Name: Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Adipozyten-Homöostase und Hypoxie-induzierte Apoptose in Mäusen untersucht werden. Diese Methoden ermöglichen Einblicke in metabolische Erkrankungen wie Adipositas und Diabetes.

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Die Autoren danken Dr. J. Luther und K. Ubieta die Daten und Dr. B. Grötsch für die Vorbereitung für das Korrekturlesen des Manuskripts zu freundlich danken. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Adipozyten sind phänotypisch charakterisiert durch ihre Größe, Anzahl und Fläche, Adipozyten Hyperplasie und Hypertrophie offenbart, die durch übermäßige Energiespeicher induziert durch Überernährung 5. Diese Ereignisse, die zu Fettsäure Dysregulation und anschließende Metabolisches Syndrom sind auch Zustände erhöhter Fettmasse mit erhaltenen Metabolismen, die auch als &quot;gesund&quot; Fett Expansion bezeichnet wird. Zum Beispiel Kusminski et al. 21 zeigten , dass Mäuse , die mit massiven Fettexpansions metabolisch gesund bleiben, was darauf hindeutet , dass Fett Expansion nicht notwendigerweise auf Metabolisches Syndrom verbunden ist und sein muss sorgfältig bestimmt , um die Eigenschaften der Adipozyten zu bewerten. Das Fettgewebe (AT) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Körpermetabolismus. AT ist die größte endokrine Organ , das Dyslipidämie, Atherosklerose, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie 3 beeinflussen könnten. Auswertung der AT-Homöostase und der molekularen mechanisms es regulieren könnte ein besseres Verständnis der Stoffwechselsystem Störungen ermöglichen. Daher die Regulierungsmechanismen Adipocytendifferenzierung entwirren, Adipozyten Größe und Fettpolster Masse würde dazu beitragen, neue therapeutische Behandlung von Fettleibigkeit Störungen zu entwickeln. Verwendung von in vivo und in vitro Verfahren ist es möglich , die Rolle der Nahrung und die Genexpression Auswirkungen auf die Adipozyten - Differenzierung und Aktivität zu bestimmen. Um die AT - Homöostase, die Bestimmung der im Gleichgewicht zwischen Adipozyten Differenzierung, Proliferation und Apoptose bestimmen , wie vorgeschlagen durch unser Protokoll so wichtig ist wie die Glucose- und Insulinstoffwechselantwort 22-24 analysiert. Expressionsprofilen Analysen von Genen in Adipogenese beteiligt, Lipogenese, Lipolyse, Fettsäureaufnahme, Hypoxie, Apoptose und Proliferation in primären Adipozyten und viszeralen AT ist ein Hochdurchsatzverfahren zum Erhalten einer Übersicht über adipocyte Homöostase und deren mögliche Dysfunktion.Interessante Kandidaten sollten weiter auf Proteinebene durch Western-Blot oder immunhistologische Färbung analysiert werden. Um optimale Ergebnisse durch PCR-System in Echtzeit erhalten, unter Verwendung von unsymmetrischen Cyaninfarbstoffen, reichen die Konzentrationen von cDNA von 1 bis 10 ng und die optimale Primerkonzentrationen im Bereich von 50 bis 900 nm sollte zur Minimierung unspezifischer Amplifikation getestet werden. Die kritischen Komponenten sind die Primer; für jeden Lauf, müssen die Schmelzkurven, die Spezifität zu gewährleisten und schließen die Bildung von Primer-Dimeren streng kontrolliert werden. Daher wird eine negative Kontrolle mit H 2 O anstelle von cDNA unter Verwendung empfohlen. Weiterhin handelsübliche unsymmetrischen Cyanin-Farbstoffe werden als Master-Mischungen bereitgestellt, die eine passive Referenzfarbstoff (wie ROX) enthalten ein internes Referenzsignal zu liefern. Das cDNA-Signal wird während der Datenanalyse zu den ROX Signale normalisiert gut zu Well Signalschwankungen zu korrigieren. Ein weiterer Punkt zu berücksichtigen, um eine Schmiere zu etablierend qPCR System ist die Wahl des Housekeeping-Gens. Für jede Bedingung sind verschiedene Housekeeping - Genen verwendet, beispielsweise HPRT, β-Aktin, GAPDH, β-2-MG oder HSP90. HIF Proteine ​​stabilisiert durch hypoxischen Bedingungen sind Master - Regula Bestimmung nicht