Name: Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs Xenopus Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Methode der gezielten Mikroinjektion in Blastomeren zur Untersuchung der Nierenentwicklung bei Xenopus laevis. Diese Technik maximiert die Reagenzienzufuhr und liefert wertvolle Einblicke in die Genfunktion während der Organogenese.

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Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health NIDDK Zuschuss (K01DK092320) und Anschubfinanzierung von der Abteilung für Pädiatrie an der University of Texas Medical School McGovern unterstützt.

(: HSC-AWC-13-135-Protokoll #) Das folgende Protokoll wurde von der University of Texas Health Science Center in Houston Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, das dient als Institutional Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Identifizierung und Auswahl von Blastomeren für Injektionszwecke Nieren-bezogenen <ol><li> Vor der Embryonen zu erzeugen, verwenden Sie die normale Tabelle der Xenopus - Entwicklung 21 , um die Ausrichtung der ersten Zellteilungen im Embryo zu verstehen. Alternativ Zugriffsdiagramme der frühen Entwicklungsstadien von Xenopus auf Xenbase 11. </li><li> Zugriff auf die interaktive Xenopus Zellschicksal Karten auf Xenbase 11 zu wählen , welche Blastomere für Mikroinjektionsausgerichtet sein. </li><li> Beachten Sie, dass die einzelne Zelle Embryo eine dunkel pigmentierte Tier Pol und einen vegetativen Pol, der weiß und yolky ist. Beachten Sie, dass eine Schutzmembran, wie die Dotter e bekanntnvelope, deckt den Embryo. </li><li> Beachten Sie, dass die erste Spaltungs typischerweise zwischen den linken und rechten Seite des Embryos erfolgt. Diese Zellen tragen gleichermaßen zur pronephric Linie. </li><li> Man beachte, dass die zweite Spaltungs die dorsale und ventrale Hälften des Embryos aufteilt, mit einem 4-Zellen-Embryo führt. Die dorsale Zellen sind kleiner und haben weniger Pigment als die ventralen Zellen (2A und 3A). <ol><li> Identifizieren der ventralen Blastomeren (V, die große, dunkle Zellen) auf der linken und rechten Seite, die mehr auf die Entwicklung von Nieren als der dorsal beitragen (D; kleine, leichte Zellen) Blastomeren (2A). </li><li> Wenn in ein 4-Zellen - Embryo eingespritzt wird , injizieren die linke ventrale Blastomere der linken Niere (3A und Abschnitt 3) zu richten. </li></ol></li><li> Die dritte Spaltungs halbiert den animalen und vegetativen Seiten, was zu einer Acht-Zellen-Embryos. An diesem Punkt gibt es vier Tier Blastomeren [linke und rechte ventrale(V1) und dorsal (D1)] und vier vegetabile Blastomeren [linke und rechte ventrale (V2) und dorsal (D2)] (2B und 3B). <ol><li> Suchen Sie die ventralen, pflanzliche Blastomeren (V2). Diese Blastomeren tragen mehr zur Entwicklung von Nieren alle anderen Zellen in dieser Phase (2B). Um die linke Niere eines 8-Zellen - Embryo Ziel, spritzen in die linke V2 Blastomere (3B und Abschnitt 3). </li></ol></li><li> Beachten Sie, dass die vierte und fünfte cleavages die tierischen und pflanzlichen Blastomeren bisect. Zwei Nachkommen werden von jedem Blastomere erzeugt, was zu einer 16-Zellen-Embryo. Die Zellen werden nach ihrem Vorgänger benannt. Beispielsweise gibt der V2 Blastomere von der 8-Zellen - Stadium zur V2.1 und V2.2 Nachkommen im 16-Zell - Stadium (Abbildung 2C). Die Zelle V2.2 an der 16-Zell-Stadium stellt die Mehrheit der beitragenden Zellen zu der Entwicklungs Niere. </li><li> Die dargestellten sechsten und siebten cleavages resultieren in einem 32-Zellen-embryO. Auch hier sind zwei Nachkommen aus jeder Blastomere erzeugt, die im Anschluss an ihre Vorgänger benannt sind. Zum Beispiel gibt der Blastomere V2.2 aus dem 16-Zellen-Stadium zur V2.2.1 und V2.2.2 im 32-Zell-Stadium. Es gibt eine Alternative Benennungssystem im 32-Zell-Stadium, in dem Zellen in vier Reihen als A, B bezeichnet sind, C und D (von Tier zu vegetabile) und in vier Spalten 1, 2, 3, und 4 ( von dorsal nach ventral). Somit