Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente ist es, die Homöostase und Differenzierung der Adipozyten zu analysieren und die Mechanismen der Hypoxie und der Apoptose der Adipozyten zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Stoffwechsel wie Fettleibigkeit und Typ-II-Diabetes zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um grundlegende und kostengünstige Verfahren handelt, die die Analyse der Adipozytenbiologie in Ihrem speziellen Studienmodell ermöglichen.

Nicole Hannemann, Doktorandin aus meinem Labor, wird die Verfahren vorführen. Um die Hypoxie in vivo zu quantifizieren, wird zunächst das Körpergewicht der Maus bestimmt. Injizieren Sie dann 60 mg festes Pimonidazol-Hyrochlorid pro kg Körpergewicht intraperitoneal.

Nach 45 Minuten stecken Sie die Gliedmaßen des Tieres fest und öffnen Sie die Bauchhöhle. Entnehmen Sie die linken und rechten perigonadalen Fettpolster aus der Kavität und entfernen Sie das Gonadengewebe von den Ballen. Wiegen Sie dann das Gewebe, um das Verhältnis von Fettpolster pro Körpergewicht in Gramm zu bestimmen.

Um eine histologische Analyse der Adipozytenhomöostase durchzuführen, deparaffinisieren Sie zunächst die Fettgewebsschnitte mit drei fünfminütigen Waschungen in Xylol, gefolgt von zwei zweiminütigen Rehydratationen in 100 % Ethanol und zwei zweiminütigen Rehydratationen in 96 % Ethanol. Waschen Sie dann die Abschnitte fünf Minuten lang in destilliertem Wasser und färben Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Hämatoxylin ein. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Abschnitte weitere fünf Minuten lang in Wasser, gefolgt von einer 30-sekündigen Färbung mit Eosinlösung.

Waschen Sie die Abschnitte wie gerade gezeigt. Dann die Abschnitte zweimal zweimal für jeweils zwei Minuten in 96 % Ethanol und 100 % Ethanol dehydrieren. Gefolgt von drei fünfminütigen Xylol-Inkubationen.

Montieren Sie dann die Abschnitte mit einem wasserfreien Einbettmittel. Für die immunhistochemische Analyse des Gewebes werden die Schnitte wie gerade gezeigt entparaffiniert, gefolgt von einem 30-minütigen Aufschluss mit Proteinase K-Arbeitslösung bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Verdauung spülen Sie das Gewebe in PBS und blockieren Sie die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid in PBS für 10 Minuten.

Nach zwei aufeinanderfolgenden fünfminütigen Waschungen in PBS blockieren Sie jede unspezifische Antikörperbindung mit 10 % Serum in PBS. Dann inkubieren Sie das Gewebe und die Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Abschnitte am nächsten Morgen mit drei Fünf-Minuten-Wäschen in PBS aus.

Anschließend inkubieren Sie das Gewebe mit den entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur. Während der letzten 30 Minuten der Markierung von Sekundärantikörpern werden 50 Mikroliter Avidin-Lösung mit 50 Mikrolitern biotinylierter Peroxidase H pro Schnitt für 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert. Waschen Sie dann die Schnitte zweimal für jeweils fünf Minuten in PBS und behandeln Sie das Gewebe mit 100 Mikrolitern Avidin Biotin ABC Komplex bei Raumtemperatur.

Nach 45 Minuten waschen Sie die Schnitte zweimal in PBS und inkubieren Sie das Gewebe in der Peroxidase-Substratlösung, bis die Färbung die entsprechende Intensität erreicht. Waschen Sie nun die Abschnitte fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser und färben Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Hämatoxylin gegen. Waschen Sie die Tücher nach der Gegenfärbung erneut in Wasser.

Anschließend entwässern Sie die Schnitte und verwenden Sie ein wasserfreies Einbettmittel, um die Proben mit Deckgläsern zu bestücken. Anschließend können die Schnitte unter einem Hellfeldmikroskop ausgewertet werden. Beginnen Sie damit, die Haut der erwachsenen männlichen Maus vom Oberschenkel, der Lende und der Flanke zu lösen und die Haut beim Entfernen festzustecken.

Dann wird das hintere subkutane Fettgewebe entnommen, das die Leistenlymphknoten an der Basis der Hinterbeine umgibt, um die Adipozyten zu kultivieren. Um die adipogene Differenzierung zu analysieren, legen Sie die differenzierte Fettzellkultur unter einen Abzug und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Als nächstes fixieren Sie die Zellen in zwei ml 10% Formalyn für 60 Minuten.

Am Ende der Fixierung waschen Sie die Zellen in Wasser und behandeln die Kultur fünf Minuten lang mit zwei Millilitern 60%igem Isopropanol, gefolgt von zwei Millilitern ölroter O-Arbeitslösung. Spülen Sie die Zellen nach fünf Minuten mit Leitungswasser aus, bis das Wasser klar ist. Und die Zellen mit Hämatoxylin gegenfärben, wie gerade gezeigt.

Anschließend können die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 100-facher Vergrößerung ausgewertet werden. Die Lipide der Adipozyten erscheinen rot und die Zellkerne blau. Hier sind Ausschnitte des Fettpolsters von Mäusen mit normaler und fettreicher Ernährung zu sehen.

Die Quantifizierung der Größe und Fläche der Adipozyten zeigt deutlich eine Adipozytenhypertrophie nach sechswöchiger fettreicher Diät, was durch die erhöhte Adipozytengröße bei den mit hoher Fettdiät behandelten Tieren belegt wird. Bei Mäusen, die mit dem hypoxischen Marker Pimonidazol behandelt worden waren, ging der erhöhte hypoxische Status des Fettgewebes mit einem Anstieg der HIF1-alpha-positiven Adipozyten einher. Darüber hinaus zeigt die Tunnelfärbung von Fettschnitten von Knock-out- und Kontroll-Wurfpartnern, dass eine Zunahme der Apoptose der Adipozyten mit dem Vorhandensein von Hypoxie und hypoxischer induzierbarer Faktor-1-alpha-Expression korreliert.

Wie erwartet steigt die Hif1a-Expression in den Adipozyten nach 24 Stunden Hypoxie an. Darüber hinaus deutet die Quantifizierung von Hif-Zielgenen durch QPCR darauf hin, dass die erhöhte Expression von Hif1a unter hypoxischen Bedingungen zu einer Erhöhung der Inos-mRNA-Expression führt. Die Stilllegung von Hif1 oder 2 alpha durch RNA-Interferenz rettet die Adipozyten jedoch vor der Apoptose unter hypoxischen Bedingungen, was die sensorische regulatorische Rolle von Hif alpha bei der Apoptose der Adipozyten bestätigt.

Nach diesen Verfahren können alle Assays, wie z. B. die Bestimmung der Glukose- und Insulinresistenz, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Stoffwechselveränderung und zur Dysfunktion der Adipozyten zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die histologische Analyse von Apoptose- und Hypoxiestudien der Adipozyten durchführen.