Name: Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu reifen Melanozyten durch neuronale Kamm- und Melanoblasten-Stadien. Diese Methode ermöglicht die großskalige Produktion pigmentierter Zellen für die Erforschung von Hautpigmentierungsstörungen und die Arzneimittelentwicklung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für Melanom-Forscher von der Joanna M. Nicolay-Stiftung und von den National Institutes of Health unter Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31 unterstützt. Diese Arbeit wurde weiter durch Zuschüsse aus NYSTEM und der Tri-institutionellen Stammzellen Initiative (Starr Foundation) unterstützt.

HINWEIS: Die Melanozyten-Protokoll hier skizziert wurde zuerst von Mica et al. 1. Herstellung von Kulturmedium, beschichtete Platten und Wartung von hPSCs <ol><li> Medium Vorbereitung Hinweis: Speichern Sie alle Medium bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 2 Wochen. Filter alle Medium für die Sterilisation. <ol><li> Bereiten Sie DMEM / 10% FBS. Mischen Sie 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin. Filter für die Sterilisation. </li><li> Bereiten Sie hES-Medium. Mischen Sie 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 10 ml MEM Minimum essentiellen Aminosäuren Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol und 5 ml Pen / Strep. Nach dem Filtern 10 ng / ml FGF-2 hinzuzufügen. </li><li> Bereiten Sie den KSR-Differenzierungsmedium: Mischen Sie 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Minimum essentiellen Aminosäuren-Lösung und 1 ml β-Mercaptoethanol. Filter für die Sterilisation. </li><li> Bereiten N2-Differenzierungsmedium. Man löst 12 g DMEM / F12 Pulver in 980 ml ​​dH 2 O. Hinzufügen 1,55 g Glucose, 2 g Natriumhydrogencarbonat und 100 mg apo menschliches Transferrin. Mix 2 ml dH 2 O mit 25 mg Humaninsulin und 40 &amp; mgr; l 1 N NaOH; einmal gelöst, die Mischung auf dem Medium hinzuzufügen. 100 l Putrescin dihydrochlorid, 60 ul Selenit, 100 &amp; mgr; l Progesteron. Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 l mit dH 2 O vor der Filterung. </li><li> Bereiten Voll Melanozyten Medium. Kombinieren Sie 50% Neurobasalmedium, 30% Low Glucose DMEM und 20% MCDB201. Zu diesem Add: 0,8% ITS +, 250 nM L-Glutamin, 100 uM Ascorbinsäure (L-AA), 50 ng / ml Cholera-Toxin, 50 ng / ml SCF, 0,05 &amp; mgr; M Dexamethason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Sterilfilter fügen Sie dann verbleibenden Reagenzien: 2% B27 Supplement, 25 ng / ml BMP-4, 3 uM CHIR99021, 500 &amp; mgr; M cAMP. </li></ol></li><li> Beschichtung von Kulturschalen <ol><li> Führen Sie die Beschichtung mit gallertartig Protein wie Matrigel. Beim Öffnen aliquoten und gefrier in Matrigel 1 ml Teile repetitiven Gefrier-Auftau-c zu vermeidenycles. Tauen und eine 1 ml gefrorene aliquote mit 19 ml DMEM / F12 erneut suspendieren. Tafel 5 ml auf eine 10-cm-Schale. Inkubieren des Geschirrs 1 h bei RT. Saugen Sie das gallertartig Protein unmittelbar vor dem Ausplattieren der Zellen und waschen mit DMEM / F12. </li><li> Führen Sie die Beschichtung mit Poly-L Ornithin hydrobromide / Maus Laminin-I / Fibronektin (PO / Lam / FN). Coat Schale mit PBS, das 15 ug / ml Poly-L Ornithin hydrobromide. O / N bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Aspirieren der Lösung und Waschen der Platten mit PBS dreimal vor der Beschichtung mit PBS, das 1 &amp; mgr; g / ml Maus-Laminin-I und 2 &amp; mgr; g / ml Fibronektin enthält. Inkubieren des Geschirrs O / N bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator. <ol><li> Vor der Zellen Plattierung absaugen Lösung und lassen Sie die Platten ohne Deckel in der Gewebekultur Haube gründlich trocknen. Lassen Sie die Platten für etwa 10-15 Minuten trocknen lassen. Hinweis: Die Gerichte