ist die V2.2.2 Blastomere, die am meisten zu den Entwicklungs pronephros trägt, wird C3 unter dieser alternativen Benennungssystem (2D) genannt. </li></ol> 2. Herstellung von Embryonen <ol><li> Vorbereitung 50 ml Dejelly Lösung (2% Cystein, NaOH auf pH 8,0). </li><li> Isolieren Sie beide Hoden von einem einzigen männlichen Frosch nach Standardprotokollen 14. Legen Sie die Hoden in einer 60 mm Petrischale gefüllt mit 10 ml Testes - Storage - Lösung (1x Marc-modifiziertem Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% Rinderserumalbumin, 50 ug / ml Gentamycin). Lagern Sie die Hoden bei 4 ° C. Hinweis: Testes kann für etwa 7 gespeichert werden - 10 Tage bei 4 ° C, aber Befruchtungseffizienz abnimmt, je länger die Hoden gespeichert wurden. </li><li> Drücken Sie einen weiblichen Froscheier zu erhalten , nach Standardprotokollen 14. Sammeln Sie die Eier in einer 100 mm Petrischale. Gießen Sie überschüssiges Wasser ab. </li><li> Schneiden Sie ¼ eines Hodens aus, während es in Testes-Storage-Lösung ist Zange und mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie das Stück Hoden in die Petrischale mit Eiern. Passen Sie die Größe des Abschnitts Hodens zu Konto für die Größe des Hodens verwendet, wie lange der Hoden gespeichert ist, und wie viele Eier sind befruchtet werden. Im Allgemeinen verwenden ¼ bis 1/3 eines frisch seziert Hoden ein Gelege zu befruchten. </li><li> Schneiden Sie den Hoden Teil in kleine Stücke mit einer Pinzette und eine Rasierklinge. Fügen Sie genug 0.3x MMR+ 30 mg / ml Gentamycin in die Petrischale um die Eier zu bedecken. Schwenken Sie die MMR in der Schale zu mischen. </li><li> Warten Sie ca. 30 Minuten für die Befruchtung bei Raumtemperatur zu nehmen. Beachten Sie, dass das Tier Hemisphäre (die pigmentierte Seite des Embryos) auf der Oberseite des Embryos auf wirksame Befruchtung sitzen. Entfernen Sie dann die MMR aus der Petrischale eine Transferpipette. Fügen Sie genug Dejelly Lösung in die Schale, die Embryonen zu decken. </li><li> In den nächsten paar Minuten, vorsichtig schwenken die intermittierend Gericht. Heftigem Schütteln der Schale zu diesem Zeitpunkt kann Achse Defekte verursachen. &#160; Die Gallerthülle auf den Embryonen wird sich auflösen, und die Embryonen werden während wirbeln in der Mitte der Schale versammeln. Sobald die Embryonen eng einander in der Mitte der Schale zu berühren, entfernen Sie die Dejelly Lösung mit einer Transferpipette. Lassen Sie keine Embryonen in der Dejelly Lösung für länger als 5 Minuten, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt. </li><li> Waschen Sie die dejellied Embryonen 3-5 mal in 0.3xMMR + 30 mg / ml Gentamycin durch vorsichtiges Gießen oder Abpipettieren des MMR und die Schale mit neuen MMR füllen. Nicht alle der MMR von der Schale zu entfernen, oder die Embryonen möglicherweise beschädigt. </li><li> Entfernen Sie alle unbefruchteten Eiern oder Stücke von Hoden aus der Petrischale eine Transferpipette. </li><li> Inkubieren Embryonen zwischen 14 und 22 ° C. Hinweis: Die Embryonen bei niedrigeren Temperaturen gewachsen entwickeln langsamer als Embryonen bei höheren Temperaturen gewachsen. Zeitpunkt der Entwicklungsstadien auf Xenbase 22 zu finden. <ol><li> Um Platz aus ihrer Entwicklung, Platz Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in einer Petrischale gehalten bei 14 ° C, und die andere Hälfte der Embryonen in einer Petrischale gehalten bei 18 ° C. Dies ermöglicht zwei Sätze von Injektionen in 4-Zellen-oder 8-Zellen-Embryos aus einer einzigen Befruchtung. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Injektionslösungen und Mikroinjektion von Embry <ol><li> Bereiten Sie die Injektionslösung, die 0,01ng / nl membrangebundenen rot fluoreszierendes Protein (MEM-RFP) mRNA 9 , während sich die Embryonen im 4-Zellen - oder 8-Zell - Stadium entwickeln. Lagern Sie die Injektionslösung auf Eis, bis die Injektion bereit. </li><li> Legen Sie eine 7 &quot;Ersatz Glaskapillarrohrs in eine Nadel Abzieher, mit der Spitze des Ersatzröhre mit der Spitze der Nadel Abzieher Fall ausgerichtet ist. Stellen Sie die Hitze # 2-Wert bis 800 und der Pull-Wert auf 650. Drücken Sie die&quot; ziehen &quot;, um die Nadel zu ziehen. Dies erzeugt zwei Nadeln aus einer einzigen 7&quot; Glaskapillarrohrs. </li><li> Snip die Spitze einer Nadel gezogen mit einem Paar von Dumont Zange ab. Hinweis: Nach der Nadel ziehen, wird die Spitze dicht verschlossen und muss aufgeschnitten werden. Je näher an der Spitze der Nadel, die es geschnitten wird, je kleiner der Durchmesser der Nadelspitze ist. Obwohl der Durchmesser der Spitze nicht das Injektionsvolumen mit dem Mikroinjektionssystem hier verwendet beeinflussen, eine Spitze mit einem größeren Durchmesser ist wahrscheinlicher, den Embryo zu beschädigen. </li><li> Schieben Sie die micropipette Spannzange auf die Rückseite der Nadel. Als nächstes schieben Sie die große Loch O-Ring hinter der Spannzange der Nadel auf der Rückseite. </li><li> Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl mit einer 27-Gauge-Injektionsnadel verwenden, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen in der Nadel zu bekommen. </li><li> Schieben Sie die Nadel auf den Kolben der Mikroinjektors, die Nadel in das große Loch der weißen Plastikabstandhalter auf dem Kolben installiert Sitz. Der Kolben sollte einen kleinen O-Ring am nächsten zu dem Körper des Mikroinjektors, gefolgt von den weißen Abstandhalter, großes Loch O-Ring und Spannzange. Befestigen Sie die Nadel durch die Spannzange festziehen. Ziehen Sie vorsichtig an der Nadel, um sicherzustellen, dass es richtig gesichert ist. </li><li> Drücken und halten Sie die &quot;leere&quot; -Taste auf der Mikroinjektors Steuerbox, bis zwei Pieptöne sind. </li><li> Pipette 3 ul Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Legen Sie die Spitze der Nadel in die Perle der Injektionslösung auf dem Parafilm. Drücken und halten Sie die &quot;füllen&quot; -Taste auf der microinjector Kontrollkästchen, um die Injektionslösung in die Nadel zu ziehen. </li><li> Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit 500 Mikron Polyester ausgekleidet Netz mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin. Sorgfältig pipettieren 20-30 April-Zell-oder 8-Zellen-Embryonen in die Schale. </li><li> Verwendung einer Haarschleife 14, manipulieren die Embryonen so dass die Blastomere einzuspritzen ist die Nadel gegenüber . Zur Ausrichtung auf die linke Niere, richten Sie die Embryonen, so dass die linke ventrale Blastomeren von 4-Zellen-Embryonen oder links V2 Blastomeren von 8-Zellen-Embryonen, die Nadel stellen. </li><li> Einzuspritzen 10 nl der Injektionslösung in den ausgewählten Blastomere von jedem Embryo in der Schale. Hinweis: Das Gitter am Boden der Petrischale stabilisiert die Embryonen und verhindert, dass sie rollen, so dass sie für die Stabilisierung ohne die Verwendung eines Haarschleife injiziert werden. </li><li> Transfer Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte eingespritzt, die mit 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin gefüllt wurden. Inkubieren des injizierten Embryos bei 16 ° C für mindestens eine Stunde, um die injizierte Blastomere zu erlauben, zu heilen. </li><li> Übertragen Sie die geheilt Embryonen in die Vertiefungen einer neuen Kulturplatte, die mit 0.3x MMR + 30 mg / ml Gentamycin von Stufe 9 (vor der Gastrulation) gefüllt wurden. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen bei 14 bis 40 21 - 22 ° C , bis die Embryonen Stufe 38 erreichen. </li></ol> 4. Fixierung und Immunfärbung von Embryonen <ol><li> Vorbereitung 50 ml MOPS / EGTA / Magnesium sulfat / Formaldehyde Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (v / v) Formaldehyd]. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, setzen 10 - 20 Stufe 38 bis 40 Embryonen in einem Glasfläschchen. Fügen Sie 10 &amp; mgr; l 5% Benzocain in 100% igem Ethanol in das Fläschchen und invert Phiole zu mischen. Warten Sie 10 min, die Embryonen zu betäuben. </li><li> Entfernen Sie die MMR aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Wenn mehrere Ampullen gleichzeitig Verarbeitung können die Phiolen aufrecht in einer Platte mit 24 Vertiefungen Zellkultur gehalten werden. </li><li> Mit einem Glasrohrtte, füllen Sie das Fläschchen mit MEMFA. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die MEMFA aus dem Fläschchen mit einer Glaspipette. Füllen Sie das Fläschchen mit 100% Methanol. Legen Sie das Fläschchen auf einem dreidimensionalen Schüttler für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal, und speichern Sie die Embryonen in 100% Methanol über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Vorbereitung 1x Phosphate Buffered Saline-Rinderserumalbumin-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum mit einem 1: 5 - Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörper 4A6 (zu etikettieren die Membranen der Zwischen, distalen und Verbindungs ​​Tubuli 20), eine 01.30 Verdünnung von Maus - monoklonalen Antikörpers 3G8 (zu Etikett Lumen der proximalen Tubuli 20) und einer 1: 250 Verdünnung von Kaninchen - polyklonalen Antikörper RFP (um die MEM-RFP - Tracer - Label). Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die secondary-Antikörper-Lösung: 1x PBT mit 10% Ziegenserum, 1: 500 Alexa 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (Stammkonzentration 2 mg / ml; beschriften 4A6 und 3G8) und 1: 500 Alexa 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Lager Konzentration 2 mg / ml; die MEM-RFP-Tracer zur Markierung). Lagerung bei 4 ° C, für den Schlauch in Folie vor Licht zu schützen. </li><li> Alternativ sammeln die primären und sekundären Antikörper nach der Färbung, und in zukünftigen Experimenten bei 4 ° C zur Wiederverwendung speichern. Wenn der Antikörper zur Wiederverwendung gespeichert werden soll, fügen Sie 0,01% Natriumazid. </li><li> Immunostain die Embryonen etablierten Protokollen unter Verwendung von 18. </li></ol> 5. Visualisierung von Embryonen und Analyse von Zielgerichtete Pronephric Tissue <ol><li> Bildschirm, um die immunhistochemisch Embryonen zu überprüfen, ob die korrekte Blastomere durch Betrachten der Fluoreszenz des Tracers unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei 1X injiziert wurde (zu sehen ganze Embryo) und D5 (zu sehen Niere) Vergrößerung. Platz Embryonen in einer Multi-Well-Glasplatte mit dem wirlls gefüllt mit 1x PBT einer Transferpipette mit der Spitze mit abgeschnitten. Manipulieren die Embryonen mit einer Haarschleife. Nur Embryonen , die die co-injizierten Tracer , die in den pronephros auf der linken Seite des Embryos (3C, F und 4C, F) für die Gen - Überexpression oder Zuschlagsanalyse haben. </li><li> Alternativ deaktivieren Sie die Embryonen in Murrays Clear (2 Teile Benzylbenzoat: 1 Teil Benzylalkohol) durch die Embryonen in einem Glasfläschchen und das Fläschchen mit Murrays Klar füllen. Visualisieren Sie die Embryonen ein Glas-Well-Platte verwendet wird. Hinweis: Murray Clear ist ein organisches Lösungsmittel, und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Handschuhe tragen, und verwenden Sie nur Glasfläschchen und Pipetten mit Murrays Clear. </li><li> Store Embryonen bei 4 ° C in 1x PBT für 2 - 3 Wochen. Für die Langzeitlagerung von Embryonen, dehydratisieren die Embryonen durch zweimal in 100% Methanol bei Raumtemperatur für 10 min gewaschen. Speichern der Embryonen bei -20 ° C in 100% Methanol. </li></ol>

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Targeting die pronephros der Entwicklung von Xenopus - Embryonen stützt sich auf die Identifizierung und die richtige Blastomere zu injizieren. Die Injektion des V2 Blastomere von 8-Zellen - Embryonen zielt auf die linke pronephros 18. Dies lässt die Gegenseite rechts pronephros als interne Kontrolle. Wenn Morpholino Knockdown oder RNA-Überexpression wird verwendet, Nierenentwicklung zu verändern, können die Gegenseite rechts pronephros verwendet werden, um die Auswirkungen von Knock-Down oder Überex...

