Name: Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie man nasale Epithelzellen von Kindern kultiviert und zu iPSCs umprogrammiert. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht Asthma-Forschung und Untersuchungen zu Atemwegserkrankungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten die pluripotente Stammzelle der Einrichtung und dem konfokalen Imaging-Core in Cincinnati Kinderkrankenhaus anzuerkennen. Diese Arbeit wurde von R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) und 2U19AI70235 (GKKH) unterstützt.

Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien der Organe menschlichen Ausschuss Forschungsethik. 1. Probenahme der Nasenschleimhaut HINWEIS: Sie erhalten Proben von Probanden, die frei von Anzeichen einer Atemwegsvirusinfektion sind. <ol><li> Bereiten Sie eine 15 ml konischen frisch vor dem Teilnehmer besuchen und 2 ml BEGM (Bronchial Epithelzellwachstum Medium) plus 20 ul sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> Offene Zytologie Bürste kurz vor der Entnahme der Probe, und achten Sie darauf, Pinsel steril zu halten und berühren Sie es nicht zu irgendwelchen Oberflächen neben den Nasenflächen. </li><li> Fragen Sie Teilnehmer, still zu sitzen und den Kopf kippen in Richtung Decke. Haben kleinere oder unruhiger Kinder sitzen auf ihren Händen und / oder Liegen weg swatting Bürste zu vermeiden. </li><li> Richten Sie Pinsel auf der Rückseite der Nase, wo der Durchgang (Sieht aus wie ein kleines schwarzes Loch) verengt. Schieben Sie Bürste nach unten und drehen Sie die Handgelenke wie die Bürste aus nostri entferntl. </li><li> Legen Sie Pinsel in konisch und versenken in BEGM. Das überstehende Bürste und ersetzen Kappe auf dem Rohr. NICHT VORTEX. HINWEIS: Wenn der Teilnehmer bereit ist, eine zweite Bürste in der gleichen Weise erhalten, aber in der zweiten Nasenloch. ein Bürsten der beiden Nüstern Gewinnung führt zu einer höheren Wahrscheinlichkeit zur Folge haben, dass die Probenahme erfolgreich sein wird. die gleiche Nasenloch Probenahme kann zu Blutungen und wird wahrscheinlich nicht um die Probe zu verbessern. </li><li> Halten Proben so nahe 37 ° C wie möglich während des Transports einen Becher mit warmem Wasser. </li></ol> 2. Zellzahl und Cytospin <ol><li> leicht bewegen Sie die Bürste in BEGM und 10 ul der Probe für eine Zellzahl nehmen einen Hemacytometer verwenden. In 10 ul einer Live / Dead-Fleck und zählen nur Zellen unter einem Mikroskop leben. </li><li> Bis zu 50 &amp; mgr; l der Probe und mit Wasser auf 200 ul mit 1x PBS. In den Cytospin Trichter an Glasobjektträger und Spin bei 300 Umdrehungen pro Minute für 2 min. Lassen Sie gleiten trocken O / N und Flecken Rutsche following Anweisungen des Herstellers. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zu trocknen. </li><li> Stain Slide mit Hema 3 Stain <ol><li> Bringen Sie jede Lösung (Hema Fixiermittel, hellblau; Hema 3 Lösung I, rosa und Hema 3 Lösung II, tiefblau) in eine Färbung Schale; Halten bedeckt, wenn sie nicht in Gebrauch ist. Legen Sie Dias in Färbesystems Boot </li><li> Dip Slides kontinuierlich in Fixiermittel für 30 Sekunden, dann lassen Überschuss ablaufen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung I für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung II für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen </li><li> Spülen mit VE-Wasser, bis das Wasser klar bleibt. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zum Trocknen </li></ol></li><li> Schauen Sie sich Schlitten unter dem Mikroskop und Zählen von Zellen bestimmen Prozentsatz von Epithelzellen. Sollte 90% oder mehr, wenn Probenahme gut ist. </li></ol> 3. Seeding Zellen HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren in einem richtigen und zertifizierten GewebekulturKapuze mit steriler Technik. <ol><li> Coat-Platten mit Rinderhautkollagen (BDC), Typ 1. In 0,5 ml 3 mg / ml BDC verdünnt in 49,5 ml 1x PBS. Bereiten weniger, wenn nur wenige Platten verwendet. Mantel eine T25-Flasche mit 2 ml BDC und Inkubation in sterile Haube O / N oder bei 37 ° C für 2 Stunden, falls erforderlich. </li><li> Nach der Inkubation aspirieren jede verbleibende Flüssigkeit. Expose Flaschen mit UV-Licht für 30 Minuten in sterilen Haube. Shop-Flaschen für bis zu einem Monat bei 4 ° C, aber bringen sie auf RT oder 37 ° C, bevor Zellen Aussaat. </li><li> Halten Sie Bürste und Zellen in BEGM bei 37 ° C, bis sie bereit zu säen. Leicht Swish Bürste innen konisch, aber nicht vortexen. <ol><li> Platte 7 x 10 5 Zellen in einem T25 - Kolben. Wenn es weniger ist, verwenden Sie einen kleineren Behälter, wie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Diese Größe Platte erfordert etwa 3 x 10 5 Zellen. HINWEIS: Wenn es nicht so viele Zellen sind, ist es nicht ratsam ist, fortzusetzen. </li></ol></li><li> Unter einer sterilen Haube nehmen Bürste aus Rohr und gently drehen Bürste auf der Oberfläche des beschichteten Kolben, darauf achten, daß die Beschichtung zu kratzen. Entsorgen Sie Bürste in einem geeigneten Behälter für biologischen. </li><li> Langsam Pipette die restlichen Zellen in BEGM aus dem konischen und in den T25-Flasche. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Eine Anzahl von schwimmenden Zellen wird beobachtet werden , und es kann einige Trümmer von der Nase sein, die in dieser Stufe (3A) akzeptabel ist. </li></ol> 4. Zellkultur <ol><li> Nachdem die Zellen Aussaat, lassen Sie sie für 48 Stunden ohne Unterbrechung (Abbildung 3) zu begleichen. Nach 48 Stunden, fügen Sie langsam und vorsichtig 2 ml warmem BEGM und 20 ul sterile penicilin / Streptomycin / Fungizone (P / S / F). HINWEIS: NICHT die ursprünglichen 2 ml Medium absaugen. </li><li> Am 4. Tag nach der Aussaat, sorgfältig alle Flüssigkeit absaugen und ersetzen mit 4 ml frisch, erwärmt BEGM und 1x Pen / Strep (Fungizon ist nicht mehr erforderlich). Ändern Medien alle zwei Tage und bewerten Zellen anhängenment, das Wachstum und Zusammenfluss. Wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Wochen, sind sie bereit, agiert werden. </li><li> Einem T25 - Kolben (etwa 2,5 x 10 6 Zellen , wenn sie konfluent) in drei T25 Kolben oder einem T75 - Kolben passagiert werden. Nach dem ersten Durchgang sollten die Zellen robust und gesund sein, Einmündung etwa alle drei Tage zu erreichen. </li></ol> 5. Passagierung Zellen <ol><li> aspirieren vorsichtig die Medien von der Platte. 1 ml 0,05% Trypsinlösung pro T25-Flasche an der Platte und in den Inkubator für etwa 4 min, oder bis die Zellen lösen sich von Platte. Überprüfen Sie die Höhe der Ablösung von Zellen alle 2 Minuten und nicht verlassen Trypsin auf mehr als 10 min. </li><li> 5 ml Trypsin-Neutralisationslösung (TNS) oder serumhaltigen Medien das Enzym zu neutralisieren. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und Zellen aus dem Kolben und in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 200 xg (Beschleunigung 0 Verzögerung 0) für 5 min ein Zellpellet zu erhalten. absaugen supernatant und resuspendieren Zellen in BEGM + P / S in dem Volumen für die neuen Flaschen erforderlich (4 ml für einen T25-Kolben wurden 10 ml für einen T75-Kolben) </li><li> Führen Zellzahl mit einem Live / Dead-Fleck wie oben (2.1) beschrieben. Fügen Sie entsprechende Menge an BEGM und Zellen zu den beschichteten Kolben und zurück in den Inkubator. Halten , wie detaillierter oben oder Kryokonservierung Medium (70% BEGM, 20% FBS und 10% DMSO) in einer Konzentration von 0,5-2 x 10 6 Zellen pro ml in einfriert. </li></ol> 6. Umprogrammierung zu iPS-Zellen HINWEIS: Vor dem iPSCs Erzeugung gewährleisten die Einhaltung aller institutionellen Regelungen, die Erzeugung und Verwendung von menschlichen iPS-Zellen gelten. Sterile Technik ist besonders wichtig für iPSC Kulturen, als Kulturmedium routinemßig keine Antibiotika enthalten. Es ist wichtig, dass NECs scheinen gesund und kräftig sind proliferative für erfolgreiche Neuprogrammierung. <ol><li> Tafel 5 x 10 5 NECs pro Vertiefung einer 6 - Well - Gewebekulturplatte. Nach 24 Stunden hinzufügen Polybrenzu BEGM bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml und transduzieren NECs durch lentivirale Partikel exprimieren Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc zu den Medien hinzugefügt wird. Richten Sie eine Vielzahl der Infektion (MOI) von ~ 5 27 zu erreichen. <ol><li> Um das MOI Bestimmung, bereiten serielle Verdünnungen der konzentrierten-lentiviralen Lager und HT1080-Zellen mit diesen Verdünnungen transduzieren. Nach dem ersten, durch die Bewertung der Anzahl von dTomato-positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen in jeder Verdünnung die Anzahl der &quot;transduzierenden Einheiten / ml&quot; unzweideutig Detektion dTomato Expression in den HT1080-Zellen, zu berechnen. HINWEIS: In der Regel wird es Verdünnungen sein, die zu hoch sind (alles ist dTomato positiv) und zu niedrig (kein oder nur ein paar positive Zellen). </li><li> Führen Sie Scoring aus den Verdünnungen, in denen diskrete positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen identifiziert. Bestimmen des Titers durch die Anzahl der Korrektureinheiten / ml mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor transduzieren. MOI ist dann das Verhältnis der Zahlvon 27 Zellen auf die Anzahl von