Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs Xenopus Kidney

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mikroinjektionen in die sich entwickelnde Xenopus-Niere zu richten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie sich die Niere bildet und welche Gene für diesen Prozess wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abgabe von mikroinjizierten Reagenzien an ein Zielgewebe maximiert.

Die Visualisierung dieser Methode ist wichtig, da die Identifizierung des richtigen Blastomers für die gezielte Mikroinjektion von entscheidender Bedeutung ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, wurden beide Hoden von einem einzigen männlichen Frosch isoliert und in eine 60-Millimeter-Petrischale gelegt, die mit 10 Milliletern Hodenaufbewahrungslösung gefüllt war. Lagern Sie dann die Hoden bei vier Grad Celsius.

Als nächstes wurden Eier von einem weiblichen Frosch in einer 100 Millimeter großen Petrischale gesammelt. Gießen Sie überschüssiges Wasser aus der Petrischale ab. Schneiden Sie danach ein Viertel eines Hodens in der Hodenspeicherlösung ab.

Übertragen Sie das Hodenstück in die Petrischale mit den Eiern. Schneiden Sie anschließend den Hodenteil in kleine Stücke. MMR plus Gentamycin in die Petrischale geben, um die Eier zu bedecken.

Mischen Sie sie, indem Sie die Schüssel schwenken, und warten Sie dann etwa 30 Minuten, bis die Düngung bei Raumtemperatur stattfindet. Nach der Befruchtung sollte die pigmentierte Seite der Embryonen nach oben zeigen. Entfernen Sie MMR mit einer Transferpipette aus der Petrischale und fügen Sie genügend Entgeleelösung hinzu, um die Embryonen zu bedecken.

Schwenken Sie die Schale anschließend in den nächsten Minuten, um die Geleehülle auf den Embryonen aufzulösen. Sobald sich die Embryonen in der Mitte der Schale eng berühren, wurde die Geleehülle entfernt. Entfernen Sie die Entgeleelösung mit einer Transferpipette.

Waschen Sie anschließend die geleefreien Embryonen 3 bis 5 Mal in MMR plus Gentamycin, indem Sie das MMR vorsichtig abgießen und die Schale mit neuem MMR füllen. Entfernen Sie nicht das gesamte MMR aus der Schale, da dies die Embryonen beschädigen kann. Entfernen Sie danach unbefruchtete Eizellen oder Hodenstücke aus der Petrischale.

Um ihre Entwicklung zu staffeln, legen Sie die Hälfte der Embryonen aus einer einzigen Befruchtung in eine Petrischale, die bei 14 Grad Celsius aufbewahrt wird, und die andere Hälfte der Embryonen in eine Petrischale, die bei 18 Grad Celsius aufbewahrt wird. Embryonen entwickeln sich bei 14 Grad Celsius langsamer als bei 18 Grad Celsius. Ermöglicht mehrere Injektionssätze aus einem einzigen befruchteten Gelege.

Bereiten Sie die Injektionslösung vor, die einen Nullpunkt, ein Nanogramm pro Nanoliter, membrangebundene mRNA mit rotfluorzierendem Protein enthält. Während sich die Embryonen zum 4-Zell- oder 8-Zell-Stadium entwickeln. Bewahren Sie die Injektionslösung bis zur Verwendung auf Eis auf.

Laden Sie dann ein sieben Zoll großes Ersatz-Glaskapillarrohr in einen Nadelabzieher, wobei die Oberseite des Ersatzrohrs mit der Oberseite des Nadelabziehergehäuses ausgerichtet ist. Stellen Sie den Wert der Hitze Nummer zwei auf 800 und den Zugwert auf 650 ein und drücken Sie die Zugtaste, um die Nadel zu ziehen. Schneiden Sie danach die Spitze der gezogenen Nadel mit einer Dumont-Pinzette ab.

Schieben Sie die Mikropipetten-Spannzange auf die Rückseite der Nadel. Schieben Sie dann den O-Ring mit dem großen Loch auf die Rückseite der Nadel hinter der Spannzange. Füllen Sie nun die Nadel mit Mineralöl mit einer 27-Gauge-Hyperdermic-Nadel und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Nadel gelangen.

Schieben Sie die Nadel auf den Kolben des Mikroinjektors und setzen Sie die Nadel in das große Loch des weißen Kunststoffabstandshalters ein, der am Kolben angebracht ist. Sichern Sie die Nadel, indem Sie die Spannzange festziehen. Halten Sie anschließend die Taste "Leer" am Steuerkasten des Mikroinjektors gedrückt, bis zwei Pieptöne zu hören sind.

Pipettieren Sie anschließend drei Mikroliter Injektionslösung auf ein Stück Parafilm. Führen Sie dann die Spitze der Nadel in die Raupe der Injektionslösung auf dem Parafilm ein. Halten Sie die Taste "Füllen" am Steuerkasten des Mikroinjektors gedrückt, um die Injektionslösung in die Nadel zu ziehen.