Die Xenopus embryonale Niere, die pronephros, ist ein gutes Modell der Nierenentwicklung und Krankheit zu studieren. Die Embryonen entwickeln extern, sind groß, in großen Stückzahlen hergestellt werden und werden durch Mikroinjektion oder chirurgische Eingriffe leicht manipulierbar. Darüber hinaus werden die Gene regeln Nierenentwicklung in Säugetieren und Amphibien konserviert. Mammalian Nieren Fortschritte durch drei Phasen: die pronephros, Mesonephros und metanephros 1, während der embryonalen Amphibien haben ein pronephros und erwachsene Amphibien haben ein metanephros. Die grundlegende Filtereinheit dieser Nierenformen ist das Nephron, und beide Säugetiere und Amphibien benötigen , um die gleiche Signalkaskaden und induktive Ereignisse 3 Nephrogenese 2, zu unterziehen. Die Xenopus pronephros einen einzigen nephron enthält proximaler zusammengesetzt, Zwischen-, distalen und Anschluss Tubuli, und eine Glomus (analog dem Säuger Glomerulus) 1, 4-6 (1 </strOng&gt;). Die einzelne, große Nephron in den Xenopus pronephros macht es geeignet als einfaches Modell für die Untersuchung von Genen in Nierenentwicklung und Krankheitsprozessen beteiligt. Zellschicksal Karten wurden für frühen Xenopus - Embryonen hergestellt und sind frei im Internet unter Xenbase 7-11 zur Verfügung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Mikroinjektion von Lineage Tracern , die Entwicklungs Xenopus pronephros zu zielen, wobei die gleiche Technik angepasst werden kann , andere Gewebe zu zielen, wie das Herz oder die Augen. Lineage Tracern sind Etiketten (einschließlich Vitalfarbstoffen, fluoreszierend markierte Dextrane, histochemisch nachweisbare Enzyme und mRNA kodiert, fluoreszierende Proteine), die in einem frühen Blastomere injiziert werden kann, so dass die Visualisierung der Nachkommen dieser Zelle während der Entwicklung. Dieses Protokoll nutzt MEM-RFP - mRNA, die Codierung Membran rot fluoreszierendes Protein 12 als Linie Tracer gezielt. Die gezielte Mikroinjektions techniken für einzelne Blastomeren in 4- und 8-Zellen-Embryonen hier beschriebene zur Injektion mit Morpholinos genutzt werden, um knock down Genexpression oder mit exogenen RNA ein Gen von Interesse überexprimiert. Durch die Injektion in die Bauch, pflanzliche Blastomere, in erster Linie die pronephros des Embryos wird gezielt werden, die kontralateralen pronephros als Entwicklungskontrolle verlassen. Co-Einspritzen eines Tracers verifiziert, dass der korrekte Blastomere injiziert wurde, und zeigt, welche in der Embryogeweben ergaben sich aus dem injizierten Blastomere, Verifizieren der pronephros Targeting. Immunostaining der pronephros ermöglicht die Visualisierung, wie gut die pronephric Tubuli gezielt wurden. Überexpression und Zuschlags Effekte können dann auf die Gegenseite des Embryos erzielt werden, die als Entwicklungskontrolle dient und verwendet werden kann , die pronephric Index 13 zu berechnen. Die Verfügbarkeit von Zellschicksal Karten ermöglicht diese gezielte Mikroinjektionstechnik verwendet werden, an Zielgewebe other als die pronephros und Co-Injektion eines fluoreszierenden Indikators erlaubt die gezielte Mikroinjektions zu jedem Gewebe vor der Analyse überprüft werden. Während der Embryomikroinjektions sollte Entwicklungstemperatur fest geregelt werden, da die Rate der Xenopus Entwicklung auf sie stark abhängig ist 14. (- 16 ° C 14) 4- und 8-Zellinjektionen, da die Entwicklungszeit verlangsamt Embryonen bei kühleren Temperaturen inkubiert werden. Bei 22 ° C, die Entwicklungszeit von Stufe 1 (1 Zelle) auf Stufe 3 (4 Zellen) beträgt etwa 2 Stunden, während bei 16 ° C Entwicklungszeit zu Stufe 3 ca. 4 Stunden. Es dauert etwa 15 Minuten von einem 4-Zellen-Embryo zu einem 8-Zellen (Stufe 4) Embryo bei 22 ° C zu gehen, aber dauert etwa 30 Minuten bei 16 ° C. In ähnlicher Weise bei 22 ° C, dauert es nur 30 Minuten für eine 8-Zell-Embryo zu einem 16-Zellen-Embryo (Stufe 5) fortzuschreiten. Diese Zeit wird bei 16 ° C auf 45 Minuten erhöht. Dasrefore, ist es nützlich, um die Entwicklungsrate der Embryonen zu verlangsamen, an der 8-Zellen-Stadium für Injektionszwecke ausreichend Zeit zu ermöglichen, bevor die Embryonen auf die Bühne 16-Zelle fortzuschreiten. Außerdem können Wachstumstemperaturen moduliert werden embryonale Entwicklung zu beschleunigen oder zu verlangsamen, bis die Niere vollständig entwickelt hat. Die Epidermis der Kaulquappe stufigen Xenopus - Embryonen ist relativ transparent, erlaubt eine einfache Abbildung der Entwicklung pronephros ohne Dissektion oder Lichtung des Gewebes 15. Aufgrund der relativen Transparenz von Xenopus - Embryonen ist die Abbildung lebender Zellen auch denkbar , 16,17. Whole-mount die pronephros zu visualisieren immunostaining ist möglich , mit etablierten Antikörper, die die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs ​​Tubuli der Stufe 38 beschriften - 40 Embryonen , die für die Beurteilung der pronephric Entwicklung ermöglichen nach Manipulation der Genexpression gezielt in Xenopus - Embryonen 18-20.