sind trocken und bereit für die Zell Plattierung, wenn Kristallstrukturen auf der Oberfläche mit dem Auge erscheinen. Die plates kann mit PBS, das LAM / FN in den Inkubator für zwei Wochen, so lange gehalten werden, wenn die Flüssigkeit nicht verdampft. Die Platten können für einige Stunden bei RT getrocknet gehalten werden. </li></ol></li></ol></li><li> Wartung von hPSCs Hinweis: hPSCs auf 0,1% Gelatine gehalten und mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in hES-Medium. Die Zellen sollten alle 6-8 Tage aufgeteilt werden. <ol><li> Mantel eine 10 cm-Schale mit 0,1% Gelatine in PBS bei RT für 5 min. </li><li> Tauwetter schnell gefroren MEFs in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Aspirieren die Gelatine und die Zellen plattieren. Platte MEFs bei einer Dichte von ~ 50.000 Zellen / cm 2 in DMEM / 10% FBS. Inkubieren MEFs bei 37 ° CO / N vor hPSCs zu addieren. </li><li> Saugen Sie das DMEM / 10% FBS aus der hergestellten MEF Platte, Waschplatte mit PBS und 10 ml hES-Medium mit hPSCs. Passage die hPSCs in einem Verhältnis von 1: 5/10 je nach Dichte vor der Passagierung. Hinweis: Wenn die hPSCs aufgetaut werden, oder als einzelne Zellen agierten, supErgänzung mit 10 &amp; mgr; M Y-27632 dihydrochlorid (Rocki) bis zum ersten Durchgang. </li><li> Feed-Zellen täglich mit frischen 10 ml hES-Medium. </li><li> Vor einer Differenzierung entfernen Sie alle pluripotente Kolonien zu beginnen , die differenzierten Zellen zu enthalten scheinen, unregelmäßige Ränder oder transparente Zentren 28. Mechanisch entfernen und die unregelmäßigen Kolonien mit einer Pipette unter einem Laminar-Flow-Haube mit einem Binokular absaugen. </li></ol></li></ol> 2. Überzug von hPSCs für Differenzierung Hinweis: Differenzierungsbedingungen werden für 10 cm-Schalen beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie 10 cm Matrigel Gerichte vor, die Differenzierung beginnt, wie in Schritt 1.3.1 beschrieben. </li><li> Wenn Plattierung hPSCs für eine Differenzierung beginnen mit einer Platte von hPSCs bei einer Dichte bereit für den Durchgang (~ 80% konfluent) absaugen hES-Medium, Waschen mit PBS und 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA zu den Zellen. </li><li> Kräftig schütteln Sie die Schale horizontally für 2 min, während sie unter dem Mikroskop zu visualisieren, bis die MEFs als einzelne Zellen abheben. Die HPSC Kolonien sollten als Kolonien verbunden bleiben. </li><li> Saugen Sie das Trypsin, nachdem die MEFs abgehoben haben, aber bevor die hPSCs Kolonien lösen. </li><li> 10 ml hES-Medium, das 10 &amp; mgr; M Y-27632 dihydrochloride an der Platte und lösen die Zellen durch Pipettieren nach oben und unten über die Kolonien. </li><li> Saugen Sie das Matrigel-Lösung aus dem in Stufe 10 cm Schale 2.1 und waschen mit DMEM / F12 Klumpen zu entfernen. Platte, die die hPSCs bei einem 1: 2-Verhältnis auf die Matrigel Platte. In hES-Medium, das 10 &amp; mgr; M Y-27632-dihydrochlorid bis 10ml. Inkubieren bei 37 ° CO / N. Hinweis: Dieses Plattieren führen sollte in etwa 100.000 Zellen / cm 2. </li></ol> 3. Die Induktion der Differenzierung neuronaler Anmerkung: Die Differenzierung begonnen werden sollte (Tag 0), wenn die hPSCs 80% konfluent sind. Die Zellen können täglich mit hES-Medium zugeführt werdenmit 10 &amp; mgr; M Y-27632 dihydrochloride die Differenzierung bis Anfang. <ol><li> Am Tag 0 und Tag 1, füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 100 nM LDN193189 und 10 &amp; mgr; M SB431542. </li><li> Am 2. Tag füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 und 3 uM CHIR99021. </li><li> Am Tag 3 füttern die Zellen mit 10 ml KSR-Differenzierungsmedium, das 10 &amp; mgr; M SB431542 und 3 uM CHIR99021. </li><li> An den Tagen 4 und 5 Vorschub die Zellen mit 15 ml