nur Adipozyten Überleben, aber auch Stoffwechselveränderungen, beispielsweise Glukose, Insulintoleranz und Lipidstoffwechsel 11,25,26. Um hypoxische Bereiche in das Fettpolster, HIF-1α wird bestimmt in AT Abschnitte durch Immunhistochemie ermitteln. Da HIF Proteine ​​schnell in 5 bis 10 min unter normoxischen Bedingungen abgebaut werden, sollte das Verfahren und die Fixierung des Fettpolsters für die histologische Analyse gesteuert werden eng Latenzzeit zu vermeiden. Daher Hypoxie nicht nur durch HIF-Färbung zu gewährleisten, wird pimonidazole verwendet hypoxischen Bereichen in der AT bestimmen. Pimonidazole der Lage ist , in das Gewebe zu verteilen, wie es bereits in den Knochen gezeigt wurde 27Und markieren Sie effektiv hypoxische Bereiche durch zu thiolhaltigen Proteine ​​spezifisch in hypoxischen Zellen binden, die weiter in histologischen Schnitten durch spezifische Antikörperbindung 28 erfasst wird. Jedoch können auch andere Marker und Methoden verwendet werden, um die Hypoxie Stoffwechselweg zu analysieren. Zum Beispiel ist die Beteiligung der Prolylhydroxylasedomäne (PHD) Enzym, das die Hydroxylierung von Prolin-Reste unter Normoxie induzieren, sowie der von Hippel-Lindau (VHL) Protein, das hydroxylierte Proline erkennen und induzieren die Poly-Ubiquitinierung proteasomaler HIF zu vermitteln Abbau, müssen für eine vollständige Übersicht über den Weg 29,30 analysiert werden. Außerdem allgegenwärtigen Nachweis von HIFs würde bestimmen auch die Proteinstabilität und Abbau , die 31,32 werden verändern können. Proliferation von Ki67 und Apoptose durch TUNEL - Färbung Weiterhin werden in vivo durch Färbung von AT histologischen Schnitten bestimmt. Die Quantifizierung der Proliferation von Ki67 und einpoptosis durch TUNEL oder Annexin V - Färbung durch Durchflusszytometrie - Analyse wird auch 33 durchgeführt. Proliferation könnte natürlich durch andere Techniken, wie die Analysen der Adipozyten-Zellzyklus gemessen werden, die nicht durch die Messung von Ki67 positive Zellen gerichtet. Darüber hinaus kann die Apoptose Studie von TUNEL abgeschlossen werden durch FACS von Annexin V-Analysen und TOP-PR-3, die das Niveau der Nekrose gegenüber der Apoptose Zelltod Prozess bestimmen wird. Apoptosis ist ein fundamentaler Prozess für das Programm des Zelltods, der für AT Homöostase wichtig ist. Tatsächlich Dysregulation von Adipozyten Apoptose in Prozessen bisher verwickelt zu Fettleibigkeit beitragen und 34 Lipodystrophie. Darüber hinaus im Jahr 2011, Keuper et al. Fettgewebe Entzündung zu Adipozyten Apoptose verknüpft. Sie zeigten, dass Makrophagen induzierte Apoptose in Präadipozyten und Adipozyten, die wiederum Makrophagen ziehen. Die Rekrutierung von Makrophagen beschleunigt Entzündung, die contributes metabolischen Syndromen wie Glucose und Insulintoleranz 35. Allerdings ist Adipozyten Apoptose noch ein wenig untersucht Phänomen, trotz der Hypothese, dass die induzierte Adipozyten Apoptose zu einer verminderten Gewichts führen könnte. Die vorliegende Protokoll verwendet immunhistochemischen Methoden unterschiedliche Phänomene wie Proliferation, Apoptose und Hypoxie in vivo zu untersuchen. Daher wurde das Gewebe mit 4% Formaldehyd fixiert, was ein kritischer Schritt. Eine erweiterte Gewebefixierungszeit führt der Epitope zu ändern, die für den Antikörper nicht zugänglich. Im Gegensatz dazu erhöht eine kurze Fixierzeit die Empfindlichkeit der Epitope Reagenzien. Die empfohlene optimale Zeitpunkt der Fixierung ist 24 Stunden. Darüber hinaus beeinflusst die Dicke der Abschnitte auch die Antikörper an ihre Epitope binden; optimale Dicke liegt zwischen 2 und 5 um. Abschnitte dicker als 5 &amp; mgr; m erhalten falsch-positive Ergebnisse aufgrund der erhöhten Bindungsstellen. Im Gegensatz, sexionen dünner als 2 um enthalten weniger Bindungsstellen und positive Bereiche sind nicht gut definiert. Weitere wichtige Faktoren sind die Antikörper selbst, Inkubationszeit, Konzentration und