertiefung für Hautproben (Tafel B). </li><li> Zum gewünschten Zeitpunkt folgende Sporozoiten Inokulation betäuben tief mit der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg) / Xylazin (12,5 mg / kg) Mischung vor Zervikaldislokation. Stellen Sie sicher, dass die Maus Zeichen der klinischen Tod demonstriert und die Präparation sofort beginnen. HINWEIS: Die Kinetik der myeloiden Zellrekrutierung können zu verschiedenen Zeiten nach inj sucht werdenection (dh 2 Stunden, 4 Stunden und 24 Stunden , wie zuvor 14 beschrieben). </li><li> Desinfizieren des beimpften Ohr und den entsprechenden Halsbereich mit 70% Ethanol, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren. </li><li> Mit einer sterilen Schere und Pinzette, sezieren aseptisch das proximale Ohrmuschel dLN ohne das umgebende Fett zu sammeln. Führen Sie einen ersten Einschnitt in der jugulo-carotidian Sulcus und entfernen Sie die Haare aus dem Operationsfeld. Dehnen Sie den Schnitt mit 2 Zange die dLN auszusetzen, die im Vergleich zu dem umgebenden Gewebe gräulich erscheint. </li><li> Pinch das Bindegewebe vorsichtig auf der Oberseite des dLN mit einer Pinzette ihre Entfernung zu erleichtern. Extrahieren Sie die dLN durch eine Zange unterhalb des lymphatischen Gewebes platzieren (3A und 3B). Legen Sie die dLN in einer Vertiefung mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb (Tafel A). </li><li> Ernten Sie die gesamte beimpft Ohr mit einer sterilen scharfen Schere und Pinzette (4A). separaßen die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres durch Kneifen und Beabstanden den Schnitt mit zwei Zangenenden (4B - 4E). Legen Sie sie in einen Brunnen, die 4,5 ml SM (Tafel B) dafür, dass beide Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht. HINWEIS: Um die Zuverlässigkeit des Experiments zu verbessern und die Anzahl der Zellen von Interesse zu erhöhen, Pool 2 injiziert Ohren oder 2 DLNs aus der gleichen Maus pro Probe. </li><li> Ernte und Prozess parallel die Ohren und DLNs der Mäuse geimpft mit entweder 1x DPBS oder Speicheldrüsenextrakten. Fügen Sie zwei zusätzliche Ohr und Lymphknoten von einer naiven Maus geerntet Proben für negative und Einzelfärbung Kompensationssteuerungen. </li></ol> 5. Zellisolierung aus Lymphknoten <ol><li> Inkubieren der Lymphknoten (Tafel A) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 15 min unter leichtem Schütteln. Zugabe von 10 mM final Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Vertiefung zu neutralisieren Kollagenase und DNase activitäten. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Dissoziieren Lymphknoten das obere Ende eines 5 ml Spritzenkolben verwendet. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie das Zellsieb zweimal mit 500 &amp; mgr; l 1x DPBS + 2% fötales Rinderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Übertragen gesamte Volumen der gut in einem 15-ml-Tube. </li><li> Spülen Sie die gut zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 15-ml-Tube. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol> 6. Zellisolierung aus Haut des Ohres <ol><li> Inkubieren der Ohr Blättchen (Tafel B) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. HINWEIS: Nach 20 Minuten Inkubation, schneiden Sie die Ohr Faltblätter mit einer Schere in kleine Stücke Gewebe Verdauung und legte die Probe zurück in den Inkubator für die restlichen 40 min zu erleichtern. Einzelne Zellen können in dem Medium am Ende der Inkubationszeit beobachtet werden. </li><li> In 10 mM final<html> EDTA pro Vertiefung Kollagenase und DNase Aktivitäten zu neutralisieren. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie die Ohrgewebefragmente und das gesamte Volumen des Mediums in ein neues und ein 70 &amp; mgr; m Zelle Sieb mit einer 1 ml Pipette enthält. Schneiden Sie 2 bis 3 mm vom Ende der Spitze der Ohrgewebefragmente leichter zu sammeln. </li><li> Ohrgewebefragmente mit dem oberen Ende eines 5 ml Spritzenkolben dissoziieren. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie die Zelle strainers zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Übertragen, das gesamte Volumen der Vertiefung in eine 50 ml-Röhre durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> Spülen Sie die gut mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 50-ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen auf Eis. HINWEIS: Die verschiedenen Schritte gesamten Zellen aus der Haut und dLN Geweben in Figur 5 zusammengefaßt sind , zu isolieren. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Graf und Viability von gesammelten Zellen <ol><li> Zentrifugieren Sie die Haut und dLN Proben für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Sammeln ein kleines Volumen jeder Probe die Gesamtanzahl von Zellen aus der Haut und dLN unter Verwendung eines Hämozytometers getrennt zu zählen. In 0,04% Trypanblau die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. </li></ol> 8. Die Blockierung der Non Antigen-spezifische Bindung <ol><li> Werden 10 &amp; mgr; g / ml unmarkiertes CD16 / CD32 Fc-block-Antikörper. Inkubiere 20 Minuten bei 4 ° C (kann länger gehen). </li><li> 2 ml kaltem DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und halten Sie die Proben auf Eis. </li></ol> 9. Die Färbung der Haut und des Lymph Node myeloischen Zellen <ol><li> Inkubieren zuvor blockierten Skin und dLN isolierten Zellen mit Live / Dead tracker (dh 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI), anti-CD45 und anti-CD11b spezifischen Antikörper. Hinweise: Damit können die myeloischer Zell - Subpopulationen von Interesse, vor allem seltene, CD45 + Zellen und Lymphozyten bzw. von der Haut oder von der dLN von magnetischen Kügelchen erleichternde Zellsortierung verarmt gereinigt werden , um zu bereichern. Da die meisten der von der dLN isolierten Zellen sind CD45 +, die Verwendung von anti-CD45 ist nicht zwingend. Andere Marker können myeloischer Zell-Subpopulationen von Interesse zu identifizieren durch positive oder negative Anschnitts Strategie einbezogen werden. In diesem Protokoll werden die myeloische in der dLN rekrutierten Zellen durch den Ausschluss CD8a + Zellen angereichert wurden (die gesamte T - Zell - Fach unter Verwendung von Anti-CD3 - spezifischen Antikörper gezielt werden kann). </li><li> Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. In 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, Zentrifuge die Probe 5 min bei 450 × g bei 4 ° C und entsorgen Sie die Supernatant. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. </li><li> Resuspendieren der Proben mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Übertragen Sie das gesamte Volumen in einem FACS-Röhrchen durch ein 35 &amp; mgr; m Zelle Sieb. Spülen Sie den Filter mit 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor leben Einzelzellen (DAPI -, FSC-W) abgestorbenen Zellen und Dubletten auszuschließen. Plot CD45 + CD11b + Ereignisse für die Haut (6A) und (CD45 +) CD8a - CD11b + Veranstaltungen für die dLN (6B). </li></ol>

