Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, Enzyme schnell auf antimikrobielle Aktivität zu untersuchen und zu charakterisieren. Der Mikroobjektträger-Diffusions- und Farbstofffreisetzungsassay ist nützlich für die funktionelle Entdeckung neuer antimikrobieller Wirkstoffe mit lytischer Aktivität gegen spezifische Ziele, wie z. B. ein pathogenes Bakterium von Interesse. Die Hauptvorteile dieser Techniken bestehen darin, dass sie einfach auszuführen sind, Flexibilität bei der Variation der experimentellen Parameter bieten und mit Laborgeräten durchgeführt werden können, die in den meisten mikrobiologischen Laboratorien üblich sind.

Vor Beginn des Mikroobjektträger-Diffusionsassays sollte die Konzentration des zu bewertenden antimikrobiellen Enzyms mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden. Führen Sie eine serielle Verdünnung des antimikrobiellen Enzyms durch, wobei PBS als Reaktionspuffer verwendet wird. Geben Sie das Protein in einzelne Mikrofurge-Röhrchen und passen Sie das Volumen mit PBS auf 20 Milliliter an.

Bereiten Sie als Nächstes eine 0,5%ige Agaroselösung vor, indem Sie 0,25 Gramm Agarose in 50 Millilitern PBS auflösen. Diese Lösung zum Kochen bringen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Bestimmen Sie den während des Schmelzvorgangs verlorenen Wassers nach Gewicht und geben Sie es wieder in die Lösung.

Um das kontaminierende Bakterienwachstum während der Inkubation des Assays zu hemmen, fügen Sie der Agaroselösung 15 Mikroliter 10%iges Natriumazid in Wasser hinzu und stellen Sie die Temperatur der Lösung in einem Wasserbad auf 50 Grad Celsius ein. Wenn lebensfähige Zellen als Substrat verwendet werden, lassen Sie das Natriumazid aus der Agaroselösung weg. Tauen Sie das hitzeabgetötete Bakteriensubstrat auf Eis auf.

Resuspendieren Sie das bakterielle Substrat in 12 Millilitern der Agaroselösung, um ungefähr der Trübung eines 2,0 McFarland-Äquivalenztrübungsstandards zu entsprechen. Vergleichen Sie die Trübungen der Lösungen, indem Sie eine schwarze Linie auf weißem Hintergrund durch die Lösungen hindurch visualisieren und der Agarose bakterielles Substrat hinzufügen, bis die ungefähre Trübung erreicht ist. Pipettieren Sie sofort, aber vorsichtig drei Milliliter der Agarose-Substratlösung auf jeden Objektträger und stellen Sie sicher, dass die Lösung den Objektträger nicht überläuft.

Nachdem die Objektträger erstarrt sind, stanzen Sie mit einem Korkbohrer mit einem Durchmesser von 4,8 Millimetern drei Vertiefungen in die Agarose-Substratschicht jedes Objektträgers. Geben Sie 20 Mikroliter jeder angepassten Protein-Serienverdünnung in die jeweiligen Wells. Rinderserumalbumin in einer Negativkontrollvertiefung verwenden.

Als Positivkontrolle verwenden Sie bekannte bakteriolytische Enzyme, die für das Substrat geeignet sind, wie z. B. Lysozym. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius oder der optimalen Aktivitätstemperatur des Enzyms. Die Dauer der Inkubation hängt von der Konzentration und der spezifischen Aktivität des antimikrobiellen Enzyms ab.

Eine typische Reaktionszeit beträgt ca. 16 Stunden. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, beobachten Sie die Objektträger unter indirektem Licht und nehmen Sie Bilder des sich entwickelnden Assays auf. Verwenden Sie eine digitale Spiegelreflexkamera mit einem 60-Millimeter-Objektiv bei einer Brennweite von ca. 30 Zentimetern.

In dem Farbstofffreisetzungsassay, der im nächsten Segment demonstriert werden soll, ist das Substrat kovalent an den Farbstoff Remazol Brilliant Blue R oder RBB gebunden. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine 200 millimolare RBB-Lösung herstellen. 1,25 Gramm RBB werden in einer frisch zubereiteten Natronlauge gelöst.

Als nächstes resuspendieren Sie hitzeabgetötete Bakterienzellen in einer Konzentration von 0,5 Gramm Nassgewicht in 30 Millilitern RBB-Lösung. Für gereinigtes Peptidoglykan resuspendieren Sie das Peptidoglykan in einer Konzentration von 0,3 Gramm Nassgewicht in 30 Millilitern RBB-Lösung. Da die nachfolgenden Schritte unabhängig vom verwendeten Substrat gleich sind, wird die Markierung nur für die Bakterienzellen demonstriert.

Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch auf einer rotierenden Plattform sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter schonendem Mischen. Nach sechs Stunden wird das Reaktionsgemisch in einen vier Grad Celsius heißen Inkubator umgefüllt und weitere 12 Stunden unter schonendem Mischen inkubiert. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, ernten Sie das gefärbte Substrat durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 30 Minuten.

Dekantieren Sie die Färbelösung aus dem Substratpellet. Resuspendieren Sie das Pellet gründlich in Wasser Typ I und zentrifugieren Sie es anschließend. Gießen Sie die farbstoffmarkierten Zellen auf diese Weise drei- bis fünfmal, um nichtkovalent gebundene lösliche Farbstoffe von den Substraten zu entfernen.

Übertragen Sie für die abschließende Wäsche den Pelletanteil, der im Farbstofffreisetzungsassay verwendet wird, in 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Der Überstand der letzten Wäsche sollte klar sein, während der Untergrund blau bleibt. Lagern Sie das gefärbte Substrat suspendiert in einer minimalen Menge Wasser bei 20 Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist.

