Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, humane pluripotente Stammzellen in vollständig pigmentierte, reife Melanozyten zu differenzieren. Diese Methode kann dabei helfen, Schlüsselfaktoren während der Melanozytenentwicklung zu identifizieren. Außerdem ermöglicht dieses Protokoll die Identifizierung von Faktoren, die bei der Entstehung von Erkrankungen fehlreguliert sind, sowie das Screening wichtiger Wirkstoffe im Rahmen der Arzneimittelforschung.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir große Mengen vollständig pigmentierter Melanozyten erzeugen können. Die Isolierung von Melanozyten aus Patienten führt hingegen gewöhnlich zu einer relativ geringen Zellanzahl. Nach dem Aliquotieren und Einfrieren des gallertartigen Proteins tauen Sie ein Milliliter-Aliquot auf und resuspendieren es in 19 Milliliter DMEM f12.

Dann geben Sie fünf Milliliter dieser Mischung auf eine einzelne 10-Zentimeter-Zellkultur-Schale. Nachdem mehrere derartige Platten vorbereitet wurden, inkubieren Sie diese eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie anschließend Platten vor, die mit PO, Laminin und Fibronectin beschichtet sind, indem Sie zunächst PBS mit 15 Mikrogramm pro Milliliter PO in eine Kulturschale geben.

Anschließend die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Danach die Lösung abpipettieren und die Schalen dreimal mit 1X PBS waschen. Die Beschichtung fortsetzen, indem 10 Milliliter PBS mit einem Mikrogramm pro Milliliter Maus-Laminin 1 und zwei Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin zugegeben werden.

Dann inkubieren Sie die Petrischalen wie zuvor beschrieben. Geben Sie zunächst 0,1 % Gelatine in PBS in eine 10 cm große Petrischale und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.

Während diese Platte beschichtet wird, gefrorene murine embryonale Fibroblasten oder MEFs in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad geben, um sie schnell aufzutauen. Danach das Gelatine aus der Schale absaugen und die MEFs mit einer Dichte von etwa 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter in DMEM, ergänzt mit 10 Prozent fetalem Kälberserum, ansäen. Nach einer Übernachtinkubation der Schale bei 37 Grad Celsius das Medium absaugen und die vorbereitete MEF-Platte mit 1X PBS waschen.

Fügen Sie 10 Milliliter des zuvor hergestellten hESC-Mediums, das humane pluripotente Stammzellen (abgekürzt hPSCs) enthält, einer 10-Zentimeter-Schale hinzu. Nach dem Ansäen der Zellen mit einer Dichte von 5 Millionen Zellen pro Schale inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius in 5 Prozent Kohlendioxid. Füttern Sie die Zellen anschließend täglich mit 10 Milliliter frischem hESC-Medium.

Vor Beginn der Differenzierung die Platte auf Kolonien überprüfen, die differenzierte Zellen, unregelmäßige Ränder oder transparente Zentren aufweisen. Unter einem Stereomikroskop in einer Sicherheitswerkbank solche unregelmäßigen Kolonien mit einer Pipette mechanisch ablösen. Um eine Beschichtung mit einem gelatineartigen Protein wie Matrigel durchzuführen, das Protein zuerst in Ein-Milliliter-Aliquots abfüllen und einfrieren, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.

Dann tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von einem Milliliter auf und resuspendieren es in 19 Milliliter DMEM F12. Geben Sie anschließend fünf Milliliter dieser Mischung auf eine 10-Zentimeter-Schale und inkubieren Sie die Schalen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Danach saugen Sie das gelartige Protein unmittelbar vor dem Ansäen der Zellen ab und waschen mit DMEM F12. Während diese Schale beschichtet wird, wählen Sie eine Schale aus, in der sich hPSCs bei etwa 80 % Konfluenz befinden.

Führen Sie das Absaugen des hESC-Mediums durch. Anschließend waschen Sie die Zellen mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS geben Sie drei Milliliter 0,05 %igem Trypsin-EDTA in die Platte.