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<li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li>
<li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In der Perspektive von großen Impfung von Menschen eine ganze Sporozoiten - Impfstoff gegen Malaria verwendet, einer der wichtigsten Herausforderungen zu überwinden , ist es , optimierte Routen und Methoden der Parasit Verabreichung entwickeln erfolgreiche Immunisierung und Schutz 24,25 zu gewährleisten. Beim Menschen hat die Bewertung der Schutzwirkung vermittelt durch lebende , abgeschwächte Parasiten (LAP) nach Natur Mücke durchgeführt worden beißt 2 sowie intradermale, subkutane 25,26</sup...

Malaria ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten der Welt, mehr als eine halbe Million Menschen pro Jahr töten. Infektionen durch Plasmodium, dem Erreger der Krankheit beginnt mit einem vorge erythrozytären (PE) -Phase. Während dieser Phase in die Wirts Haut von einer Mücke weiblichen Anopheles injiziert Sporozoiten erreichen die Leber über die Blutbahn und im Inneren Hepatozyten in die Parasitenformen unterscheiden , die roten Blutkörperchen infizieren und bewirken , dass die Symptome der Krankheit. Die PE - Stadien von Plasmodium stellen eine privilegierte Ziel für Anti-Malaria - Impfung. Tatsächlich abgeschwächten Lebendimpfstoffe gegen diesen Phasen, wie Strahlung abgeschwächt Sporozoiten (RAS), genetisch verhaftet Parasiten (GAP) oder Chemoprophylaxe und Sporozoiten (CPS) haben ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt 1-9 sowohl Nagetier und menschlichen Wirten zu schützen. Im Nagetiermodell sind die meisten Impfung Studien intravenöse Immunisierung unter Verwendung von, Das ist der Goldstandard in Bezug auf die Schutzwirkung. Allerdings hat die Beschreibung einer Haut Stufe und die Bedeutung der Haut-assoziierten Lymphknoten (dLN) bei der Auslösung Schutz unserer Wahrnehmung der PE-Phase geändert und betonte die Bedeutung der intradermale Route der Injektion. Intravital Bildgebung von P. berghei - Sporozoiten in die Haut von Nagetieren injiziert hat gezeigt , dass nur ~ 25% des Inokulums über die Blutbahn in die Leber gelangt. Die verbleibende ~ 75% verteilt sich zwischen dem proximalen dLN (~ 15%) und der Haut (~ 50%) 10,11, wo ein kleiner Anteil verwandeln und am Leben bleiben über Wochen Innenhautzellen 12,13. Außerdem beschrieben nachfolgende Studien , dass die Schaffung von wirksamen Schutzimmunität nach intradermale Immunisierung vor allem in der Haut-dLN nimmt, wo Parasiten spezifischen CD8 + T - Zellen aktiviert werden, und nur geringfügig in der Milz oder Leber-DLNs 14,15. Währenddie meisten Studien haben sich auf die Charakterisierung der Effektor-Zellen in der Einrichtung protektive Immunantwort beteiligt konzentriert, noch viel weniger wird über das Schicksal von lebenden attenuierten Parasiten in die Haut injiziert bekannt, insbesondere ihre Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Insbesondere Charakterisierung von Antigen-präsentierenden in Parasit - Antigen - Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation für CD8 + T - Zellen beteiligten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, zu wissen , dass Akquisitions PE Antigen sowohl in der Haut und dLN Kompartimente auftreten können. Zurück intravital Bildgebungsstudien beschrieben einen frühen Zustrom von hell fluoreszierende Lys-GFP - positiven Zellen in der Haut nach einem infektiösen Mückenstich 16 , während frühe Interaktionen zwischen Sporozoiten und dendritischen Zellen wurden in der dLN 10,17 beobachtet. In jüngerer Zeit hat es sich durch Mücken in der Haut inokuliert Sporozoiten erhöht die Beweglichkeit der beiden dendritischen und regulatorische T-Zellen in der Haut berichtet, dassMäuse, während eine Abnahme Anzahl von Antigen - präsentierenden Zellen in der dLN 18 beobachtet. Wir sollen , zu identifizieren und genauer die Leukozytenuntergruppen rekrutiert in der Haut und entsprechenden dLN sowie diejenigen mit dem Parasiten zu quantifizieren 19 folgende intradermale Injektion von immunisierenden Dosen von RAS zu interagieren. In diesem Zusammenhang isolierten wir myeloiden Zellen (CD45 + CD11b +) von beiden Geweben und gekennzeichnet Subpopulationen von Interesse durch Mehr = parametrischer Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit der Immunantwort in der frühen Phase der Haupt Leishmania beschrieben Infektion der Haut 20, die primäre Wirtsantwort Injektion Sporozoiten besteht aus einer aufeinanderfolgenden Einstellung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , gefolgt von inflammatorischen Monozyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) , die auf der Basis von differenti identifiziertal Expression der Ly6G und Ly6C Oberflächenmarker. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die myeloischen Zellen aus der Haut von Mäusen zu isolieren und dLN folgende intradermale Injektion von infizierten Mücke Speicheldrüsen extrahiert Dosen von RAS immunisieren. Reproduzierbare intradermale Injektionen und Gewebeverarbeitung sind wichtige Schritte phänotypischen Veränderungen infiltrieren Zellpopulation innerhalb infizierten Geweben zu quantifizieren. Der Ansatz detailliert unten stellt einen zuverlässigen Assay die Haut und dLN entzündliche Reaktion auf Plasmodium Parasiten zu bewerten und kann auf verschiedene experimentelle Systeme erweitert werden.