gleichmäßige Temperatur, die die Qualität der spezifischen Bindung an die Epitope beeinflussen. Daher ist die Antikörperkonzentration und Inkubationszeit Validierung für jede Bedingung notwendig. Um die Studie abgeschlossen ist , stellen wir ein in vitro Adipozytendifferenzierung Protokoll, die durch verschiedene Behandlungen, Stimulation oder Co-Kulturen ausgedehnt werden könnte. Durch die Verwendung von in vitro - Kulturen Adipozyten, ist es möglich , Defekte in Adipozyten - Differenzierung und Funktionen zu bestimmen. Um erhalten zuverlässige Ergebnisse, wie für alle primären Zellen, die gesundes Verhalten und Aussehen der ADSCs und Adipozyten ganz wichtig ist. Die Granularität, zytoplasmatische vacuolations und / oder Ablösung sind Anzeichen für eine Verschlechterung, was auf unzureichende Medium, eine mikrobielle Kontamination oder Seneszenz des primärenZellen. Dieses Protokoll wird unter Verwendung von isolierten Adipozyten aus dem Fettpolster Gewebe, während es auch möglich ist , mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark , wie 36 von anderen Protokollen isoliert zu verwenden. Die neueste Stroma-Vorläuferzellen enthält, die in einem sehr frühen Schritt der Adipozyten-Differenzierung auftretende zusätzliche Differenzierung Probleme widerspiegeln könnte, könnte dies in unserem aktuellen Protokoll fehlen. Darüber hinaus kann ADSCs schnell erweitert werden (mehr als 10 Mal innerhalb einer Woche), und langfristige kultiviert ADSCs nach einigen Passagen noch ihre mesenchymalen Pluripotenz 37,38 behalten. Ein weiterer Vorteil ADSCs ist, dass man leicht auf die menschliche schalten kann, kann, da ADSCs von Patienten durch Liposuktion geerntet werden, die eine einfache und minimal-invasive Methode. Wie in mehreren anderen Organen in einer endokrinen Weise beeinflusst, sollte das Protokoll zu adipokines erweitert werden. Adipokinen, wie Leptin, Adiponectin, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) and resistin, von Adipozyten sezerniert werden bekannte Stoffwechselerkrankungen zu beeinflussen , indem sie den Fettstoffwechsel, Energie - Homöostase und Insulin - Empfindlichkeit Steuerung 39. Daher sollten Analysen Serum und Adipozyten Sekretom ausgeführt werden. Im Falle von Funktionsstörungen AT, adipokines und proinflammatorische Zytokine, wie IL-6, kann zu Fehlregulation von Organen führen, wie der Leber und Bauchspeicheldrüse und der Muskelfunktion 4. Um systemische Organdysfunktion auszuschließen, Tiermodelle oder Zellkulturen auf ihre Reaktion könnte getestet, um Stimulation und Aufnahme Glukose. Hier bieten wir ein Protokoll für den Grundzustand des AT Analyse und Adipozyten in vivo und in vitro molekularen Mechanismen der Adipozyten - Homöostase und Funktionalität zu offenbaren.

Nach dem 2014 Bericht der Weltgesundheitsorganisation, 39% der erwachsenen Weltbevölkerung ist übergewichtig und 13% ist fettleibig 1. In naher Zukunft wird übergewichtigen Menschen einen signifikanten Anteil der älteren Bevölkerung umfassen. Ein wichtiges Merkmal von Fettleibigkeit und Alterung ist Dysregulation von Fett in Bezug auf Morbidität und Mortalität 2. Adipokines, Proteine ​​, die durch das Fettgewebe (AT) sezerniert wird , kann metabolische Syndrome wie Fettleibigkeit auslösen und 2 - Diabetes Typ 3. Stoffwechselerkrankungen werden meist durch zu hohe Energiespeicherung in den Lipidtröpfchen von Adipozyten verursacht, die 4 bei Expansion führt. Es ist daher von Interesse, die Ursachen und die molekularen Mechanismen der AT Expansion, um zu bestimmen, Möglichkeiten zu finden, sie zu kontrollieren. Überernährung führt zu Expansion an, die durch zwei Ereignisse geregelt wird: übermäßige Energiespeicher in die Lipidtröpfchen von Adipozyten, ein Prozesswas zu einer Hypertrophie (Zunahme der Adipozyten - Größe) und erhöhte adipogenesis, die auch als Adipozyten Hyperplasie 5 bekannt. Adipogenese ist ein Prozess der Differenzierung der multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in