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Lösung, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100 100</td><td></td></tr><tr><td>mm x 15 mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Tischinkubator für Embryonen.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP-Plasmid</td><td></td><td></td><td>Zur Herstellung von Tracer-RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molekularbiologische Qualität, steriles gereinigtes Wasser von USP</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7" Drummond Ersatzröhrchen</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Mikroinjektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Zum Aufbrechen der Mikroinjektionsnadelspitze.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Mikroinjektor.</td></tr><tr><td>Mineralöl, schwer</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Öl für Nadeln.</td></tr><tr><td>27 G Monoject Injektionsnadel</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>Zum Laden von Mineralöl in die Mikroinjektionsnadel.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td>Zum Laden von Mineralöl in die Mikroinjektionsnadel.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 Mikron Polyesternetz</td><td>Kleinteile</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Für den Transfer von Embryonen. Schneiden Sie die Spitze ab, damit die Embryonen leicht von der Pipette aufgenommen werden können.</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS Fisher</td><td></td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Fläschchen mit Schraubgewinde</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Zum Fixieren, Färben und Lagern von Embryonen.</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nest Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocain</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x Pulver</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini Rocker, Modell 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum, neuseeländischen Ursprungs</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler 3G8 Antikörper</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primärer Antikörper zur markierung proximal Röhrchen.</td></tr><tr><td>Monoklonaler 4A6-Antikörper</td><td>European Xenopus Resource</td><td></td><td>Centre Primärer Antikörper zur Markierung von intermediären, distalen und verbindenden Tubuli.</td></tr><tr><td>Anti-RFP-pAb, gereinigtes IgG/Kaninchen</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primärer Antikörper zur Markierung des Gap43-RFP-Tracers.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Sekundärer Antikörper zur Markierung von Nierentubuli.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Sekundärer Antikörper zur Markierung des Gap43-RFP-Tracers.</td></tr><tr><td>9 Kavitäten-Spotplatte</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzylbenzoat</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optional - zur Reinigung</td></tr> von <tr><td>Embryonen Benzylalkohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optional - zur Reinigung von Embryonen</td></tr></tbody></table>

technik auf zielmikroinjektions an die entwicklungs<em&gt; xenopus</em&gt; kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Die embryonale Niere von Xenopus laevis (Frosch), die pronephros, besteht aus einem einzigen Nephron, und kann als ein Modell für eine Nierenerkrankung verwendet werden. Xenopus - Embryonen sind groß, entwickeln außen und leicht durch Mikroinjektion oder chirurgische Verfahren manipuliert werden können. Darüber hinaus wurden für die frühen Xenopus - Embryonen Schicksal Karten hergestellt. Gezielte Mikroinjektion in den einzelnen Blastomeren, die Anlass schließlich zu einem Organ oder Gewebe von Interesse geben kann selektiv verwendet werden, um überexprimiert oder knock down Genexpression in diesem begrenzten Bereich, sinkende Nebenwirkungen in den Rest des sich entwickelnden Embryos. In diesem Protokoll beschreiben wir , wie etabliert Xenopus Schicksal Karten verwenden , um die Entwicklung von Xenopus Niere (die pronephros), durch Mikroinjektion in spezifischen Blastomere von 4- und 8-Zellembryos zu zielen. Die Injektion von Lineage Tracer ermöglicht die Verifizierung der spezifischen Ausrichtung der Injektion.Nach Embryonen entwickelt haben, 38 auf die Bühne - 40, ganz-mount Immunfärbung verwendet pronephric Entwicklung sichtbar zu machen, und der Beitrag von Zellen gezielt zu den pronephros beurteilt werden kann. Die gleiche Technik kann andere Gewebetypen angepasst werden, um den pronephros zusätzlich zu zielen.