Schütteln Sie die Petrischale energisch horizontal für zwei Minuten, bis unter dem Mikroskop beobachtet wird, dass die MEFs beginnen, sich als einzelne Zellen abzuheben. Während dieses Zeitraums sollten die hPSC-Kolonien an der Platte angeheftet bleiben. Saugen Sie die Trypsinlösung ab, sobald die MEFs abgehoben haben, aber bevor sich die hPSC-Kolonien gelöst haben.

Dann 10 Milliliter hESC-Medium, das 10 Mikromolar Y-27632-Dihydrochlorid, einen ROCK-Inhibitor, enthält, der Platte hinzufügen. Anschließend die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren über die Kolonien ablösen. Danach zurück zur Schale mit einem gallertartigen Protein gehen und die Lösung abpipettieren.

Waschen Sie diese Schale mit DMEM F12, um eventuelle Klumpen zu entfernen. Dann impfen Sie hPSCs im Verhältnis 1 zu 2 darin an. Geben Sie anschließend hESC-Medium mit 10 Mikromolar Y-27632-Dihydrochlorid bis zu 10 Milliliter in die Platte.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Versorgen Sie die Zellen täglich mit Medium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt wurde. Wenn die hPSCs eine Konfluenz von 80 % erreichen, beginnen Sie die neurale Differenzierung und definieren Sie diesen Zeitpunkt als Tag 0.

Beginnen Sie am Tag 0 und Tag 1 die Differenzierung, indem Sie die Zellen mit 10 Milliliter KSR-Differenzierungsmedium versorgen, das 100 Nanomolar LDN-193189, einen Inhibitor von BMP, und 10 Mikromolar SB 431542, einen Inhibitor von Activin und Nodal, enthält. Setzen Sie am Tag 2 fort, indem Sie das Medium durch eines ersetzen, das die gleichen Konzentrationen der BMP- und Activin- und Nodal-Inhibitoren sowie drei Mikromolar CHIR99021, einen Wnt-Agonisten, enthält. Füttern Sie die Zellen dann am Tag 3 mit KSR-Differenzierungsmedium, das nur mit 10 Mikromolar SB 431542 und drei Mikromolar CHIR99021 ergänzt ist.

Nachdem eine Mischung aus 75 % KSR-Differenzierungsmedium und 25 % N2-Differenzierungsmedium hergestellt wurde, das außerdem drei Mikromolar des Wnt-Agonisten enthält, die Zellen am Tag 4 und 5 mit 15 Millilitern dieser Flüssigkeit versorgen. Danach die Zellen an den Tagen 6 und 7 mit 15 Millilitern Medium versorgen, das aus 50 % KSR-Differenzierungsmedium und 50 % N2-Differenzierungsmedium besteht und außerdem mit drei Mikromolar CHIR99021, 25 Nanogramm pro Milliliter BMP4 und 100 Nanomolar EDN3 ergänzt wurde.

Anschließend die Zellen am 8. und 9. Tag mit 20 Milliliter 25 % KSR-Differenzierungsmedium und 75 % N2-Differenzierungsmedium versorgen, das mit den gleichen Konzentrationen an Faktoren ergänzt ist wie am 6. und 7. Tag. Am 10. Tag fortfahren mit der neuronalen Differenzierung, indem die Zellen mit 20 Milliliter N2-Differenzierungsmedium versorgt werden, das drei Mikromolar CHIR99021, 25 Nanogramm pro Milliliter BMP4 und 100 Nanomolar EDN3 enthält. Am 11. Tag die Lösung von Schalen abpipettieren, die zuvor mit PO Laminin 1 und Fibronectin beschichtet wurden.