Adipozyten. Erstens entwickeln MSCs in Preadipozyten während der Verpflichtungsphase. Zweitens unterscheiden Preadipozyten weitere 6 die Eigenschaften reifen und funktionellen Adipozyten zu erwerben. Mehrere Transkriptionsfaktoren wurden als Masterregler für Preadipozyten Bestimmung, wie Zinkfinger-Protein 423 (Zfp423) und frühen B-Zell-Faktor 1 (EBF1) identifiziert. Während Zfp423 frühen Einsatz induziert wird EBF1 6 zur Erzeugung von Adipozyten - Vorläufern erforderlich. Terminale Differenzierung ist eng durch einen Transkriptions Kaskade gesteuert, wodurch Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPAR) ist der wesentliche Transkriptionsfaktor 7. Weitere wichtige Transkriptionsfaktoren sind die CCAAT / Enhancer-bindendes Protein (C/ EBP) Familienmitglieder (dh C / EBP &amp; agr, C / EBPβ und C / EBPδ) Kruppel artige Faktoren (KLFs), responsive element cAMP - Bindungsprotein (CREB) und frühe Wachstumsantwort 20 (Krox20) 6. Vor kurzem wurde gezeigt , dass das Aktivatorprotein-1 (AP-1) -Familie im Adipozyten - Differenzierungsprozess 8,9 beteiligt ist. Die AP-1-Familie wird von einem dimeren Protein-Komplex gebildet, bestehend aus Fos, Jun und / oder aktivierende Transkriptionsfaktor (ATF) Mitglieder. Fos-verwandtes Antigen 1 und 2 (Fra-1 und Fra-2) sind in der Lage Adipozyten-Differenzierung zu regulieren. Fra-1 beeinträchtigt Adipocytendifferenzierung von C / EBP &amp; agr 8, während Fra-2 steuert Adipozyten Umsatz 9 hemmen. Fra-2 dadurch nicht verringert nur die Adipozyten-Zahl von PPARγ2 Expression während der Adipozyten-Differenzierung drücken, sondern verringert auch die Adipozyten Apoptose durch direkte Unterdrückung von Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) Ausdruck. Die HIF-Familie ist eine heterodimeric Transkriptionsfaktor-Komplex, bestehend aus HIF-1α, HIF-2α und HIF-1β. Die Heterodimere bestehen aus einem sauerstoffempfindlichen HIF-α Protein (HIF-1α oder HIF-2α) und dem Sauerstoff-unempfindlichen HIF-1β - Untereinheit 10. Während Normoxie HIF-α - Proteine ​​sind Poly-ubiquitiniert und werden schließlich durch das Proteasom 11 abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen tritt bei bei der Expansion, HIF-α-Proteine ​​sind nicht mehr hydroxylierten. Sie sind daher stabilisiert und Form werden Dimere mit dem konstitutiv exprimiert HIF-1β. Transkriptioneller Aktivierung von Genen durch die HIF - Response - Elemente gesteuert ist , die an der Regulation der Angiogenese, Metabolismus und Entzündung 12. Tatsächlich fördert die HIF-1α AT Dysfunktion durch Glukosetoleranz zu induzieren, den Energieverbrauch und peripheren Verwendung von Lipid Hemmen sowie durch Leptin Niveau erhöht und HFD-induzierten 13 Hepatosteatose. Außerdem HIF-1α reguliert adipocyte Apoptose in vivo und in vitro 9. Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden für AT Status der Untersuchung der molekularen Eigenschaften von Adipozyten-Homöostase in erwachsenen Mäusen zu entwirren. Es zeigt , wie der Apoptose, Proliferation und Differenzierung von Adipozyten in vivo und in vitro kann durch Hypoxie reguliert werden. Dazu verwenden wir Mäuse mit Adipozyten spezifischen Deletion von Fra-2 erzeugt durch Mäusen , die die Fra-2 floxed Allele mit FABP4-CreERT Mäuse 9 kreuzen. FABP4-Cre ERT Mäuse Durch die Verwendung der Löschung ist Adipozyten spezifische und induzierbare durch Tamoxifen Injektion 14. Für die Erwachsenen-Modell, intraperitoneale Injektionen von Tamoxifen durchgeführt werden mehr als 5 aufeinander folgenden Tagen im Alter von 6 Wochen beginnen. Somit werden die Mäuse für 6 Wochen zu einer normalen Ernährung oder hohen Fett-Diät unterzogen, bevor die Analyse durchgeführt wird. Die Mäuse in dieser Studie verwendet wurden männliche basierend auf einem C57Bl6 Hintergrund weibliche Hormone zu vermeiden, wie ÖstrogeneDargestellt , um die Körperfettverteilung 15 zu regulieren. Eine andere genetische Hintergrund verwenden , kann auch