Viruspartikeln transduziert. HINWEIS: Jede dTomato positive Zelle / kleine Klumpen wird angenommen, aus einem einzigen Viruspartikel entstehen. </li></ol></li><li> Etwa 3 Stunden nach der Transduktion, entfernen Medien und ersetzen mit frischen BEGM. Entsorgen Sie Lentiviren haltigen Medien mit institutionell genehmigten Verfahren. Zurück transduzierten NECs in den Inkubator für 3 Tage. </li><li> Am Tag 3 ersetzen Medien mit frischen BEGM und dann für weitere 3 Tage inkubiert. Absaugen verbrauchte Medien, Zellen mit 1x PBS waschen und 1 ml 0,05% Trypsinlösung zum Brunnen hinzuzufügen. Passage-Zellen mit Trypsin, wie oben (Abschnitt 5) geschrieben. vorsichtig absaugen Überstand und resuspendieren Zellen in 4 ml BEGM + P / S. Die Zellen können zu einer neuen Vertiefung einer 6-Well-Platte mit BDC oder hinzugefügt, um MEF Kulturen, wenn bereit (siehe nächster Schritt) beschichtet agiert werden. </li><li> Bereiten Sie MEF-beschichtete Platten. Am Tag 4 0,1% Gelatine-Lösung (1 ml / Well) bis 2 Vertiefungen einer 6-Well hinzufügen (auszuführen +/- Thiazovivin (SPT) siehe Schritt 6.6). Auf der nächstenTag, ein Fläschchen mit inaktivierten MEF 28 aufzutauen. </li><li> Platzieren MEFs in 10 ml MEF Medien (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Spin bei 200 xg für 5 Minuten zu pelletieren. Resuspendieren in MEF Medien. Absaugen Gelatine aus 6 - Well - Platte und fügen 1,87 x 10 5 MEFs pro Vertiefung der Gelatine beschichtete 6 - Well - Platte. O / N bei 37 ° C inkubieren, oder für mindestens 24 Stunden. </li><li> Transfer 2 ml BEGM enthaltenden Zellen transduziert pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer zuvor beschichteten 6-Well-Platte und Inkubation O / N. Am nächsten Tag, ersetzen BEGM mit 2,5 ml pro Vertiefung von Standard hESC Medien mit 4 ng / ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Feed-Zellen mit frischen hESC Medien +/- SPT täglich für 10 Tage HINWEIS: Es ist möglich , einen Cocktail aus kleinen Molekülen (SB431542, PD0325901 und Thiazovivin (SPT) Cocktail) hinzuzufügen , für NECs 23 , um die Effizienz und die Kinetik der Reprogrammierung zu verbessern. </li><li> Nach zehn Tagen weiterhin täglich mit hESC Medien ohne SPT zu ernähren. Feed-Kulturen täglich bis hESC artige Kolonienerscheinen (5A, P0 Kolonie). Identifizieren Kolonien mutmaßliche iPSCs durch ihren hohen Kern: Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen. </li><li> Manuelles Verbrauch und Transfer Kolonien mit hESC förmige Morphologie zu trennen Brunnen für Kultur und Expansion als separate Leitungen in einem Zubringer freies System. Abgeschnittene Kolonien sollten sich schnell an diese Bedingungen angepasst werden. <ol><li> Nach dem Plattieren exzidiert Kolonien werden diese diskreten putative iPSC Linien nun Passage betrachtet 1 (p1). Futterkulturen täglich mit mTeSR1. Passage und erweitern iPSC Linien unter Verwendung von Standardverfahren. Es kann mehrere Tage bis zu einer Woche dauern, p1 Kolonien, die Größe zu erreichen, an dem sie agiert werden soll. </li></ol></li></ol> 7. Die Aufrechterhaltung iPSCs in Kultur <ol><li> Düngung und bewerten Kulturen täglich. Manuelle Verbrauchsbereiche mit einem sterilen Glaspipette oder Mikropipette durch Schaben Spitze offenkundige Differenzierung zeigen. Ändern Medien nach der täglichen Kommissionierung. </li><li> Passage-Zellen nach der Angleichungpro Vertiefung einer 6-Well-Platte (die Hälfte der Fütterung Volumen), dann bei 37 ° C für ca. 4 min vorsichtig absaugen Medien, 1 ml warmem Dispase (1 mg / ml) hinzu: dig alle vier Tage. Die Ränder der Kolonien beginnen, zu heben, die um die Kolonie wie ein weißer Umriss aussieht. aspirieren vorsichtig die Dispase und wasche 3x mit erwärmtem DMEM / F12. </li><li> 2 ml mTeSR1 und verwenden Sie einen Zellheber, die Kolonien von der Platte zu heben. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette oder P1000 Mikro sanft um die Zellen zu verreiben, bis die Kolonien in kleinere Cluster gebrochen werden. <ol><li> Vermeiden Sie sehr kleine Cluster oder einzelnen Zellen produzieren, als das Überleben und die anschließende Proliferation wird suboptimal sein. Wenn Kolonien wieder Plattierung, ein 1: 4 bis 1: 6 Split wird eine optimale Kolonie Dichte aufrechtzuerhalten. Sanft Kolonien und Medien von der Platte zu entfernen und zu neuen, Matrigel beschichteten Vertiefungen hinzuzufügen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Nasale Epithelzellen (NECs) sind eine leicht zugängliche Plattform für Atemwegserkrankungen zu studieren und NEC-iPS - Zellen bieten einen spannenden Weg die Entwicklung der Krankheit, Behandlung und Therapie 1,31,32 zu erkunden. NECs kann leicht ohne stressig oder potenziell schädlichen Verfahren 6,23 erhalten werden. Unserer Erfahrung nach der Probenahme der Nasenschleimhaut, wie in diesem Protokoll beschrieben wird weniger Stress und besser als die Blutentnahme für Kinder wahrgenommen werden. Da...

Induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen Proben (hiPSCs) sind eine sich schnell entwickelnde Technologie der Stammzellforschung. Sie bieten eine Alternative zu embryonalen Stammzellen (hES) Forschung mit weit weniger ethischen und moralischen Nachteile 1,2. Obwohl sie zu hESCs 3-5 nicht epigenetically identisch sind, bieten eine einzigartige Möglichkeit hiPSCs Entwicklung und Krankheit Phänotypen zu modellieren, und sie können 5-8 aus Geweben mit Bezug auf die Krankheitszustand ableiten. Neue Methoden der Erzeugung von hiPSCs ständig erforscht werden optimale Zelltypen zu identifizieren , als eine Möglichkeit , mit zu beginnen, GMP-Qualität iPSCs für eine Transplantation geeignet, die Vorbereitung und auch 6,9-11 die Aktualität und Effizienz der Reprogrammierung zu erhöhen. Epithelzellen der Atemwege sind kritisch für die Entwicklung von allergischen Entzündung 12 und das Epithel ist ein Haupttreiber von allergischen Reaktionen und Atemwegs Remodeling durch Interaktion mit Immune und Stromazellen. Das Atemwegsepithel spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Persistenz von Lungenerkrankungen wie Asthma. Jedoch niedriger Epithelzellen der Atemwege sind schwierig in einer klinischen Umgebung, insbesondere von gesunden Kontrollpatienten und Kinder zu erhalten. Daten aus mehreren Studien unterstützen die Annahme , dass Epithelzellen aus Nasenschleimhaut sind ein gültiger und praktische Proxy für niedrigere Epithelzellen der Atemwege 13-20, vor allem , wenn Antworten auf Luftschadstoffe und Allergene zu studieren. Die Nasenschleimhaut besteht aus mehr als 90% ciliated Epithelzellen der Atemwege und Probenahme diese Nasenepithelzellen (NECs) leicht bei Kindern im Alter von vier Jahren oder fünf durchgeführt werden, da sie weniger invasiv als andere Zell- / Gewebeprobenahmetechniken und ist im Zusammenhang mit einem minimalen Risiko von unerwünschten Ereignissen wie Infektionen 20-23. Es bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, sowohl bei gesunden und kranken Kindern ohne lange, unnötige und oft schmerzhaft Bronchoskopie procedu zu probierenres, die Sedierung erforderlich machen. Frühere Studien haben festgestellt , dass Krankheit Asthma Schwere verwandte Subtypen können die Nasenschleimhaut in sowohl als auch Proben bronchial Zelle von asthmatischen Kindern genommen unterschieden werden, und der Genexpression zwischen den beiden Gewebetypen war ähnlich in etwa 90% der nicht-ubiquitären Gene 22 , 24. Als Quelle für iPSCs, NECs bieten Vorteile gegenüber anderen Zelltypen häufig verwendet. Fibroblasten werden häufig für iPSC Erzeugung verwendet, aber obwohl diese Zellen leicht kultiviert, aus einer Hautbiopsie sein kann, dieser Vorgang erfordert typischerweise Lokalanästhesie, einen Einschnitt und Nähten ist und mit einem gewissen Infektionsrisiko verbunden. Daher kann für diese Art der Biopsie von Patienten informierte Einwilligung schwierig sein 25. Eine Alternative zu Fibroblasten ist peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Jedoch kann es schwierig sein, ausreichend Blut für iPSC Generation von pädiatrischen Patienten zu erhalten. Darüber hinaus gibt es Einschränkungen nachgeschalteter apkationen für Fibroblasten und Blutzellen abgeleitet iPSCs, vor allem ihre Differenzierungsfähigkeit auf bestimmte Zelltypen 5,26. Daher die relative Zugänglichkeit und der geringen Gefahr von Nebenwirkungen im Anschluss an ihre Sammlung gegeben, NECs stellen eine ideale Zellquelle für iPSC Generation von pädiatrischen Populationen. iPS-Zellen haben für das Studium der menschlichen Entwicklung, Herstellung neuer Krankheitsmodelle, und als eine potenzielle Quelle von Zellen für personalisierte Therapien eine Menge Aufmerksamkeit vor kurzem als Plattform erhalten. Bevor das volle Potenzial dieser Technologie realisiert werden kann, müssen die molekularen Grundlagen der Umprogrammierung aufgeklärt werden, aber jetzt dieses Protokoll und die im beschriebenen Verfahren werden die Forschung Studien konzentrierten sich auf Atemwegs Belichtungen aufzuklären, sowie eine Plattform für die Auswirkungen der personalisierten Medizin zu studieren Beteiligung iPSCs. Die gemeinsame Arbeit von mehreren Labors hat zur gene geführtn für eine erfolgreiche Technik nicht nur für die Nasenschleimhaut Abtastung, sondern auch NECs Züchten und Umprogrammieren diese Zellen zu iPSCs 23. Dieser Artikel gibt einen Überblick über ein Protokoll für eine optimale Probenahme, Züchtung und Neuprogrammierung Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>15 ml konisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protokoll Schritt 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protokoll Schritt 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungizid</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protokoll Schritt 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protokoll Schritt 4.a.