von 75% KSR-Differenzierungsmedium und 25% N2-Differenzierungsmedium, enthaltend 3 uM CHIR99021. Hinweis: Verwenden Sie keine große Menge an Zelltod in Form von Floating-Zellen zu sehen, alarmiert werden. Dies ist normal und zu erwarten. </li><li> An den Tagen 6 und 7 Futter die Zellen mit 15 ml 50% KSR-Differenzierungsmedium und 50% N2-Differenzierungsmedium sowohl mit 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3. </li><li> An den Tagen 8und 9-Feed die Zellen mit 20 ml 25% KSR-Differenzierungsmedium und 75% N2-Differenzierungsmedium sowohl mit 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3. </li><li> An den Tagen 9 und 10 PO / Lam / FN Gerichte zubereiten, wie in 1.2.2 für die Wieder Plattierung der Zellen am Tag 11 angegeben. </li><li> Am Tag 10 Vorschub Zellen mit 20 ml von N2-Differenzierungsmedium, enthaltend 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP-4 und 100 nM EDN3. </li></ol> 4. Replattierung in Droplets für die NC-Spezifikation <ol><li> Am Tag 11 absaugen Lam / FN aus den vorbereiteten PO / LAM / FN Platten und vollständig trocknen. </li><li> Entfernen Medium aus den Tag 11 Zellen, Waschen mit PBS und 4 ml Zellablösung Lösung wie Accutase pro 10 cm Schale. bei 37 ° C für 25 min inkubieren. </li><li> 5 ml Voll Melanozyten Medium in die Schale und Resuspendieren der Zellen durch manuelles Pipettieren nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette, bis alle Zellen, die die Platte abgehoben haben. Übertragen Sie die Suspension auf einen 15-ml-Tube. </li><li> Spin theZellen nach unten für 5 min bei 200 xg und die Zellen bei 2 x 10 6 Zellen pro ml in Vollmedium Melanocyte resuspendieren. Zählen Sie die Zellen, die die Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer oder gleichwertige Technik. </li><li> Platte 10 ul Tröpfchen nahe beieinander (ohne sie zu berühren) auf die getrockneten PO / Lam / FN 10 cm Teller. Wenn die Platte ausreichend getrocknet worden ist, haben die Tröpfchen gut sollten Kanten definiert und nicht ausgeführt werden. Hinweis: Dies schafft eine hohe Dichte lokalen Umgebung für die Zellen, was wichtig ist, wenn die Zellen Replattierung, während Raum für Expansion innerhalb der Schale zu halten. </li><li> Lassen Sie die Tropfen für 10-20 min bei RT stehen Zellen zu ermöglichen, haften dann langsam (nicht die anhaftenden Zellen zu stören) 10 ml Voll Melanozyten Medium. Bewegen Gericht in den Inkubator. </li></ol> 5. Ausweitung der Melanozyten Vorläufern <ol><li> Weiter mit Voll Melanozyten Medium Fütterung alle 2 bis 3 Tage. Hinweis: Die Pigmentierung sollte sichtbar sein, beginnen wnnerhalb Cluster von Zellen, die durch das Ende der ersten Woche und sehr klar in der zweiten Woche werden. Sehen Sie sich die Platte über einen weißen Hintergrund wie ein Blatt Papier diese frühen kleinen, dunklen Cluster zu erkennen. Die Zellen werden sich zunehmend pigmentierte im Laufe der Zeit, bis die gesamte Platte gleichmäßig pigmentiert ist (siehe 2B). </li><li> Passage-Zellen einmal pro Woche in einem Verhältnis von ~ 1: 6 (plating als Tröpfchen ist nicht mehr notwendig in dieser Phase). Verwenden Sie Accutase zu Zellen trennen und waschen zweimal mit klarem Neurobasalmedium vor dem erneuten Plattierung in Full Melanozyten Medium. Pflegen Zellen auf PO / LAM / FN-Platten. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die Voll Melanozyten Medium eignet sich am besten für die Erhaltung und den Ausbau hESC und iPS-derived Melanozyten. Jedoch können Zellen in handelsüblichen M254 Medium kultiviert kurz sein, aber die vereinfachte Medien erhöht das Risiko von Zellen sterben und der Platte abheben. </li></ol>

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Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offen zu legen.