Vor der Mikroinjektion ist es wichtig, die frühen Zellteilungen des Xenopus-Embryos zu verstehen. Der einzellige Embryo hat einen dunkel pigmentierten, tierischen Pol und einen pflanzlichen Pol, der weiß und jochig ist. Beim zweizelligen Embryo findet die erste Spaltung typischerweise zwischen der linken und der rechten Seite des Embryos statt.

Diese Zellen tragen zu gleichen Teilen zur pronephrischen Linie bei. Die zweite Spaltung teilt die dorsale und die ventrale Hälfte des Embryos, was zu einem 4-zelligen Embryo führt. Die dorsalen Zellen sind kleiner und haben weniger Pigment als die ventralen Zellen.

Wenn Sie in einen 4-zelligen Embryo injizieren, injizieren Sie das linke ventrale Blastomer, um die linke Niere zu erreichen. Die dritte Spaltung teilt die tierische und die pflanzliche Seite. Das Ergebnis ist ein 8-zelliger Embryo.

Zu diesem Zeitpunkt gibt es vier tierische Blastomere und vier pflanzliche Blastomere. Um die linke Niere eines 8-zelligen Embryos zu erreichen, injizieren Sie in das linke ventrale pflanzliche Blastomer. Füllen Sie anschließend eine 60 Millimeter große Petrischale, die mit 500 Mikron Polyesternetz mit fünf Prozent Fycol in MMR plus Gentamycin ausgekleidet ist.

Pipettieren Sie vorsichtig 20 bis 30 8-zellige Embryonen in die Schale. Mit einer Haarschlaufe werden die Embryonen so manipuliert, dass das zu injizierende Blastomer der Nadel zugewandt ist. Um die linke Niere zu treffen, richten Sie die Embryonen so aus, dass die linken ventralen pflanzlichen Blastomere von 8-zelligen Embryonen zur Nadel zeigen.

Injizieren Sie 10 Nanoliter Injektionslösung in das ausgewählte Blastomer jedes Embryos in der Schale. Dann werden die injizierten Embryonen in die Vertiefungen einer Kulturplatte mit fünf Prozent Fycol in MMR plus Gentamycin übertragen. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen etwa ein bis zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius, damit die injizierten Blastomere heilen können.

Danach werden die mikroinjizierten Embryonen in neue Vertiefungen in der Kulturplatte überführt, die mit MMR plus Gentamycin gefüllt sind. Inkubieren Sie die Embryonen bei 14 bis 22 Grad Celsius, bis sie die Stadien 38 bis 40 erreichen. Bei diesem Verfahren werden 10 bis 20 Embryonen im Stadium, 38 bis 40 Embryonen, in ein Glasfläschchen überführt.

Geben Sie 10 Mikroliter fünf Prozent Benzocain in 100 Prozent Ethanol in das Fläschchen. Mischen Sie, indem Sie das Fläschchen umdrehen und 10 Minuten warten, um die Embryonen zu betäuben. Entfernen Sie anschließend MMR aus dem Fläschchen und füllen Sie es mit MEMFA.

Stellen Sie es dann für eine Stunde bei Raumtemperatur auf eine dreidimensionale, schaukelnde Plattform. Entfernen Sie nach einer Stunde MEMFA aus dem Fläschchen und füllen Sie es mit 100 Prozent Methanol. Stellen Sie das Fläschchen dann zehn Minuten lang bei Raumtemperatur auf eine dreidimensionale, schaukelnde Plattform.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal und lagern Sie die Embryonen über Nacht in 100 Prozent Methanol bei minus 20 Grad Celsius. Die Embryonen sind nun fixiert und bereit für die Immunfärbung. Dieses Schema zeigt, welches Blastomer injiziert werden muss, um den linken Pronephros von Xenopus-Embryonen im 8-Zell-Stadium zu stimulieren, wobei membrangebundene mRNA aus rotfluoreszierendem Protein als Tracer

Die Tracerlokalisation nach Injektion im linken ventralen pflanzlichen Blastomer ist rot dargestellt, während die Niere grün markiert ist. Dieses Bild zeigt, dass die Niere mit den Antikörpern 3G8 und 4A6 grün gefärbt wurde. Hier ist eine Nahaufnahme der Nierenregion, die eine Tracer-Loakalisierung zeigt, und hier ist das zusammengefügte Bild, das die Co-Lokalisation des Tracers mit der Niere zeigt.

Hier ist das konfokale Bild der Niere eines zweiten Embryos zu sehen, der mit 3G8 und 4A6 gefärbt wurde. Dies ist die Lokalisation des roten Tracers in der Niere und dem umgebenden Gewebe und dies ist das zusammengeführte Bild, das die Co-Lokalisation des Tracers 3G8 und 4A6 in der Niere zeigt. Bevor Sie diesen Eingriff durchführen, ist es wichtig, sich mit dem frühen Xenopus-Embryo vertraut zu machen.

Auf diese Weise können Sie Mikroinjektionen über die etablierte Xenopus-Fade-Map richtig ausrichten. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie an andere Gewebe wie das Neuralrohr oder das Herz angepasst werden.