<table><tbody><tr><td>Ketamin: Imalgen&reg; 1.000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg/kg: vorherige Sporozoit-Injektion

125 mg/kg: vorherige Opferung</td></tr><tr><td>Xylazin: Rompun&reg 2%</td><td>Bayer-5</td><td></td> <td>mg/kg: vorherige Sporozoit-Injektion

12,5 mg/kg: vorheriger Verzicht</td></tr><tr><td>NanoFil-Spritze + 35-Gauge-Nadel</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&reg; 50 Insulinspritze 0,5 ml/50 I.E.</td><td>B. Braun Medical&nbsp;</td><td></td><td></td>9151125-MultiwellTM</tr> <tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte &ndash; Flacher Boden</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>und Mikro; M-Zell-Sieb&nbsp;</td><td>BD Falke&nbsp;</td><td>352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml Spritze</td><td>Terumo</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml Konisches Röhrchen aus Polypropylen</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml Konisches Röhrchen aus Polypropylen</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352098-5</td></tr> <tr><td>ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 35 &; Mikro; m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352235-DPBS</tr> <tr><td>1x CaCl2- und MgCl2--frei</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021-Kollagenase</td><td></td></tr> <tr><td>aus Clostridium histolyticum, Typ IV 0,5-5,0 FALGPA Einheiten/mg Feststoff</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse, Typ IV&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM oder 2,5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>Pufferlösung (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Verdünnung 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16/CD32 (2.4G2-Klon)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &micro; g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM Qualität</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 & micro; g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 (30-F11-Klon)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD11b (M1/70-Klon)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD8&alpha; (5H10 Klon)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp; Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Weibliche C57BL/6JRj Mäuse (7 Wochen alt) &nbsp;</td><td>Janvier Laboratorien</td> <td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloischen zellisolierung von mäusehaut und ableitenden lymphknoten nach intradermale impfung mit attenuierten lebend<em&gt; plasmodium</em&gt; sporozoiten

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria - Infektion beginnt , wenn die Sporozoiten - Stadium von Plasmodium in die Haut eines Säugerwirt durch einen Mückenstich beimpft. Der hoch motile Parasit nicht erreicht nur die Leber Hepatozyten einzudringen und in Erythrozyten-infektiöse Form verwandeln. Es wandert auch in die Haut und zum proximalen Lymphknoten die Injektionsstelle Entwässern, wo sie von resident und / oder rekrutiert myeloischen Zellen erkannt und abgebaut werden können. Intravital Imaging berichtet die frühe Rekrutierung von hell fluoreszierende Lys-GFP positiven Leukozyten in der Haut und den Wechselwirkungen zwischen Sporozoiten und CD11c + Zellen im Lymphknoten. Wir präsentieren hier ein effizientes Verfahren zu erholen, zu identifizieren und die myeloischen Zelluntergruppen aufzuzählen, die auf die Haut von Mäusen angeworben werden und ableitenden Lymphknoten folgende intradermale Injektion von Dosen von Sporozoiten in einem Mausmodell immunisieren. Phänotypischen Charakterisierung mittels Multi-parametrischer Durchflusszytometrie bietetein zuverlässiger Assay frühen dynamischen zellulären Veränderungen bei entzündlichen Reaktion auf Plasmodium - Infektion zu bewerten.

Wir haben kürzlich gezeigt , dass die Nadel-Spritze Injektion von immunisierenden Dosen von P. berghei Sporozoiten in die Haut von Mäusen eine sukzessive Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten , gefolgt von inflammatorischen Monozyten in der Haut und dLN 19 induziert. Das Protokoll Abschnitt oben beschriebenen Verfahrensdetails verwendet , um erfolgreich Live - myeloischen Zellen aus beiden Geweben nach mehrfachen Injektionen von großen Anzahl von Sporozoiten in d...