Für die erfolgreiche Differenzierung von Melanozyten aus hPSCs sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. In erster Linie ist es wichtig, zu allen Zeiten unter sterilen Kulturbedingungen zu arbeiten. Zusätzlich ist es wichtig, mit pluripotenten zu beginnen, vollständig undifferenzierte hPSCs; wenn die Ausgangspopulation differenzierten Zellen enthält, wird die Ausbeute immer fallen, da die Verunreinigungen nicht in Richtung Melanozyten gerichtet werden und die richtig differenzierenden Zellen noch weit...

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) bieten eine Plattform normale Differenzierung in einer skalierbaren Art und Weise für Krankheitsmodelle, Drogen - Screening zu imitieren, und Zell - Ersatz - Therapien 1-6. Von besonderem Interesse, öffnen hPSCs Wege bis zur Untersuchung von schwer zu isolieren oder seltene / transient Zelltypen, bei denen Patientenproben knapp sind. Darüber hinaus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS - Zellen) können die Forscher die Entwicklung und Krankheitsmodelle bei einem Patienten bestimmte Art und Weise zu studieren 1,2,7-11 einzigartige Mechanismen zu entwirren. Die bisher veröffentlichten Protokoll zur Differenzierung von Melanozyten von hPSCs erfordert bis 6 Wochen von Differenzierungen und werden Zellen mit konditioniertem Medium von L-Wnt3a Zellen 12 kultiviert werden . Das Protokoll zuerst von Mica et al. Und hier beschrieben produziert pigmentierten Zellen in drei Wochen und entfernt die Mehrdeutigkeit und Inkonsistenzen mit konditioniertem Medium verbunden. Melanozyten are von der Neuralleiste abgeleitet, einer wandernden Population von Zellen, die einmalig für Wirbeltiere. Die Neuralleiste wird während der Gastrulation definiert und stellt eine Population von Zellen am Rand der Neuralplatte, an der Grenze zwischen der neuronalen und nicht-neuronalen Ektoderm. Während Neurulation entwickelt sich das Nervengewebe einer neuralen Platte Neuralfalten zu bilden, die an der dorsalen Mittellinie im Neuralrohr 13,14 resultierende konvergieren. Die Neuralleistenzellen ergeben sich aus der Dachplatte des Neuralrohrs, gegenüber dem notochord, und durchlaufen eine epitheliale zu mesenchymale Transition vor der Migration weg zu einer vielfältigen Bevölkerung von differenzierten Zellen zu geben. Die Schicksale der Kammzellen werden zum Teil durch die anatomische Lage der Dachplatte entlang der Körperachse des Embryos definiert. Neuralleistenzellen Derivate umfassen Abstammungslinien charakteristisch sowohl Mesoderm (glatte Muskelzellen, Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten) und Ektoderm Zellen (Melanozyten, Schwann cells, Neuronen) 14. Neuralleiste Stammzellen upregulate den Transkriptionsfaktor SOX10 und durch fluoreszenzaktivierte Zell mit Antikörpern gegen p75 und HNK1 Sortierung isoliert werden. Die Neuralleistenzellen beschieden zu Melanozyten durch eine Melanoblasten Bühne passieren werden und KIT und MITF (Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor) 6,21 MITF upregulate ist ein Hauptregulator der Melanozyten - Entwicklung und ist ein Transkriptionsfaktor , verantwortlich für viel von Melanozyten Entwicklung Controlling 22- 24. Menschliche Melanoblasten wandern in der basalen Schicht der Epidermis, wo sie entweder in den Haaren Ausbuchtung wohnen oder von Keratinozyten in der Epidermis umgeben (Bildung Pigmentierung Einheiten) als Vorläufer für den reifen, pigmentierten Melanozyten zu dienen. Die Differenzierung und Reifung von Melanoblasten in pigmentierten Melanocyten tritt mit der Kolonisierung des Haarzwiebel und die Expression des Melaninproduktion Wegs (TYRP1, TYR, OCA2 Begleit- undPMEL) 25,26. Isolieren von humanen Melanozyten und Melanoblasten von Patienten ist teuer, schwierig und in der Menge zu begrenzen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, hPSCs (induziert oder embryonale) in Melanozyten oder Melanozyten-Vorstufen in einem gut definierten, schnelle, reproduzierbare, skalierbare und kostengünstige Methode ohne Zellsortierung zu