die metabolischen Phänotyp verändern, aufgrund dehnungsbedingte Unterschiede in Lipidmanagement 16. Dieses Protokoll zeigt , wie AT unter Hypoxie zu analysieren Histologie verwenden und wie Adipozyten Apoptose, Proliferation und Differenzierung in vivo mittels Immunhistochemie und Gen Profilierungs Analysen zu quantifizieren. Die Studie wird von in - vitro - Experimente abgeschlossen, die zeigen , wie primären Adipozyten - Differenzierung und Apoptose durch Exposition gegenüber Hypoxie verändert zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>RNAlater-Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>RNA-Stabilisierungslösung</td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gereinigte Maus Anti-Human-Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>550609-Klon B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Aufgereinigte Maus Anti-Human-Ki-67-Klon B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>Proliferationsmarker</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>gespaltenes Caspase-3 Kaninchen-mAb-Zellsignalisierung</td><td></td><td>9664S</td><td>Klon 5A1E</td></tr><tr><td>gespaltenes Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Kaninchen mAb</td><td>9664</td><td>Apoptosemarker</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000 Reagenz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodid</td><td>T3605</td><td>Kerngegenfärbung, Monomere Cyanin-Nukleinsäurefärbung, Anregung&frasl; Emissionen: 642&frasl; 661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s Hämaum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>Hämatoxylin</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, einphasige Lösung aus Guanidin-Isothiocyanat und Phenol</td></tr><tr><td>Percellys Ceramic Kit 1,4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>Röhrchen mit Keramikkügelchen (1,4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>Homogenisator</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha Antikörper</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha Antikörper, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Hypoxie-Marker</td><td></td></tr><tr><td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>TdT-vermittelte dUTP-Biotin-Nickendmarkierung (TUNEL)</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Lösung (1&nbsp; Einheit/&Mikro; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mechanismus der regulierung der adipocyte zahlen in adulten organismen durch differenzierung und apoptosis homöostase

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Wenn man bedenkt, dass Fettgewebe (AT) ein endokrines Organ ist, kann es den Stoffwechsel des gesamten Körpers beeinflussen. Eine übermäßige Energiespeicherung führt zu einer Fehlregulation der Adipozyten, was wiederum eine abnormale Sekretion von Adipokinen induziert und metabolische Syndrome wie Fettleibigkeit, Dyslipidämie, Hyperglykämie, Hyperinsulinämie, Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes auslöst. Daher könnte die Untersuchung der molekularen Mechanismen hinter der Dysregulation der Adipozyten dazu beitragen, neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Unser Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung des molekularen Mechanismus, der durch hypoxische Bedingungen des AT beeinflusst wird und mit der Apoptose der Adipozyten bei erwachsenen Mäusen korreliert. Dieses Protokoll beschreibt, wie AT in vivo durch Genexpressionsprofilierung sowie histologische Analyse der Adipozytendifferenzierung, -proliferation und -apoptose während der Hypoxie-Exposition analysiert wird, die durch Färbung von hypoxischen Zellen oder HIF-1α-Protein ermittelt wird. Darüber hinaus vervollständigt die In-vitro-Analyse der Adipozytendifferenzierung und ihrer Reaktionen auf verschiedene Stimuli die Charakterisierung der molekularen Signalwege, die hinter einer möglichen Adipozytendysfunktion stehen, die zu metabolischen Syndromen führt.