Mikroinjektionen von 4- und 8-Zell Xenopus - Embryonen mit MEM-RFP mRNA zeigen verschiedene Ebenen zu den pronephros Targeting. 4 zeigt Stufe 40 Embryonen mit korrektem MEM-RFP mRNA Expressionsmuster. Embryos wurden in der linken ventral Blastomere (4A), und sortiert die richtige Expressionsmuster von MEM-RFP mRNA injiziert. Zusätzlich MEM-RFP im proximalen zum Ausdruck zu bringen, Zwischen- und distalen Tubuli der Niere, richtig injizierten Emb...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Schicksalskarten und Abstammungsverfolgungen, um gezielte Injektionen in einzelne Blastomere durchzuführen, aus denen die Niere von Xenopus laevis-Embryonen entsteht.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mikroinjektionen gezielt in die sich entwickelnde Xenopus-Niere vorzunehmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie zu klären, beispielsweise wie die Niere entsteht und welche Gene für diesen Prozess wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Abgabe der mikroinjizierten Reagenzien an ein bestimmtes Gewebe maximiert.Die Visualisierung dieser Methode ist wichtig, da die Identifizierung des richtigen Blastomeren für eine gezielte Mikroinjektion entscheidend ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, wurden beide Hoden von einem einzelnen Frosch entnommen und in eine 60 Millimeter große Petrischale mit 10 Milliliter Hodenspeicherlösung gegeben. Anschließend werden die Hoden bei vier Grad Celsius gelagert.Anschließend wurden Eier von einem weiblichen Frosch in einer 100 Millimeter Petrischale gesammelt. Überschüssiges Wasser aus der Petrischale abgießen. Danach ein Viertel eines Hodens in Hodenspeicherlösung herausschneiden.Überführen Sie das Hodestück in die Petrischale mit den Eiern. Anschließend schneiden Sie den Hodenanteil in kleine Stücke. Geben Sie MMR mit Gentamycin in die Petrischale, bis die Eier bedeckt sind.Vermischen Sie sie durch Schwenken der Schale und warten Sie anschließend etwa 30 Minuten, bis die Befruchtung bei Raumtemperatur abgeschlossen ist. Nach der Befruchtung sollte die pigmentierte Seite der Embryonen nach oben zeigen. Entfernen Sie MMR mit einer Transferpipette aus der Petrischale und geben Sie ausreichend De-Jelly-Lösung hinzu, um die Embryonen zu bedecken.Anschließend die Schale in den nächsten Minuten vorsichtig schwenken, um den Eiweißmantel der Embryonen aufzulösen. Sobald die Embryonen sich in der Mitte der Schale dicht berühren, ist der Eiweißmantel entfernt. Die Entfernungslösung mit einer Transferpipette abnehmen.Als Nächstes die entkleideten Embryonen 3 bis 5 Mal in MMR mit Gentamycin waschen, indem das MMR vorsichtig abgegossen und die Schale mit frischem MMR aufgefüllt wird. Dabei nicht das gesamte MMR aus der Schale entfernen, da dies die Embryonen beschädigen könnte. Danach alle unbefruchteten Eier oder Hodenstücke aus der Petrischale entfernen.Um die Entwicklung zeitlich zu verschieben, werden die Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in eine Petrischale gelegt, die bei 14 Grad Celsius gehalten wird, und die andere Hälfte der Embryonen in eine Petrischale bei 18 Grad Celsius. Die Embryonen entwickeln sich bei 14 Grad Celsius langsamer als bei 18 Grad Celsius. Dies ermöglicht mehrere Injektionsansätze aus einem einzigen befruchteten Gelege.Bereiten Sie die Injektionslösung vor, die 0,01 Nanogramm pro Nanoliter membrangebundenes rotes fluoreszierendes Protein-mRNA enth&auml;lt. W&auml;hrend die Embryonen sich bis zum 4-Zell- oder 8-Zell-Stadium entwickeln. Bewahren Sie die Injektionsl&ouml;sung bis zur Verwendung auf Eis auf.Dann eine sieben Zoll lange Ersatz-Glaskapillare in einen Nadelzieher einlegen, wobei das obere Ende der Ersatzkapillare mit dem oberen Rand des Nadelziehergehäuses ausgerichtet ist. Die Heizstufe zwei auf 800 und den Zugwert auf 650 einstellen und den Ziehknopf drücken, um die Nadel zu ziehen. Anschließend die Spitze der gezogenen Nadel mit einer Pinzette vom Typ Dumont abschneiden.Stecken Sie die Mikropipettenhülse auf das hintere Ende der Nadel. Danach ziehen Sie den O-Ring mit dem großen Loch über das hintere Ende der Nadel hinter die Hülse. Füllen Sie nun die Nadel mit Mineralöl unter Verwendung einer 27-Gauge-Hypodermikannadel, wobei darauf geachtet werden muss, keine Luftblasen in die Nadel zu bringen.Setzen Sie die Nadel auf den Kolben des Mikroinjektors, indem Sie die Nadel in das große Loch des weißen Kunststoffabstandstücks stecken, das am Kolben angebracht ist. Sichern Sie die Nadel, indem Sie die Klemmhülse festziehen. Drücken Sie anschließend die „Empty“-Taste am Steuergerät des Mikroinjektors und halten Sie sie gedrückt, bis zwei Pieptöne ertönen.Anschließend pipettieren Sie drei Mikroliter der Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Danach