unterscheiden. Das Protokoll wurde zuvor verwendet, um krankheitsspezifische Defekte zu identifizieren, wenn iPSCs von Patienten mit Pigmentstörungen zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo humanes Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (B27 Ergänzung)</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>4423</td><td>6 mM</td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>cAMP (cyclicAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Pulver</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (Endothelin-3, human)</td><td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 &mu; M</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>200 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Gelatine (PBS ohne Mg/Ca)</td><td>im Haus</td><td></td><td>0,1% in PBS</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Humaninsulin</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Universal Culture Supplement Premix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (Knockout-Serumersatz)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr>DMEM Invitrogen<td>mit niedrigem Glukosegehalt</td><td></td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel-Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Auflösen 1:20 in DMEM/F12</td></tr><tr><td>MCDB201 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM Minimum essentielle Aminosäuren Lösung</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>embryonale Fibroblasten der Maus (7 Millionen Zellen/Fläschchen)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Maus Laminin-I</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml</td></tr><tr><td>Poly-L Omithin Hydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>0,032 g in 100 ml 100</td></tr>% <tr><td>Ethanol Putrescindihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (rekombinante humane FGF basisch)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (Stammzellfaktor, rekombinant Mensch)</td><td>Peprotech Inc.</td><td>300-07</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>TYRP1 (G-17) Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>TYRP2 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

feeder freie ableitung von melanozyten aus humanen pluripotenten stammzellen

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) stellen eine Plattform dar, um die menschliche Entwicklung in vitro sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu untersuchen. Forscher können die Differenzierung von hPS-Zellen in den interessierenden Zelltyp lenken, indem sie die Kulturbedingungen manipulieren, um die während der Entwicklung beobachteten Signale zu rekapitulieren. Einer dieser Zelltypen ist der Melanozyten, eine pigmentproduzierende Zelle aus der Neuralleiste (NC), die für den Schutz der Haut vor UV-Strahlung verantwortlich ist. Dieses Protokoll stellt eine Erweiterung eines derzeit verfügbaren in vitro Neuralleisten-Differenzierungsprotokolls von hPSCs dar, um NC weiter in vollständig pigmentierte Melanozyten zu differenzieren. Melanozyten-Vorläufer können aus dem Neural Crest-Protokoll angereichert werden, indem sie aktivatoren der WNT-, BMP- und EDN3-Signalübertragung unter dualen SMAD-Hemmbedingungen ausgesetzt werden. Die resultierenden Melanozytenvorläufer werden dann gereinigt und durch Kultur in einem selektiven Medium zu vollständig pigmentierten Melanozyten gereift. Die resultierenden Melanozyten sind vollständig pigmentiert und färben sich entsprechend für Proteine, die für reife Melanozyten charakteristisch sind.

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur effizienten in einem in vitro - Feeder frei, Kosten vollständig pigmentiert, reife Melanozyten aus hPSCs Ableiten und reproduzierbar. Im Gegensatz zu dem zuvor festgelegten Fang et al. Protokoll für HPSC abgeleitetes Melanozyten, wird das umrissenen Protokoll nicht konditionierten Medium erfordern , und verringert den Zeitbedarf. Der Fang et al. Protokoll konditioniertes Medium aus einer Wnt3a produzierenden Maus - Zell...