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahrensreihe besteht darin, Mäuse mit strahleninaktivierten Plasmodium-Parasiten zu immunisieren, um die Analyse der Rekrutierung myeloischer Zellen in der Maushaut und den drainierenden Lymphknoten zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Malaria-Forschungsbereich zu beantworten, beispielsweise, welche zellulären Akteure an der angeborenen Immunantwort auf lebende, abgeschwächte Parasiten beteiligt sind.Zwischen 18 und 25 Tagen nach der infektiösen Blutmahlzeit infizierte Mücken in einem 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis sammeln und kalt betäuben. Anschließend das Röhrchen vorsichtig über eine auf Eis liegende Petrischale umdrehen und die Insekten einer Dosis von 12 Kilorad Gamma- oder Röntgenstrahlung aussetzen. Die bestrahlten Speicheldrüsen der Mücken in 15 Mikroliter DPBS auf Eis sammeln.Drücken Sie dann vorsichtig die Drüsen, um die Sporozoiten freizusetzen. Die Injektion einer hochkonzentrierten Parasitensuspension in kleinem Volumen ist entscheidend, weshalb es wichtig ist, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von stark infizierten Mücken zu gewinnen, was durch einen starken grünen Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird. Resuspendieren Sie die Parasitensuspension vor der Filtration durch einen 35-Mikrometer-Filter, der an einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen angebracht ist.Unter Verwendung einer mikroskopischen Zählkammer die Gesamtanzahl der isolierten Sporozoiten zählen und die Parasitensuspension auf eine Konzentration von 8,3 × 10⁴ Sporozoiten pro Mikroliter in kaltem DPBS auf Eis einstellen. Vor der Injektion der Sporozoiten die angemessene Sedierungstiefe des Versuchstieres durch Zehenquetschung überprüfen und Augensalbe auftragen, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern. Anschließend das Ohrmuschelventral unter dem Stereomikroskop vorsichtig mit durchsichtigem Klebeband fixieren und schnell eine 10-µL-Spritze, die mit einer Nadel der Größe 35 Gauge ausgestattet ist, mit 0,6 µL der resuspendierten Parasiten beladen.Als Nächstes setzen Sie die Nadel vorsichtig, mit der Schr&auml;gkante nach oben, unter die Epidermis auf der dorsalen Seite des Ohrs und injizieren 0,15&nbsp;Mikroliter Sporozoiten an die Stelle. An der Injektionsstelle wird ein charakteristisches Papel beobachtet. Nach drei weiteren, wie eben demonstrierten, Injektionen in die Dermis entfernen Sie vorsichtig das Pflaster und &uuml;berwachen die Maus, bis sie sich vollst&auml;ndig erholt hat.Zum gewünschten Zeitpunkt nach der Sporozoit-Inokulation das Tier opfern und das Verfahren unverzüglich beginnen. Sicherstellen, dass das Tier Anzeichen klinischen Todes zeigt. Ohr und entsprechenden Nackenbereich mit 70 Prozent Ethanol desinfizieren.Als Nächstes mit sterilen Scheren und Pinzetten einen Schnitt im jugulo-carotischen Bereich durchführen. Dann den Schnitt mit zwei Pinzetten auseinanderziehen, um den graulich erscheinenden entwässernden Lymphknoten freizulegen. Vorsichtig das Bindegewebe direkt oberhalb des Lymphknotens anfassen und entfernen und den Lymphknoten mit einem zweiten Paar Pinzetten, das sich darunter befindet, herausnehmen.