Anschließend die Platten ungefähr 10 bis 15 Minuten lang unbedeckt in einer Zellkulturhaube belassen, damit sie vollständig trocknen können. Danach das Medium von den Zellen des Tags 11 entfernen und diese mit PBS waschen. Anschließend vier Milliliter Zell-Detachierungslösung in die Petrischale geben und 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation fünf Milliliter vollständiges Melanozytenmedium in die Petrischale geben und die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren manuell resuspendieren, bis sie sich von der Platte gelöst haben. Die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen fünf Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Nach der Zellzählung mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode und eines Hämozytometers die Zellen in vollem Melanozytenmedium mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Tragen Sie 10 µL-Tropfen der Zellsuspension auf die getrockneten, beschichteten Schalen auf. Achten Sie darauf, dass die Tropfen nahe beieinander, aber nicht berührend liegen, scharf begrenzte Ränder aufweisen und nicht verrinnen. Um den Zellen das Anheften zu ermöglichen, lassen Sie die Tropfen 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Danach langsam 10 Milliliter vollständiges Melanozytenmedium der Schale hinzufügen, wobei darauf geachtet werden muss, die angehefteten Zellen nicht zu stören. Anschließend die Schale in den Inkubator stellen. Die Zellen alle zwei bis drei Tage mit vollem Melanozytenmedium versorgen.

Und erwarten Sie, dass sich bis zum Ende der ersten Woche Pigmentierung in Zellclustern zeigt. Passagieren Sie die Zellen einmal pro Woche, indem Sie sie zunächst wie zuvor beschrieben mit einer Zellablösungslösung behandeln. Nach dem Sammeln und Zentrifugieren waschen Sie die Zellen zweimal mit reinem Neurobasal-Medium.

Anschließend die Zellen im Verhältnis 1 zu 6 in vollem Melanozytenmedium auf mit PO, Laminin 1 und Fibronectin beschichteten Platten erneut aussäen. Nach etwa 30 Tagen Differenzierung erscheinen die Zellen stark pigmentiert, was sich leicht visualisieren lässt, wenn sie bei hoher Dichte ausgesät oder beim Passagieren pelletiert werden.

Hier ist ein Helligkeitsfeldbild von Zellen einer transgenen psox10-GFP-humane embryonalen Stammzelllinie dargestellt, die bis zum 11. Tag des beschriebenen Differenzierungsprotokolls kultiviert wurden, bevor die Zellen erneut ausplattiert wurden. In diesen Kulturen sind dunkle, gut definierte Zellränder erkennbar. Bei der Untersuchung dieser Kulturen auf das GFP-Signal zeigte sich eine Anreicherung sox10-positiver Zellen in den dunklen Rändern.

Da sox10 ein Transkriptionsfaktor ist, der von neuralen Crest-Stammzellen hochreguliert wird und in Melanoblasten erhalten bleibt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass durch die Differenzierungsmethode am Tag 11 Zellen angereichert wurden, die letztendlich zu Melanozyten führen werden. Als Beleg hierfür enthielten die Kulturen am Tag 20 unpigmentierte, reifende sowie vollständig reife pigmentierte Melanozyten. Am Tag 25 wurden in den Kulturen die gleichen Zelltypen beobachtet.

Das Vorhandensein ausreifender und pigmentierter Melanozyten in diesen Präparationen wird durch Färbung mit zwei Proteinen nachgewiesen, die an der Melaninproduktion beteiligt sind. TYRP2, das als Marker sowohl für Melanoblasten als auch für Melanozyten dient, und TYRP1, ein Marker für Melanozyten im späten Reifestadium, der hier nur in pigmentierten Melanozyten exprimiert wird. Sobald die Methode beherrscht ist, kann dieses Protokoll verwendet werden, um humane pluripotente Stammzellen innerhalb von 25 Tagen zu vollständig pigmentierten, reifen Melanozyten zu differenzieren.

Das Protokoll verläuft über die normale Melanozytenentwicklung, indem es zunächst den neurokrestalen Zustand und auch das Melanoblastenstadium durchläuft.