Diese Arbeit beschreibt ein in vitro Differenzierung Protokoll pigmentiert, reife Melanozyten von menschlichen pluripotenten Stammzellen über einen Neuralleiste und Melanoblasten Zwischenstufe mit einem Zubringer frei, 25 Tage - Protokoll zu erzeugen.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, humane pluripotente Stammzellen in vollständig pigmentierte, reife Melanozyten zu differenzieren. Diese Methode kann dabei helfen, Schlüsselfaktoren während der Melanozytenentwicklung zu identifizieren. Außerdem ermöglicht dieses Protokoll die Identifizierung von Faktoren, die bei der Entstehung von Erkrankungen fehlreguliert sind, sowie das Screening wichtiger Wirkstoffe im Rahmen der Arzneimittelforschung.Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir große Mengen vollständig pigmentierter Melanozyten erzeugen können. Die Isolierung von Melanozyten aus Patienten führt hingegen gewöhnlich zu einer relativ geringen Zellanzahl. Nach dem Aliquotieren und Einfrieren des gallertartigen Proteins tauen Sie ein Milliliter-Aliquot auf und resuspendieren es in 19 Milliliter DMEM f12.Dann geben Sie fünf Milliliter dieser Mischung auf eine einzelne 10-Zentimeter-Zellkultur-Schale. Nachdem mehrere derartige Platten vorbereitet wurden, inkubieren Sie diese eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie anschließend Platten vor, die mit PO, Laminin und Fibronectin beschichtet sind, indem Sie zunächst PBS mit 15 Mikrogramm pro Milliliter PO in eine Kulturschale geben.Anschließend die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Danach die Lösung abpipettieren und die Schalen dreimal mit 1X PBS waschen. Die Beschichtung fortsetzen, indem 10 Milliliter PBS mit einem Mikrogramm pro Milliliter Maus-Laminin 1 und zwei Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin zugegeben werden.Dann inkubieren Sie die Petrischalen wie zuvor beschrieben. Geben Sie zunächst 0,1 % Gelatine in PBS in eine 10 cm große Petrischale und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.Während diese Platte beschichtet wird, gefrorene murine embryonale Fibroblasten oder MEFs in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad geben, um sie schnell aufzutauen. Danach das Gelatine aus der Schale absaugen und die MEFs mit einer Dichte von etwa 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter in DMEM, ergänzt mit 10 Prozent fetalem Kälberserum, ansäen. Nach einer Übernachtinkubation der Schale bei 37 Grad Celsius das Medium absaugen und die vorbereitete MEF-Platte mit 1X PBS waschen.Fügen Sie 10 Milliliter des zuvor hergestellten hESC-Mediums, das humane pluripotente Stammzellen (abgekürzt hPSCs) enthält, einer 10-Zentimeter-Schale hinzu. Nach dem Ansäen der Zellen mit einer Dichte von 5 Millionen Zellen pro Schale inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius in 5 Prozent Kohlendioxid. Füttern Sie die Zellen anschließend täglich mit 10 Milliliter frischem hESC-Medium.Vor Beginn der Differenzierung die Platte auf Kolonien überprüfen, die differenzierte Zellen, unregelmäßige Ränder oder transparente Zentren aufweisen. Unter einem Stereomikroskop in einer Sicherheitswerkbank solche unregelmäßigen Kolonien mit einer Pipette mechanisch ablösen. Um eine Beschichtung mit einem gelatineartigen Protein wie Matrigel durchzuführen, das Protein zuerst in Ein-Milliliter-Aliquots abfüllen und einfrieren, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.Dann tauen Sie ein gefrorenes Aliquot von einem Milliliter auf und resuspendieren es in 19 Milliliter DMEM F12. Geben Sie anschließend fünf Milliliter dieser Mischung auf eine 10-Zentimeter-Schale und inkubieren Sie die Schalen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Danach saugen Sie das gelartige Protein unmittelbar vor dem Ansäen der Zellen ab und waschen mit DMEM F12. Während diese Schale beschichtet wird, wählen Sie eine Schale