</td></tr><tr><td>Cytosoft Zytologiebürste</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protokoll Schritt 1.2.</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protokoll Schritt 2.1.</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protokoll Schritt 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>Zytologie-Trichter-Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin-Trichter</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>Leerer Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 Färbeset</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protokoll Schritt 2.2.</td></tr><tr><td>Rinder Dermal Colagen, Typ 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protokoll Schritt 3.2.</td></tr><tr><td>T25 Flasche</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protokoll Schritt 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protokoll Schritt 5.2.</td></tr><tr><td>Trypsin-Neutralisationslösung</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protokoll Schritt 5.2.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS), hitzesterilisiert bei 65 μde; C für 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protokoll Schritt 5.5.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid Hybri-Max, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Hybridome, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protokoll Schritt 5.5.</td></tr><tr><td>polycistonisches Lentivirus*</td><td>z.B. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protokoll Schritt 6.4.&nbsp; Eine kommerzielle Quelle für die Reprogrammierung von Vektoren ist aufgeführt. Wir verwenden routinemäßig das von Voelkel et al. berichtete 4-in-1-Plasmid (PMID: 20385817), um VSV-G-pseudotypisiertes polycistronisches Reprogrammierungslentivirus im eigenen Haus zu generieren. Dieses Plasmid kann durch Kontaktaufnahme mit &nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-134220</td><td>Protokoll Schritt 6.4.</td></tr><tr><td>Bestrahlte CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>GSC-6301G-Protokoll</td><td>Schritt 6.4.</td></tr><tr><td>hESC-Medien</td><td>Siehe Rezept im Protokoll</td><td></td><td>Protokoll Schritt 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protokoll Schritt 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protokoll Schritt 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protokoll Schritt 6.11.</td></tr><tr><td>hESC-qualifiziertes Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protokoll Schritt 6.13.</td></tr><tr><td>Corning-Platte, 6 Well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protokoll Schritt 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protokoll Schritt 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml Einweg-Filterkolben (0,22 &Mikro; m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protokoll Schritt 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protokoll Schritt 7.3.</td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protokoll Schritt 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protokoll Schritt 6.11. Komponenten sollten gemischt und anschließend filtriert werden. Medien können bei 4 Grad aufbewahrt werden; C für bis zu zwei Wochen. Beim Erwärmen von Medien nicht bei 37 ° C belassen; C länger als 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 Medien</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Endkonzentration</td></tr><tr><td>KO-Ersatzserum (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0,2</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoethanol Invitrogen</td><td></td><td>21985-023</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>100x nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 & micro; g/ml Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

pflegen primäre nasenepithelzellen von kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente stammzellen