Zur Vorbereitung des Farbstofffreisetzungsassays lassen Sie das gefrorene gefärbte Substrat auf Raumtemperatur zurückkehren und waschen Sie es zweimal mit dem Assay-Puffer, der empirisch für das Enzym bestimmt wurde. In diesem Fall kommt PBS zum Einsatz. Berechnen Sie das Volumen der benötigten Substratsuspension, indem Sie das Reaktionsvolumen von 200 Mikrolitern mit der Anzahl der durchzuführenden Farbstofffreisetzungsassays multiplizieren.

Um die Substratsuspension herzustellen, geben Sie zuerst das gefärbte Substrat in das entsprechende Volumen PBS. Führen Sie eine Eins-zu-Eins-Verdünnung durch und nehmen Sie eine erste Messung der optischen Dichte bei 595 Nanometern vor, wobei PBS als Blindwert verwendet wird. Geben Sie inkrementelle Mengen des gefärbten Substrats in die Suspension, bis eine optische Dichte von 2,0 bei 595 Nanometern erreicht ist.

In dieser Demonstration wird der Dye-Release-Assay verwendet, um die optimalen Inkubationsbedingungen für ein antimikrobielles Protein zu bestimmen. Bereiten Sie zunächst eine antimikrobielle Stammproteinsuspension her, indem Sie die Konzentration unter Verwendung von PBS auf ein Milligramm pro Milliliter einstellen, wie im Protokolltext beschrieben. Verdünnen Sie dann die antimikrobielle Stammproteinsuspension auf eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter.

Diese Konzentration ergibt eine endgültige Reaktionsmasse von einem Mikrogramm Protein pro Volumen, das der Assay-Reaktion zugesetzt wird. Die Reaktionsassays werden in 0,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen durchgeführt, um den zu beurteilenden thermischen Bereich zu bestimmen. Für jede thermische Bedingung werden 10 Mikroliter des Stammproteins zu 200 Mikrolitern der vorbereiteten Substratsuspension hinzugefügt.

Inkubieren Sie acht Stunden lang in einem Thermocycler, wobei Sie einmal pro Stunde durch Inversion mischen. Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie 25 Mikroliter Ethanol in jedes Mikrofuge-Röhrchen geben. Um unverdautes unlösliches Substrat zu entfernen, zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 3000 x g.

Übertragen Sie danach 150 Mikroliter des Reaktionsüberstands für jedes Reaktionsgemisch auf eine 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden, wobei Sie darauf achten sollten, das Pellet des unverdauten Substrats nicht zu zerstören. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, verwenden Sie ein Mikroplatten-Spektralphotometer, um die Absorption des Überstands bei 595 Nanometern zu messen. Die erhöhte Absorption durch den löslichen Farbstoff, der aus dem markierten Substrat in den Überstand freigesetzt wird, ist ein quantitatives Maß für die enzymatische Aktivität.

Der Microslide-Diffusionsassay wurde verwendet, um die Aktivität eines unbekannten antimikrobiellen Proteins gegen hitzeabgetötetes Salmonella enterica-Ganzzellsubstrat qualitativ zu bewerten. Das antimikrobielle Mittel wurde in zunehmenden Mengen aus den Vertiefungen A bis F zugegeben, und PBS wurde für die Negativkontrollen verwendet. Nach sechs Stunden wurde die Größe der klaren Hydrolysezone beobachtet, die sich um jedes Bohrloch herum bildete.

Eine hohe enzymatische Aktivität bezieht sich qualitativ auf eine größere Zone, während sich eine niedrige enzymatische Aktivität qualitativ auf eine kleinere Zone bezieht. Der quantitative Farbstofffreisetzungsassay wurde verwendet, um die optimale Reaktionstemperatur für ein antimikrobielles Protein zu bestimmen. Aus den Mengen an blauer Farbe in den Reaktionsüberständen und den Aktivitätseinheiten, die aus den Absorptionsmessungen bei 595 Nanometern abgeleitet wurden, ist 35 Grad Celsius die optimale Temperatur.

Der Farbstofffreisetzungsassay wurde auch verwendet, um den Aktivitätsbereich eines unbekannten antimikrobiellen Proteins gegen das hitzeabgetötete Substrat von Bacillus subtilis zu bestimmen. Ein Vergleich mit dem Wirkungsbereich von alpha-Chymotrypsin ergab, dass das unbekannte antimikrobielle Enzym eine fast doppelt so hohe Affinität zum Substrat aufweist. Während die Aktivität von Alpha-Chymotrypsin bei etwa 0,3 Mikrogramm zu pendeln beginnt, stieg die Aktivität des unbekannten Enzyms über alle Enzymmengen hinweg weiter an.

Sobald der Mikroobjektträger-Diffusionsassay beherrscht ist, kann er innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen werden. Der Farbstofffreisetzungsassay kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Die Inkubationszeiten für jeden Assay hängen von der Enzymaktivität und ihren Konzentrationen ab.

In Erweiterung dieser Verfahren kann das Farbstofffreisetzungsverfahren modifiziert werden, um die chemischen Einflüsse zu bestimmen, die die enzymatische Aktivität des antimikrobiellen Enzyms beeinflussen, indem Aspekte der Reaktion wie der pH-Wert des Puffers und der Salzgehalt manipuliert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Enzyme mithilfe von Mikroobjektträger-Diffusions- und Farbstofffreisetzungs-Assays schnell auf antimikrobielle Aktivität untersuchen und charakterisieren können.