Überführen Sie den Lymphknoten in einen 70-Mikron-Filter in einer Vertiefung einer sechswelligen Zellkulturplatte, die 4,5 Milliliter Standardmedium enthält, ergänzt mit Kollagenase und DNase. Danach entnehmen Sie das gesamte inoculierte Ohr und verwenden zwei Pinzetten, um das Ohr durch Zupinnen in die dorsale und ventrale Seite zu trennen. Anschließend legen Sie jede Seite des Ohres in eine Vertiefung einer zweiten sechswelligen Platte, die pro Vertiefung 4,5 Milliliter Medium mit Verdauungsenzymen enthält, wobei darauf zu achten ist, dass das Gewebe vollständig im Medium eingetaucht ist.Um die Immunzellen aus den Lymphknoten zu isolieren, inkubieren Sie die Platte mit lymphoidem Gewebe bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 unter sanfter Agitation. Nach 15 Minuten fügen Sie zehn Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzu und stellen die Platte auf Eis. Danach verwenden Sie für jeden Lymphknoten das Ende eines neuen fünf-Millimeter-Spritzenstößels und drücken den Lymphknoten mit kreisförmigen Bewegungen gegen das Sieb, um das Gewebe zu dissoziieren.Wenn nur noch weißes Bindegewebe übrig ist, spülen Sie das Sieb zwei Mal mit jeweils 500 Mikrolitern DPBS, das FBS und EDTA enthält, aus und überführen Sie die Waschflüssigkeit in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Anschließend waschen Sie die Vertiefung zwei weitere Male mit jeweils 500 Mikrolitern des supplementierten DPBS und überführen die Waschflüssigkeit in das auf Eis stehende Gefäß. Um die Immunzellen aus dem Ohr zu isolieren, inkubieren Sie die Ohrblättchen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 unter leichtem Schütteln.Nach 20 Minuten schneiden Sie das Gewebe in kleinere Stücke, um die Verdauung zu erleichtern, und geben Sie die Proben zurück in den Inkubator. Nach 40 Minuten beenden Sie die Verdauung mit zehn Millimolar EDTA und stellen Sie die Platte auf Eis. Überführen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette mit abgeschnetter Spitze den gesamten Inhalt jedes Wells in neue Wells, die 70-Mikron-Siebe enthalten.Und verwenden Sie den Kolben einer 5-Milliliter-Spritze, um die Ohr-Gewebefragmente mit kreisförmigen Bewegungen wie gerade demonstriert zu dissoziieren. Wenn nur noch weißes Bindegewebe und Haare übrig sind, waschen Sie die Siebe und Vertiefungen wie gerade gezeigt mit DPBS plus FBS und EDTA und sammeln die Waschflüssigkeiten in einem 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Schließlich waschen Sie die Vertiefung zweimal mit supplementiertem DPBS und überführen die Waschflüssigkeit in das auf Eis stehende Röhrchen.In diesem Video ist die Migration strahleninaktivierter Sporozoiten in die Maushaut 15 Minuten nach intradermaler Injektion der Parasiten zu sehen. 24 Stunden nach intradermaler Injektion von Sporozoiten werden Gesamtzellen aus der Haut und dem drainierenden Lymphknoten isoliert. Wie in dieser Abbildung zu sehen, ist die Häufigkeit myeloischer Zellen in der Haut und im drainierenden Lymphknoten im Vergleich zu naiven Mäusen deutlich erhöht.Wenn die ersten Schritte des Protokolls zur Bestrahlung von Mücken bis zur Sporozoiteninjektion einmal beherrscht sind, können sie innerhalb von vier Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Sporozoiten, die aus den Speicheldrüsen der Mücken isoliert wurden, schnell ihre Infektiosität verlieren. Daher müssen sie so schnell wie möglich injiziert werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man myeloide Zellen aus der Maushaut und dem drainierenden Lymphknoten isoliert, um die Immunantwort auf eine intradermale Injektion lebend abgeschwächter Plasmodium-Parasiten zu untersuchen.