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasenepithelzellen (NECs) sind der Teil der Atemwege, der auf Luftschadstoffe reagiert und sind die ersten Zellen, die mit Atemwegsviren infiziert sind. Sie sind auch an vielen Atemwegserkrankungen durch ihre angeborene Immunantwort und die Interaktion mit Immun- und Atemwegsstromazellen beteiligt. NECs sind aufgrund ihrer Zugänglichkeit während klinischer Besuche für Studien an Kindern von besonderem Interesse. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden aus mehreren Zelltypen gewonnen und sind ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung der menschlichen Entwicklung und Krankheit sowie für ihre potenziellen Anwendungen in der regenerativen Medizin. Dies ist das erste Protokoll, das Methoden für die erfolgreiche Generierung von iPSCs aus NECs von pädiatrischen Teilnehmern zu Forschungszwecken festlegt. Es wird beschrieben, wie Nasenepithelzellen von Kindern gewonnen werden, wie aus diesen Proben primäre NEC-Kulturen generiert werden und wie primäre NECs in gut charakterisierte iPSCs umprogrammiert werden. Nasenschleimhautproben sind nützlich für epidemiologische Studien im Zusammenhang mit den Auswirkungen der Luftverschmutzung bei Kindern und stellen ein wichtiges Instrument zur Untersuchung von Atemwegserkrankungen dar. Primäre Nasenzellen und daraus gewonnene iPSCs können ein Werkzeug sein, um unbegrenztes Material für die patientenspezifische Forschung in verschiedenen Bereichen der Epithelbiologie der Atemwege, einschließlich der Asthma- und COPD-Forschung, bereitzustellen.

Der erste Teil der Nase, der Nasenvorhof genannt wird , ist der Bereich von Knorpel umgeben 29. Die Bürste muss glatt gehen vorbei diesem Bereich der Nase, über die Nasenklappe (Ostium internum oder das &quot;schwarze Loch&quot; auf der Rückseite des Nare zu sehen ist ), und die Probe wird von der unteren Nasenmuschel (Abbildung 1) erhalten. Die Nasenmuscheln sind knöcherne Strukturen, die die Oberfläche der Nase 29, so dass sie eine ideale Lage für...

Diese Veröffentlichung demonstriert Methoden zur erfolgreichen Probenahme und Kultivierung der Nasenepithelschleimhaut von Kindern und zur Reprogrammierung dieser Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs).

Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus Kindern gewonnene nasale Epithelzellen zu kultivieren und in induzierte pluripotente Stammzellen umzu programmieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Atemwegserkrankungen zu beantworten, beispielsweise wie Asthma entsteht. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Atemwegsepithelzellen von Kindern ohne belastende Eingriffe gewinnt.In der Kultur bilden diese eine homogene Population und stellen eine hervorragende Quelle zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen oder iPSCs dar. Die Idee zu dieser Studie entstand, als wir mit den Ärzten Ji und Hershey über ihre Untersuchung zum Sammeln meso-epithelialer Zellen von Kindern zur Erforschung epigenetischer Variationen bei Asthma und Luftverschmutzung sprachen.Die visuelle Demonstration dieser Techniken ist entscheidend, da die nasale Probenentnahme und die Umprogrammierung nasaler Epithelzellen zu iPSCs schwierige Techniken sind, die auf persönlicher Erfahrung und nicht auf etablierten Protokollen beruhen. Vor dem Besuch des Probanden überführen Sie zwei Milliliter frisches bronchiales Epithelwachstumsmedium, abgekürzt BEGM, in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter einer Mischung aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B zu diesem Medium, um eine Endkonzentration von 0,01 % zu erreichen. Wenn der Proband eintrifft, weisen Sie ihn an, sich auf einen Stuhl zu setzen.Öffnen Sie dann unmittelbar vor der Probenentnahme eine Zytologiebürste und berühren Sie sie nicht mit irgendwelchen Oberflächen, um sicherzustellen, dass sie steril bleibt. Weisen Sie die Versuchsperson anschließend an, ruhig sitzen zu bleiben und den Kopf nach oben zur Decke zu neigen. Falls sie unruhig ist, lassen Sie sie auf ihren Händen sitzen, damit sie nicht versucht, die Bürste wegzuschlagen.Als Nächstes führen Sie die Bürste bis zum hinteren Teil der Nase, wo der Durchgang sich verengt, und bringen Sie sie dort ein. Danach nehmen Sie die Bürste durch eine Drehbewegung des Handgelenks aus dem Nasenloch heraus, indem Sie sie nach unten gleiten lassen. Anschließend platzieren Sie die Bürste in das zuvor vorbereitete kegelförmige Gefäß und stellen sicher, dass sie vollständig in BEGM eingetaucht ist.Schneiden Sie dann den überschüssigen Teil des Bürstchens ab und verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe. Nach der Probenentnahme sollte diese sofort in einen Becher mit warmem Wasser gestellt