Wir zeigen , wie Adipozyten Homöostase in vivo zu bestimmen und in vitro am Beispiel von Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäuse im Vergleich zum Wildtyp - Geschwister. Unser Protokoll legt fest, wie erhöhte HIF-Expression durch Hypoxie mit Adipozyten Dysfunktion korreliert ist, wie durch eine erhöhte Adipozyten Apoptose bezeichnet. Erhöhte Adipozyten Größe und Fläche in hohen Fett-Diät (HFD) behandelten Mäusen Überernährung, unter anderen Faktoren resultiert in Adipozyten Hypertrophie, verursacht durch eine übermäßige Energiespeicherung in den Lipidtröpfchen. Die Adipozyten-Größe und Bereich ist ein Indikator für Hypertrophie. Teile der Fettpolster von normalen (ND; 6a) und fettreiche Diät (HFD; 6b) Mäuse sowie Quantifizierungen der Adipozyten - Größe und Fläche deutlich zeigen Adipozyten Hypertrophie nach 6 Wochens von HFD, die durch erhöhte adipocyte Größe in der HFD - behandelten Mäusen (Figur 6c und d) angedeutet ist. Erhöht Hypoxie im Fettgewebe (AT) adulter Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäusen führt zu erhöhten HIF-1α - Ebene und Adipozyten apoptosis Zur Bestimmung der in - vivo - Status von Hypoxie in AT, Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäuse 6 Wochen nach der Fra-2 Löschung im Alter von 12 Wochen analysiert und verglichen mit dem Wildtyp - Geschwister. Pimonidazole wird den Mäusen intraperitoneal als wirksame Hypoxie-Marker verabreicht; es ist nicht toxisch und in der Lage in das AT zu verteilen. Hypoxische Adipozyten in der AT in vivo durch immunhistochemische Antikörperfärbung (Abbildung 7a) definiert ist . Ferner wird die erhöhte hypoxischen Zustand des AT in Mäusen durch eine erhöhte HIF-1α positive ADIP begleitetocytes wie durch die immunhistochemische Färbung 7b angedeutet), die durch Quantifizierung der HIF-1α - Expressionsniveaus und seine Zielgene 9 bestätigt wird. Zusätzlich TUNEL - Färbung von AT Abschnitte von Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäusen und Kontroll littermates (Figur 7c) zeigt , dass Adipozyten Apoptose erhöht mit der Anwesenheit von Hypoxie und HIF-1α - Expression korreliert. HIF-1α-Expression in primären Adipozyten durch Hypoxie induzierte Apoptose Adipozyten erhöht Um Adipozyten Apoptose in vitro zu analysieren, verwenden wir von subkutanen Fettpolster erzeugt Adipozyten wie an anderer Stelle 20 beschrieben. Wie erwartet, wird das HIF-1α - Expression in Adipocyten nach 24 Stunden einer Hypoxie (Abbildung 8a) erhöht. Zur weiteren HIF-1α-Aktivitäten, die RNA-Werte von HIF Ziel analysierenGene wie Inos (induzierbare NO-Synthase) durch qPCR quantifiziert. 8b zeigt , dass die erhöhte Expression von HIF-1α unter hypoxischen Bedingungen führt Inos mRNA - Ebene zu erhöht. Da wir schon in vivo (Abbildung 8) haben gezeigt, dass HIF-1α - Expression in Adipozyten korreliert mit einer erhöhten Apoptose Adipozyten erhöht wird Apoptose auch in in vitro - Kulturen von Annexin V - Färbung unter hypoxischen Bedingungen quantifiziert. Übereinstimmend mit den in vivo - Daten (Bild 7), eine erhöhte HIF-1α - Ebene wird durch erhöhte adipocyte Apoptose , induziert durch Hypoxie (Abbildung 8b) begleitet. Darüber hinaus, dass hypoxische-induzierte Apoptose zu beweisen, ist HIF abhängig; HIF-1α oder HIF-2α durch RNA-Interferenz in Adipozyten, abgeleitet von Wildtyp oder Fra-2-defizienten Mäusen zum Schweigen gebracht. Die erhöhte Adipozyten Apoptose wird durch Schweigen zu bringen HIF-1α oder HIF-2α, wie durch Annexin restauriert<html> V - Färbung in 8b, was beweist , daß die Hypoxie - Sensor HIF-α regelt die Adipozyten - Apoptose. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> Abbildung 6: Erhöhte Adipozyten Größe und Fläche in hohen Fett - Diät (HFD) Mäuse (a, b) H &amp; E - Färbung von Abschnitten aus dem perigonadal Fettpolster der männlichen Wildtyp - Mäusen mit normaler Ernährung (ND) zugeführt wird (a) oder hoch. -fat Diät (HFD) (b) für 6 Wochen. Die Balken stellen 500 &amp; mgr; m. (C, d) Quantifizierungen von Adipozyten Größe (c) und Fläche (d) von der perigonadal Fettpolster von Wildtyp - Mäusen mit ND zugeführt (a) oder HFD (b) für 6 Wochen. n = 10. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde Schülers t - Test durchgeführt unter Verwendung. *** P &lt;0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> Abbildung 7: Erhöhte HIF-1α - Ebene und die Apoptose in Adipozyten von erwachsenen Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäusen. Hypoxie (a) und HIF-1α (b) Färbung im AT der männlichen Fra-2 fl / fl FABP4-creERT Mäuse und männliche Kontrolle littermates 6 Wochen nach der Tamoxifen - Injektion. Vergrößerung 20X, 40X einfügen. Schwarze Pfeile zeigen hypoxische Bereiche und HIF-1α-positiven Zellen. (C) TUNEL - Färbung in Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäuse und Kontroll littermates 6 Wochen nach einer Tamoxifen - Injektion. Vergrößerung 20X, 40X einfügen. Schwarze Pfeile zeigen TUNEL-positiven Zellen. Diese Zahl wurde von Luther et geändertal. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> Abbildung 8:. Erhöhte HIF-1α Expression und Adipozyten Apoptose in primären Adipozyten durch Hypoxie (a) Real-time PCR - Analyse von HIF-1α und HIFs Ziel Inos mRNA - Spiegel in primären Adipozyten in hypoxischen Kammern platziert analysiert zu den angegebenen Zeitpunkten. (B) Quantifizierung der Apoptose durch Annexin V FACS - Färbung in primären Adipozyten aus isoliert Fra-2 fl / fl FABP4-CreERT Mäuse oder Wildtyp - Kontrollen transfiziert mit sh Kontrolle oder sh Plasmid gegen HIF-1α oder HIF-2α und unter Hypoxie platziert (1% O 2) für 24 Std. Diese Zahl wurde von Luther et al modifiziert. <sup&gt; 9. Die Daten sind als Mittelwerte dargestellt ± SD Die statistische Analyse wurde durchgeführt , Student t- Test. * P &lt;0,05 und ** p &lt;0,01 wurden als signifikant akzeptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Fettgewebe (AT) kann die Homöostase des ganzen Körpers beeinflussen, daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Adipozytendifferenzierung und -funktion zu verstehen. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um neue Einblicke in diese Prozesse zu gewinnen, indem wir die Homöostase, die Differenzierung und die Hypoxie-Exposition der Adipozyten als Modell für die induzierte Apoptose der Adipozyten analysieren.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Die allgemeinen Ziele dieser Experimente bestehen darin, die Homöostase und Differenzierung von Adipozyten zu analysieren und die Mechanismen von Hypoxie und Adipozyten-Apoptose zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Stoffwechsels wie Adipositas und Typ-II-Diabetes zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um grundlegende und kostengünstige Verfahren handelt, die die Analyse der Adipozytenbiologie in Ihrem spezifischen Untersuchungsmodell ermöglichen.Nicole Hannemann, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird die Verfahren demonstrieren. Um Hypoxie in vivo zu quantifizieren, bestimmen Sie zunächst das Körpergewicht der Maus. Injizieren Sie anschließend 60 mg pro kg Körpergewicht festes Pimonidazolhydrochlorid intraperitoneal.Nach 45 Minuten fixieren Sie die Gliedmaßen des Tieres und öffnen die Bauchhöhle. Entnehmen Sie die linken und rechten perigonadalen Fettgewebe aus der Bauchhöhle und entfernen Sie das gonadale Gewebe von den Fettgeweben. Wiegen Sie anschließend das Gewebe, um das Verhältnis von Fettgewebe zu Körpergewicht in Gramm zu bestimmen.Um eine histologische Analyse der Adipozyten-Homöostase durchzuführen, deparaffinieren Sie zuerst die Schnitte des Fettgewebes mit drei fünfminütigen Behandlungen mit Xylol, gefolgt von zwei zweiminütigen Rehydrierungen in 100 % Ethanol und zwei zweiminütigen Rehydrierungen in 96 % Ethanol. Danach spülen Sie die Schnitte fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser und färben sie anschließend zehn Minuten bei Raumtemperatur mit Hämalumin. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Schnitte weitere fünf Minuten mit Wasser und färben sie danach 30 Sekunden mit Eosin-Lösung. Spülen Sie die Schnitte wie zuvor gezeigt. Anschließend dehydrieren Sie die Schnitte zweimal je zwei Minuten in 96 % Ethanol und 100 % Ethanol. Danach folgen drei Inkubationen mit Xylol je fünf Minuten.Danach die Schnitte mit einem wasserfreien Eindeckmedium aufnehmen. Für die immunhistochemische Analyse der Gewebe die Schnitte wie eben gezeigt deparaffinisieren und anschließend 30 Minuten mit der Arbeitslösung von Proteinase K bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation das Gewebe mit PBS spülen und die endogene Peroxidase mit 3 % Wasserstoffperoxid in PBS für 10 Minuten blockieren.Nach zwei aufeinanderfolgenden fünfminütigen Waschungen in PBS blockieren Sie jede unspezifische Antikörperbindung mit 10 % Serum in PBS. Anschließend inkubieren Sie die Gewebe und die Antikörper der Wahl über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen spülen Sie die Schnitte mit drei fünfminütigen Waschungen in PBS ab.Anschließend inkubieren Sie die Gewebe eine Stunde