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Bestimmte Maus-Stämme sind in der Lage, die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Myelin basisches Protein zu widerstehen. Hier beschriebene ist ein einfaches Protokoll, das die Immunisierung Teilnahmslosigkeit umkehrt und induziert paralytischen Erkrankung in mehreren typischen EAE resistent Maus Flecken.

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung der dendritischen Zellmigration nach einer Balleninfektion mit Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG bei Mäusen. Bei einer bakteriellen Infektion werden aktivierte DC-Zellen der Haut mit einem zellpermeablen Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff markiert. Nach einem geeigneten Intervall für die DC-Migration in den kehlkehlchendrainierenden Lymphknoten werden die Knotenzellen isoliert und einer Immunfärbung auf...

Ein CFSE-basierter Assay zur Überwachung der Migration dendritischer Zellen der Haut zu drainierenden Lymphknoten bei infizierten Mäusen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Immunisierung eines Mausmodells mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten. Die strahlengedämpften  Plasmodium-Sporozoiten werden in die dorsale Seite des Ohrs der Maus injiziert. Nach Injektionen an mehreren Stellen auf beiden Ohren kann sich die Maus erholen.

Intradermale Immunisierung mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten in einem Mausmodell

Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden.

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Die Haut beherbergt ein komplexes Immunzellnetzwerk. Wir beschreiben eine effiziente Methodik für die Verdauung von Maushaut aus verschiedenen Körperteilen des Tieres, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und die verschiedenen Leukozytenpopulationen, die in der Haut leben, mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren.  Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Ein Assay an Mäusen zur Verfolgung der Zellmigration von der Haut zum drainierenden Lymphknoten wird beschrieben, der die Charakterisierung von dendritischen Zellen der Haut ermöglicht, die nach einer Balleninfektion mit Bacille Calmette-Guérin zum Lymphknoten mobilisiert wurden.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Erfahren Sie die Isolierung myeloischer Zellen aus Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten nach intradermaler Impfung mit attenuierten Plasmodium-Sporozoiten. Diese Methode ermöglicht die Analyse der angeborenen Immunantwort.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend Plasmodium Sporozoiten (Video) | JoVE Journal

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend

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