führen Sie die Nadelspitze in den Tropfen der Injektionslösung auf dem Parafilm ein. Drücken und halten Sie die „Fill“-Taste an der Steuerbox des Mikroinjektors, um die Injektionslösung in die Nadel aufzuziehen.Vor der Mikroinjektion ist es wichtig, die frühen Zellteilungen des Xenopus-Embryos zu verstehen. Der Einzelzell-Embryo weist einen dunkel pigmentierten animalen Pol und einen vegetativen Pol auf, der weiß und eigelbhaltig ist. Bei dem Zweizell-Embryo erfolgt die erste Furchung typischerweise zwischen der linken und rechten Seite des Embryos.Diese Zellen tragen gleichermaßen zur Pronephros-Linie bei. Die zweite Teilung teilt die dorsale und ventrale Hälfte des Embryos und führt zu einem 4-Zell-Embryo. Die dorsalen Zellen sind kleiner und weisen weniger Pigment auf als die ventralen Zellen.Wenn in ein 4-Zell-Embryo injiziert wird, die linke ventrale Blastomere injizieren, um die linke Niere anzusteuern. Die dritte Furchung teilt die animalen und vegetativen Seiten. Das Ergebnis ist ein 8-Zell-Embryo.Zu diesem Zeitpunkt gibt es vier tierische und vier vegetative Blastomeren. Um die linke Niere eines 8-Zell-Embryos anzusprechen, injizieren Sie in die linke ventrale vegetative Blastomere. Füllen Sie anschließend eine 60 Millimeter große Petrischale, die mit einem 500 Mikrometer großen Polyester-Netz ausgekleidet ist, mit fünf Prozent Fycol in MMR plus Gentamycin.Pipettieren Sie vorsichtig 20 bis 30 Embryonen mit 8 Zellen in die Petrischale. Mit einer Haarschleife die Embryonen so manipulieren, dass die zu injizierende Blastomere der Nadel zugewandt ist. Um die linke Niere anzusteuern, richten Sie die Embryonen so aus, dass die linken ventralen vegetativen Blastomeren der 8-Zellen-Embryonen zur Nadel zeigen.Injizieren Sie 10 Nanoliter Injektionslösung in den ausgewählten Blastomeren jedes Embryos in der Petrischale. Danach überführen Sie die injizierten Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte mit fünf Prozent Fycol in MMR plus Gentamycin. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen bei 16 Grad Celsius für etwa ein bis zwei Stunden, um den injizierten Blastomeren Zeit zur Regeneration zu geben.Anschließend die mikroinjizierten Embryonen in neue Vertiefungen der Kulturschale überführen, die mit MMR plus Gentamycin gefüllt sind. Die Embryonen bei 14 bis 22 Grad Celsius inkubieren, bis sie das Stadium 38 bis 40 erreichen. Überführen Sie in diesem Verfahren 10 bis 20 Embryonen vom Stadium 38 bis 40 in ein Glasfläschchen.Fügen Sie 10 µL Fünf-Prozent-Benzocain in 100-prozentigem Ethanol zu dem Gefäß hinzu. Mischen Sie durch Umkippen des Gefäßes und warten Sie 10 Minuten, um die Embryonen zu betäuben. Entfernen Sie anschließend MMR aus dem Gefäß und füllen Sie es mit MEMFA auf. Danach eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine dreidimensionale Schüttelplattform stellen. Nach einer Stunde MEMFA aus dem Röhrchen entfernen und es mit 100 Prozent Methanol auffüllen. Anschließend das Röhrchen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur auf eine dreidimensionale Schüttelplattform stellen.Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal und lagern Sie die Embryonen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius in 100 Prozent Methanol. Die Embryonen sind nun fixiert und bereit für die Immunfärbung. Dieses Schema zeigt, welcher Blastomer für die Injektion zur gezielten Markierung der linken Pronephros von Xenopus-Embryonen im 8-Zell-Stadium unter Verwendung von mRNA für membrangebundenes rotes Fluoreszenzprotein als Tracer angebohrt werden soll.Die Lokalisation des Tracers nach Injektion in den linken ventralen vegetativen Blastomeren ist in Rot dargestellt, während die Niere grün markiert ist. Dieses Bild zeigt, dass die Niere mit den Antikörpern 3G8 und 4A6 grün angefärbt wurde. Hier ist eine vergrößerte Ansicht des Nierenbereichs, die die Tracerlokalisation zeigt, und hier ist das überlagerte Bild, das die Kolokalisation des Tracers mit der Niere darstellt.Hier ist das konfokale Bild der Niere eines zweiten Embryos, der mit 3G8 und 4A6 gefärbt wurde. Dargestellt ist die Lokalisation des roten Tracers in der Niere und im umgebenden Gewebe, und dies ist das überlagerte Bild, das die Ko-Lokalisation der Tracer 3G8 und 4A6 in der Niere zeigt. Vor Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich mit dem frühen Xenopus-Embryo vertraut zu machen.Dies ermöglicht es Ihnen, Mikroinjektionen gezielt durch die etablierte Xenopus-Fade-Karte zu führen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie angepasst werden, um andere Gewebe wie das Neuralrohr oder das Herz gezielt anzusprechen.

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Research

Forschung

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