werden, um eine Temperatur von möglichst nahe bei 37 Grad Celsius aufrechtzuerhalten. Anschließend transportieren Sie die Probe ins Labor. Im Labor wird der Tupfer vorsichtig im BEGM bewegt. Anschließend entnimmt man 10 Mikroliter der Probe und gibt 10 Mikroliter einer Live/Dead-Zellfärbung hinzu. Danach wird diese Mischung auf ein Hämozytometer aufgebracht.Und zählen Sie unter dem Mikroskop nur die lebenden Zellen. Nach der Zellzählung entnehmen Sie 50 Mikroliter der Probe und verdünnen diese durch Zugabe von 1X PBS auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern. Überführen Sie den restlichen Teil der unverdünnten Zellmischung zusammen mit dem Pinsel in ein temperaturgeregeltes Wasserbad mit 37 Grad Celsius, bis die Zellen ausgesät werden.Fügen Sie die mit PBS verdünnte Probe einem Zytospin-Trichter hinzu, der an einem Objektträger befestigt ist. Zentrifugieren Sie die gesamte Vorrichtung anschließend zwei Minuten lang mit 400 U/min. Danach entfernen Sie den Trichter und lassen den Objektträger über Nacht im Dunkeln trocknen.Nach der Färbung des Objektträgers mit Hema 3, wie im textbasierten Protokoll beschrieben, unter dem Mikroskop untersuchen und die Zellen zählen. Epithelzellen anhand ihrer charakteristischen Merkmale identifizieren: einer zylindrischen Form, Cilien und einem runden Kern, und den Prozentsatz dieser Zellen in der Präparation bestimmen.Um mit der Aussaat zu beginnen, schwenken Sie den Pinsel vorsichtig innerhalb eines zertifizierten Zellkulturwerkes in der Konischflasche und nehmen Sie ihn anschließend aus dem Röhrchen heraus. Danach drehen Sie den Pinsel vorsichtig auf der inneren Oberfläche eines T25-Fläschens, das zuvor mit bovinem Hautkollagen beschichtet wurde, wobei darauf geachtet werden muss, die Beschichtung nicht zu verkratzen. Entsorgen Sie den Pinsel danach in einem geeigneten Bioabfallbehälter.Pipettieren Sie langsam die verbleibenden Zellen in BEGM vom Konus in den T25-Fläschchen, mindestens 7 × 10⁵ Zellen. Fahren Sie fort, indem Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop beobachten. Nach dem Kultivieren und Passagieren der Zellen, wie im Text beschrieben, impfen Sie 5 × 10⁵ nasale Epithelzellen pro Vertiefung einer sechswelligen Zellkulturplatte in zwei Milliliter BEGM aus.Anschießend die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach der Inkubation sicherstellen, dass die Zellen kräftig proliferieren. Dann unter dem Abzug Polybrene jeder mit BEGM haltigen Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen.Führen Sie die Transduktion der nasalen Epithelzellen durch, indem Sie lentivirale Partikel, die Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc exprimieren, gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren dem Medium in jeder Vertiefung hinzufügen. Nach einer Inkubation der transduzierten Zellen für etwa drei Stunden entfernen Sie das virushaltige Medium und entsorgen es gemäß den institutionell genehmigten Verfahren. Ersetzen Sie anschließend dieses Medium durch BEGM und stellen Sie die transduzierten nasalen Epithelzellen wieder in den Inkubator.Nach drei Tagen ersetzen Sie das Medium durch frisches BEGM und inkubieren die transduzierten Zellen unter den gleichen Bedingungen weiter. Am nächsten Tag geben Sie eine 0,1 %ige Gelatinelösung in zwei Vertiefungen einer sechs-Vertiefungs-Platte, um die Vorbereitung von mit embryonalen Mausfibroblasten beschichteten Platten zu beginnen.Decken Sie die Platte dann mit dem dazugehörigen Deckel ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am fünften Tag entnehmen Sie ein Gefäß mit etwa 5 × 10⁵ inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten (abgekürzt MEFs) und tauen es auf. Anschließend geben Sie diese Zellen in 10 Milliliter MEF-Medium.Und zentrifugieren Sie sie anschließend bei 200 x g für fünf Minuten. Danach den Überstand abpipettieren und die MEFs in dem gleichen Medium resuspendieren. Sobald diese Zellen gezählt wurden, das Gelatine-Lösung aus der zuvor vorbereiteten 6-Loch-Platte abpipettieren.Fügen Sie anschließend 1,87 × 10⁵ MEFs in jede gelatinebeschichtete Vertiefung der Platte ein und inkubieren Sie sie bei 37 °C mindestens 24 Stunden lang. Danach, am sechsten Kulturtag, saugen Sie das verbrauchte Medium von den transduzierten Zellen ab und waschen Sie diese mit 1× PBS. Geben Sie danach je eine Milliliter 0,05 %ige Trypsinlösung in jede Vertiefung der Platte.Nachdem die Zellen gel&ouml;st sind, fahren Sie mit der Neutralisierung mittels Trypsin-Neutralisationsl&ouml;sung oder TNS fort, sammeln Sie die Zellen anschlie&szlig;end ein und zentrifugieren Sie sie wie zuvor