bei Raumtemperatur mit den geeigneten biotinylierten sekundären Antikörpern. Während der letzten 30 Minuten der Markierungsphase mit dem sekundären Antikörper equilibrieren Sie 50 Mikroliter Avidin-Lösung mit 50 Mikrolitern biotinyliertem Peroxidase-H pro Schnitt für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie die Schnitte zweimal je fünf Minuten in PBS und behandeln die Gewebe mit 100 Mikrolitern Avidin-Biotin-ABC-Komplex bei Raumtemperatur.Nach 45 Minuten die Schnitte zwei Mal in PBS waschen und die Gewebe in der Peroxidase-Substratlösung inkubieren, bis die Färbung die geeignete Intensität erreicht hat. Danach die Schnitte fünf Minuten mit destilliertem Wasser waschen und die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Hämatoxylin kontrastfärben. Nach der Kontrastfärbung das Gewebe erneut mit Wasser waschen.Anschließend die Schnitte dehydrieren und die Proben mit Deckgläsern mit einem wasserfreien Eindeckmittel eindecken. Die Schnitte können dann unter einem Hellfeldmikroskop ausgewertet werden. Beginnen Sie damit, die Haut des adulten männlichen Mäuses vom Oberschenkel, Lenden- und Flankenbereich abzulösen, wobei die Haut beim Entfernen fixiert wird.Danach das hintere subkutane Fettgewebe gewinnen, das die inguinalen Lymphknoten umgibt und sich am Ansatz der Hinterbeine befindet, um die Adipozyten zu kultivieren. Zur Analyse der adipogenen Differenzierung die differenzierte Fettzellkultur unter einem Abzug platzieren und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen. Anschließend die Zellen in zwei mL 10 % Formalin für 60 Minuten fixieren.Am Ende der Fixierung die Zellen mit Wasser waschen und die Kultur mit zwei Milliliter 60%igem Isopropanol für fünf Minuten behandeln, gefolgt von zwei Milliliter Oil-Red-O-Arbeitslösung. Nach fünf Minuten die Zellen mit Leitungswasser abspülen, bis das Wasser klar abläuft. Anschließend die Zellen wie gerade gezeigt mit Hämatoxylin kontrastfärben.Die Zellen können anschließend unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 100-facher Vergrößerung bewertet werden. Die Lipide der Adipozyten erscheinen rot und die Kerne erscheinen blau. Hier sind Schnitte des Fettgewebes von Mäusen mit normaler und fettreicher Ernährung dargestellt.Die Quantifizierung der Größe und Fläche der Adipozyten zeigt eindeutig eine Adipozytenhypertrophie nach sechs Wochen einer fettreichen Ernährung, wie durch die vergrößerte Adipozytengröße bei den mit fettreicher Nahrung behandelten Tieren belegt wird. Bei Mäusen, die mit dem Hypoxiemarker Pimonidazol behandelt wurden, geht der erhöhte hypoxische Status des Fettgewebes mit einer Zunahme HIF1-alpha-positiver Adipozyten einher. Außerdem zeigt die TUNEL-Färbung von Fettgewebeschnitten aus Knockout- und Kontrolltieren, dass eine Zunahme der Adipozytenapoptose mit dem Vorhandensein von Hypoxie und der Expression des hypoxieinduziblen Faktors 1 alpha korreliert.Wie erwartet steigt die Hif1a-Expression in Adipozyten nach 24 Stunden Hypoxie an. Zudem zeigt die Quantifizierung von Hif-Zielgenen mittels QPCR, dass die erhöhte Expression von Hif1a unter hypoxischen Bedingungen zu einer Steigerung der Inos-mRNA-Expression führt. Die Stilllegung von Hif1a oder 2a durch RNA-Interferenz hingegen schützt die Adipozyten vor Apoptose unter hypoxischen Bedingungen und bestätigt somit die regulatorische Funktion von Hif-alpha als Sauerstoffsensor bei der Apoptose von Adipozyten.Nach Durchführung dieser Verfahren können alle Analysen, wie die Bestimmung von Glukose und Insulinresistenz, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu metabolischen Veränderungen und Adipozytenfunktionsstörungen zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine histologische Analyse der Adipozytenapoptose und Untersuchungen zur Hypoxie durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Membran reife Adipozyten-Aggregatkultur (MAAC) ist eine neue Methode, um reife menschliche Adipozyten zu kultitonischen. Hier erfahren Sie, wie Adipozyten von menschlichen Fetten isoliert werden und wie MAN MAAC aufstellt.

Isolation und Kultur der menschlichen Reife Adipozyten mit Membran Reife Adipozyten Aggregatkulturen (MAAC)

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Erfahren Sie, wie Adipozyten-Homöostase und Hypoxie-induzierte Apoptose in Mäusen untersucht werden. Diese Methoden ermöglichen Einblicke in metabolische Erkrankungen wie Adipositas und Diabetes.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

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