Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Veränderungen in der neuronalen Regulation der kolonischen Motilität bei Mäusen mittels Videobildgebung zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus dem Bereich der enterischen Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, ob subtile genetische Mutationen in neuronalen Genen die kolonische Motilität beeinflussen. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass das Gewebe eine Zyste darstellt, die unabhängig von Einflüssen des zentralen Nervensystems ist, wodurch die Untersuchung der Beteiligung des enterischen Nervensystems an der Kontrolle der gastrointestinalen Motilität ermöglicht wird.

Diese Technik lässt sich auf die Therapie neurodevelopmentaler Erkrankungen wie Autismus ausdehnen, da Genmutationen, die die synaptische Funktion im Gehirn verändern, möglicherweise auch die Darmmotilität beeinflussen. Beginnen Sie damit, mit Hilfe von anatomischen Pinzette und Schere einen Schnitt durch die Epidermis oberhalb der unteren Bauchmuskelschichten zu führen. Öffnen Sie die Bauchhöhle entlang der Mittellinie bis zum Brustbein.

Befeuchten Sie das Gewebe mit physiologischer Kochsalzlösung und heben Sie mit der Pinzette vorsichtig den Blinddarm vier bis fünf Zentimeter über den Bauchraum an. Dann schneiden Sie mit feinen Dissektionscheren das Mesenterium ab, wobei darauf geachtet werden muss, das Magen-Darm-Gewebe nicht zu berühren, zu dehnen oder zu verletzen. Entfernen Sie die Harnblase, die Hoden und jegliches andere überschüssige Gewebe.

Danach mit großen anatomischen Scheren zwei vertikale Einschnitte etwa 0,5 Zentimeter seitlich der Mittellinie in das Beckenbein auf jeder Seite des Kolons machen und mit der feinen Schere das Rektum vom angrenzenden Beckengewebe lösen. Entfernen Sie das Mesenterium vom Kolon und spülen Sie das gesamte Kolongewebe in einem Becher mit physiologischer Kochsalzlösung ab. Um Fäkalpellets und andere Darminhalte zu entfernen, schneiden Sie zunächst etwa einen Zentimeter vom Ende einer 200-Mikroliter-Pipette ab und verbinden Sie die Pipette mit einer mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllten 5-Milliliter-Spritze.

Danach, nachdem das Caecum und das Rektum entfernt wurden, wird eine Insektennadel am proximalen Ende des Kolons angebracht, wo die Streifungen in der Mukosa sichtbar sind, um das Gewebe zu orientieren. Nun wird das Gewebe am proximalen Ende vorsichtig gehalten, die Pipettenspitze in das Lumen eingeführt und das Salin über den Kolon in einen Abfallbehälter gespült. Anschließend wird mit derselben Spritze und derselben Pipettenspitze jeglicher Schmutz aus der an ein zweikammeriges Organbad angeschlossenen Tubing mit frischer physiologischer Salinlösung ausgespült.

Stellen Sie das Organgefäß so ein, dass die Kammern kontinuierlich mit physiologischer Kochsalzlösung, die mit Carbogen durchbläst wird, überspült werden, und verwenden Sie eine Temperatursonde, um regelmäßig zu überprüfen, dass die Temperatur der Kochsalzlösung zwischen 33 und 37 Grad Celsius bleibt. Verwenden Sie einen Gummistöpsel, durch dessen Mitte ein Glasrohr mit einem Innendurchmesser von fünf Millimetern geführt ist, um den Druck im Zuflussreservoir aufrechtzuerhalten. Tauchen Sie anschließend ein fünf bis sieben Zentimeter langes Stück Colon vollständig in die Kammer des Organgefäßes ein und führen Sie mit Hilfe von Pinzette und handelsüblichem Baumwollnähgarn das proximale Ende des Colon mit dem Einlassrohr und das distale Ende des Colon mit dem Auslassrohr katheterisierend zusammen.

Nach der Bestimmung der Ausgangsentfernung zwischen der proximalen und distalen Kanülierung des Kolons wird das Gewebe 30 Minuten lang in physiologischer Kochsalzlösung equilibriert. Um die Darmbewegungen aufzuzeichnen, während das Kolon sich akklimatisiert, positionieren Sie eine Videokamera 10 bis 15 Zentimeter über dem Organtrog auf einem standardmäßigen Laborstativ und richten Sie die geeignete Videoaufnahmesoftware ein. Sobald die Kamera bereit ist, nehmen Sie vier 15-minütige Videosegmente des Kolons unter Kontrollbedingungen auf.

Anschließend wird die Substanz der Wahl für 30 bis 60 Minuten in das Organkreislaufsystem überströmt, wobei weitere vier 15-Minuten-Videosegmente aufgezeichnet werden. Abschließend ersetzt man die Behandlungslösung durch frische physiologische Kochsalzlösung und nimmt während der einstündigen Ausspülphase vier weitere 15-Minuten-Videosegmente auf. Anschließend können räumlich-zeitliche Karten des Kolons als Reaktion auf die verschiedenen Behandlungsphasen erstellt werden.

Um zu beurteilen, ob synaptische Mutationen kolonale wandernde motorische Komplexe, oder CMMC, verändern, wenn das enterische Nervensystem pharmakologisch beeinflusst wird, wurden in diesem Experiment die 5-HT3- und 4-Rezeptorantagonisten Tropisetron dem Pufferbad der Kolonpräparation zugesetzt. In Gegenwart von Tropisetron zeigten NL3R451C-Mäuse eine Abnahme der CMMC-Frequenz im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfgenossen. Obwohl unter kontrollierten Bedingungen keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontraktilität von Wildtyp und NL3R451C beobachtet wurden, reduzierte Tropisetron die CMMC-Frequenz sowohl bei Wildtyp- als auch bei NL3R451C-Mäusen signifikant.

Außerdem hatte Tropisetron einen stärkeren Einfluss auf die Frequenz der CMMC bei NL3R451C-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden abgeschlossen werden. Achten Sie beim Anwenden dieser Technik darauf, dass das Organgefäß konstant temperiert wird, eine kontinuierliche Zufuhr von Carbogen gewährleistet ist und ein Überlaufen der physiologischen Kochsalzlösung durch ein Vakuum verhindert wird.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Techniken wie die Immunzytochemie angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise ob Veränderungen im Verhältnis der Neuronen oder in der Zellzahl bei Mäusen mit veränderter kolonaler Motilität vorliegen. Seit der Entwicklung dieser Methode war es möglich, eine Vielzahl von Studien zur Darmmotilität in Meerschweinchen und Kaninchen, Ratte und anderen Arten sowie insbesondere in diesem Fall in der Maus durchzuführen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Veränderungen in der neuronalen Regulation der kolonaren Motilität mittels Videobildgebung identifizieren kann.