beschrieben. Nach der Zentrifugation saugen Sie den &Uuml;berstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in vier Milliliter BEGM, erg&auml;nzt mit Penicillin und Streptomycin. Geben Sie dann zwei Milliliter dieser Zellsuspension in jede der mit Gelatine und MEF beschichteten Vertiefungen der zuvor vorbereiteten Platte.Nach der Übernachtung der Zellen ersetzen Sie das BEGM durch 2,5 Milliliter Standard-Medium für humane embryonale Stammzellen (abgekürzt hESC), das vier Nanogramm pro Milliliter basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthält. Kultivieren Sie die Zellen weiter und versorgen Sie sie täglich mit frischem hESC-Medium, bis hESC-ähnliche Kolonien, die putative induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) enthalten, in den Kulturen beobachtet werden. Entfernen Sie diese Kolonien manuell und übertragen Sie sie in separate Mulden einer 24-Mulden-Platte, um sie als separate Linien in einem systemfreien Kultursystem zu kultivieren und zu vermehren.Anfangs bestehen nasale Proben aus einer Mischung verschiedener Zelltypen und Zelltrümmern. Nach Kultivierung und Mediumwechsel dominieren jedoch epitheliale Zellen in diesen Präparationen, wie auf diesem Bild gezeigt, das einen Tag nach der Zellpassagierung aufgenommen wurde. Hier zeigen epitheliale Zellen, die bis zur Konfluenz gewachsen sind, große Kerne und gestrecktes Zytoplasma.Aufgrund der Eigenschaften der in dieser Studie verwendeten Lentiviren exprimieren die nasalen Epithelzellen nach der Transduktion den fluoreszierenden Marker tdTomato, wie das obere rechte Bild der Zellen vier Tage nach der Transduktion zeigt. Ein Vergleich mit dem entsprechenden Hellfeldbild zeigt, dass nicht jede Zelle ein tdTomato-Signal aufweist, wie das unten dargestellte Überlagerungsbild belegt. Daher wird nicht jede Zelle transduziert.Jedoch liegt die Transduktionseffizienz bei etwa 90 %. Wenn transduzierte nasale Epithelzellen wie im Protokoll beschrieben kultiviert werden, bilden sie iPSC-Kolonien. Nach der Gewinnung der iPSC-Kolonien und Kultivierung unter standardmäßigen, feederfreien Bedingungen zeigten einzelne Zellen in diesen Kolonien eine typische, hES-Zellen ähnliche Morphologie, wie beispielsweise eine runde Form, einen großen Zellkern und ein hohes Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis, wie dieses vergrößerte Bild zeigt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von eineinhalb Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe korrekt zu entnehmen, die Zellen bei 37 Grad Celsius zu halten und sie so schnell wie möglich mit der richtigen Dichte zu plattieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Einrichtung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche unter Verwendung primärer nasaler Epithelzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Atemluft auf Allergene und Krankheitserreger reagiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern den Weg, um Krankheiten wie Asthma, COPD und zystische Fibrose modellhaft zu untersuchen.Diese Technik hilft zudem, Umwelteinflüsse auf die Lungenentwicklung im humanen in-vitro-System zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie nasale Epithelzellen von Kindern kultiviert und iPSCs aus dieser Zellpopulation gewonnen werden können. Da wir mit humanen embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen arbeiten, denken Sie daran, stets die institutionellen und nationalen Richtlinien einzuhalten.

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt...

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Erweiterung der menschlichen pädiatrischen Ösophagus-Epithelzellen Verwendung bedingten Neuprogrammierung bietet Ermittler mit einem Patienten-spezifische Population von Zellen, die für das Engineering-Ösophagus-Konstrukte für die autologe Implantation verwendet werden können Defekte oder Verletzungen und dienen als Reservoir für die therapeutische Screening-Assays zu behandeln.

Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Direkte neuronale Umprogrammierung erzeugt Neuronen, die im Alter von der somatischen Startzelle beibehalten. Hier beschreiben wir eine einzelne Vektor-basierte Methode um induzierte Neuronen von dermalen Fibroblasten von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu generieren.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie, wie man nasale Epithelzellen von Kindern kultiviert und zu iPSCs umprogrammiert. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht Asthma-Forschung und Untersuchungen zu Atemwegserkrankungen.

Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Weitere Videos entdecken