aus, in der sich hPSCs bei etwa 80 % Konfluenz befinden.Führen Sie das Absaugen des hESC-Mediums durch. Anschließend waschen Sie die Zellen mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS geben Sie drei Milliliter 0,05 %igem Trypsin-EDTA in die Platte.Schütteln Sie die Petrischale energisch horizontal für zwei Minuten, bis unter dem Mikroskop beobachtet wird, dass die MEFs beginnen, sich als einzelne Zellen abzuheben. Während dieses Zeitraums sollten die hPSC-Kolonien an der Platte angeheftet bleiben. Saugen Sie die Trypsinlösung ab, sobald die MEFs abgehoben haben, aber bevor sich die hPSC-Kolonien gelöst haben.Dann 10 Milliliter hESC-Medium, das 10 Mikromolar Y-27632-Dihydrochlorid, einen ROCK-Inhibitor, enthält, der Platte hinzufügen. Anschließend die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren über die Kolonien ablösen. Danach zurück zur Schale mit einem gallertartigen Protein gehen und die Lösung abpipettieren.Waschen Sie diese Schale mit DMEM F12, um eventuelle Klumpen zu entfernen. Dann impfen Sie hPSCs im Verhältnis 1 zu 2 darin an. Geben Sie anschließend hESC-Medium mit 10 Mikromolar Y-27632-Dihydrochlorid bis zu 10 Milliliter in die Platte.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Versorgen Sie die Zellen täglich mit Medium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt wurde. Wenn die hPSCs eine Konfluenz von 80 % erreichen, beginnen Sie die neurale Differenzierung und definieren Sie diesen Zeitpunkt als Tag 0.Beginnen Sie am Tag 0 und Tag 1 die Differenzierung, indem Sie die Zellen mit 10 Milliliter KSR-Differenzierungsmedium versorgen, das 100 Nanomolar LDN-193189, einen Inhibitor von BMP, und 10 Mikromolar SB 431542, einen Inhibitor von Activin und Nodal, enthält. Setzen Sie am Tag 2 fort, indem Sie das Medium durch eines ersetzen, das die gleichen Konzentrationen der BMP- und Activin- und Nodal-Inhibitoren sowie drei Mikromolar CHIR99021, einen Wnt-Agonisten, enthält. Füttern Sie die Zellen dann am Tag 3 mit KSR-Differenzierungsmedium, das nur mit 10 Mikromolar SB 431542 und drei Mikromolar CHIR99021 ergänzt ist.Nachdem eine Mischung aus 75 % KSR-Differenzierungsmedium und 25 % N2-Differenzierungsmedium hergestellt wurde, das außerdem drei Mikromolar des Wnt-Agonisten enthält, die Zellen am Tag 4 und 5 mit 15 Millilitern dieser Flüssigkeit versorgen. Danach die Zellen an den Tagen 6 und 7 mit 15 Millilitern Medium versorgen, das aus 50 % KSR-Differenzierungsmedium und 50 % N2-Differenzierungsmedium besteht und außerdem mit drei Mikromolar CHIR99021, 25 Nanogramm pro Milliliter BMP4 und 100 Nanomolar EDN3 ergänzt wurde.Anschließend die Zellen am 8. und 9. Tag mit 20 Milliliter 25 % KSR-Differenzierungsmedium und 75 % N2-Differenzierungsmedium versorgen, das mit den gleichen Konzentrationen an Faktoren ergänzt ist wie am 6. und 7. Tag. Am 10. Tag fortfahren mit der neuronalen Differenzierung, indem die Zellen mit 20 Milliliter N2-Differenzierungsmedium versorgt werden, das drei Mikromolar CHIR99021, 25 Nanogramm pro Milliliter BMP4 und 100 Nanomolar EDN3 enthält. Am 11. Tag die Lösung von Schalen abpipettieren, die zuvor mit PO Laminin 1 und Fibronectin beschichtet wurden.Anschließend die Platten ungefähr 10 bis 15 Minuten lang unbedeckt in einer Zellkulturhaube belassen, damit sie vollständig trocknen können. Danach das Medium von den Zellen des Tags 11 entfernen und diese mit PBS waschen. Anschließend vier Milliliter Zell-Detachierungslösung in die Petrischale geben und 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation fünf Milliliter vollständiges Melanozytenmedium in die Petrischale geben und die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren manuell resuspendieren, bis sie sich von der Platte gelöst haben. Die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen fünf Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Nach der Zellzählung mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode und eines Hämozytometers die Zellen in vollem Melanozytenmedium mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren.Tragen Sie 10 µL-Tropfen der Zellsuspension auf die getrockneten, beschichteten Schalen auf. Achten Sie darauf, dass die Tropfen nahe beieinander, aber nicht berührend liegen, scharf begrenzte Ränder aufweisen und nicht verrinnen. Um den Zellen das Anheften zu ermöglichen, lassen Sie die Tropfen 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Danach langsam 10 Milliliter vollständiges Melanozytenmedium der Schale hinzufügen, wobei darauf geachtet werden muss, die angehefteten Zellen nicht zu stören. Anschließend die Schale in den Inkubator stellen. Die Zellen alle zwei bis drei Tage mit vollem Melanozytenmedium versorgen.Und erwarten Sie, dass sich bis zum Ende der ersten Woche Pigmentierung in Zellclustern zeigt. Passagieren Sie die Zellen einmal pro Woche, indem Sie sie zunächst wie zuvor beschrieben mit einer Zellablösungslösung behandeln. Nach dem Sammeln und Zentrifugieren waschen Sie die Zellen zweimal mit reinem Neurobasal-Medium.Anschließend die Zellen im Verhältnis 1 zu 6 in vollem Melanozytenmedium auf mit PO, Laminin 1 und Fibronectin beschichteten Platten erneut aussäen. Nach etwa 30 Tagen Differenzierung erscheinen die Zellen stark pigmentiert, was sich leicht visualisieren lässt, wenn sie bei hoher Dichte ausgesät oder beim Passagieren pelletiert werden.Hier ist ein Helligkeitsfeldbild von Zellen einer transgenen psox10-GFP-humane embryonalen Stammzelllinie dargestellt, die bis zum 11. Tag des beschriebenen Differenzierungsprotokolls kultiviert wurden, bevor die Zellen erneut ausplattiert wurden. In diesen Kulturen sind dunkle, gut definierte Zellränder erkennbar. Bei der Untersuchung dieser Kulturen auf das GFP-Signal zeigte sich eine Anreicherung sox10-positiver Zellen in den dunklen Rändern.Da sox10 ein Transkriptionsfaktor ist, der von neuralen Crest-Stammzellen hochreguliert wird und in Melanoblasten erhalten bleibt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass durch die Differenzierungsmethode am Tag 11 Zellen angereichert wurden, die letztendlich zu Melanozyten führen werden. Als Beleg hierfür enthielten die Kulturen am Tag 20 unpigmentierte, reifende sowie vollständig reife pigmentierte Melanozyten. Am Tag 25 wurden in den Kulturen die gleichen Zelltypen beobachtet.Das Vorhandensein ausreifender und pigmentierter Melanozyten in diesen Präparationen wird durch Färbung mit zwei Proteinen nachgewiesen, die an der Melaninproduktion beteiligt sind. TYRP2, das als Marker sowohl für Melanoblasten als auch für Melanozyten dient, und TYRP1, ein Marker für Melanozyten im späten Reifestadium, der hier nur in pigmentierten Melanozyten exprimiert wird. Sobald die Methode beherrscht ist, kann dieses Protokoll verwendet werden, um humane pluripotente Stammzellen innerhalb von 25 Tagen zu vollständig pigmentierten, reifen Melanozyten zu differenzieren.Das Protokoll verläuft über die normale Melanozytenentwicklung, indem es zunächst den neurokrestalen Zustand und auch das Melanoblastenstadium durchläuft.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit...

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Dieses Papier berichtet, dass die Zugabe von Y-27632 zu TIVA Medium kann die Ausbeute von Melanozyten aus erwachsenen Hautgewebe deutlich erhöhen.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Erfahren Sie die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu reifen Melanozyten durch neuronale Kamm- und Melanoblasten-Stadien. Diese Methode ermöglicht die großskalige Produktion pigmentierter Zellen für die Erforschung von Hautpigmentierungsstörungen und die Arzneimittelentwicklung.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

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