Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus In Vivo Intrazellulärer Recordings

Das übergeordnete Ziel dieser Methode der intrazellulären Aufzeichnung ist es, die spektrale Empfindlichkeit einzelner Photorezeptorzellen in einem Facettenauge in vivo zu bestimmen. Diese Methode kann uns sagen, ob die Wellenlängen des Lichts, für die eine Zelle empfindlich ist, durch filtrierende Pigmente beeinflusst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Kenntnis der spektralen Empfindlichkeiten einzelner Photorezeptoren vorhersagen können, welchen Farbbereich ein Tier sehen kann.

Um sich auf die Aufnahme vorzubereiten, schalten Sie die Xenonlampe mindestens 45 Minuten vor dem Experiment ein und schalten Sie den Mikroelektrodenabzieher mindestens 30 Minuten vor dem Ziehen der Glaselektroden ein. Schalten Sie anschließend alle Aufnahmegeräte ein. Stellen Sie sicher, dass der Verschluss standardmäßig geschlossen ist, damit kein Licht durch das Glasfaserkabel fällt.

Ziehen Sie dann mit dem Mikroelektrodenabzieher feine Mikroelektroden aus Borosilikatglas heraus. Füllen Sie die Elektroden mit drei molaren Kaliumchlorid auf. Um die Probe vorzubereiten, befestigen Sie unter dem Mikroskop einen einzelnen Schmetterling in einem kleinen Plastikröhrchen mit heißem Wachs, so dass der Kopf unbeweglich ist und aus einem Ende des Röhrchens herausragt.

Befestige dann den Rüssel, die Fühler und die Flügel mit Wachs. Halten Sie danach den Bauch mit einem trockenen Stück Wachs fest. Halten Sie das Röhrchen befeuchtet, indem Sie ein feuchtes Taschentuch hinter den Bauch der Probe legen.

Stellen Sie sicher, dass die Probe völlig unbeweglich ist. Montieren Sie als Nächstes das Rohr mit einem kleinen Stück Wachs auf eine kleine Plattform mit einem Kugelgelenk, das an einem Magnetfuß befestigt ist. Führen Sie unter einem Präpariermikroskop einen Silberdraht über das Mundwerkzeug als Referenzelektrode in den Kopf ein.

Befestigen Sie den Draht vor dem Experiment dauerhaft an der Plattform. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge ein kleines Loch in die linke Hornhaut und verschließen Sie das Loch mit Vaseline, um ein Austrocknen zu verhindern. Sobald die Hornhaut geschnitten ist, führen Sie die Aufzeichnungselektrode so schnell wie möglich in das Auge ein, da die Hämolymphe im Auge schnell aushärtet und das Einführen einer Elektrode unmöglich macht.

Wenn möglich, führen Sie die Dissektion in dem Rig durch, in dem die Aufnahme stattfinden wird. Verbinden Sie dann das Erdungskabel des Kopftisches mit den Krokodilklemmen mit der Referenzelektrode auf der Probenplattform. Montieren Sie die Elektrode auf dem Elektrodenhalter.

Sie anschließend den Silberdraht in die Kaliumchloridlösung in der Mikroelektrode ein. Verwenden Sie eine Lichtquelle mit Schwanenhalsaufsätzen, um die Probe unter einem Stereoskop zu beleuchten, während Sie die Elektrode in das Auge absenken. Stellen Sie den Elektrodenhalter so ein, dass sich die Mikroelektrode direkt über dem zuvor in die Hornhaut geschnittenen Loch befindet.

Senken Sie dann die Mikroelektrode mit dem Mikromanipulator in das Auge ab, bis ein Schaltkreis abgeschlossen ist. Sobald du dich im Auge befindest, schwenkst du das Stereoskop außerhalb des Faradayschen Käfigs. Schalten Sie die Lichtquelle aus, die die Probe beleuchtet, und lassen Sie das Insekt 10 bis 20 Minuten lang im Dunkeln, damit es sich an die Dunkelheit gewöhnen kann.

Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode, indem Sie einen Nanoampere-Strom anlegen und die Spannungsänderung notieren. Der Widerstand sollte typischerweise im Bereich zwischen 100 und 250 Megaohm liegen. Aktivieren Sie als Nächstes den Impulsgenerator, um für die Dauer des Experiments einen Lichtblitz abzugeben, und richten Sie das Glasfaserkabel auf das Auge.

Überprüfen Sie das Oszilloskop bei jedem Lichtblitz auf Spannungsänderungen. Eine negative Spannungsänderung bedeutet, dass die Elektrode noch nicht in die Zelle eingedrungen ist. Bewegen Sie das Glasfaserkabel um die Probe, bis eine maximale Spannungsreaktion beobachtet wird.

Um eine depolarisierende Lichtempfindlichkeit zu erzeugen, drehen Sie den Mikromanipulator hin und her, was zu kleinen vertikalen Bewegungen der Elektrode führt, während Sie leicht auf die Basis des Elektrodenhalters klopfen oder die Buzz-Funktion am Vorverstärker verwenden. Nehmen Sie weitere kleine Anpassungen vor, bis eine depolarisierende Lichtempfindlichkeit auf dem Oszilloskop angezeigt wird. Passen Sie dann das Glasfaserkabel an, um das größte depolarisierende Signal zu finden.

Nehmen Sie kleine Anpassungen mit einem Mikromanipulator vor und verwenden Sie bei Bedarf die Buzz-Funktion am Verstärker, um sicherzustellen, dass die Elektrode die Zelle stabil aufzeichnet. Eine stabile Aufnahme sollte wenig bis gar keine Veränderung des Ruhepotenzials, ein geringes Hintergrundrauschen und eine gleichbleibend große depolarisierende Reaktion aufweisen. Es ist wichtig, eine stabile Aufzeichnung zu haben, bei der das Ruhemembranpotential nicht verrauscht ist und sich im Laufe der Zeit nicht ändert.

Die Antworten sollten groß und positiv sein, ohne Hyperpolarisation. Sobald das Setup stabil ist, öffnen Sie die Software und schließen Sie das Dialogfeld "Experimentegalerie", um ein Popup-Fenster mit vier Kanälen zu öffnen. Stellen Sie die Spannungsskala in der oberen rechten Ecke des Softwarefensters auf 500 Millivolt ein.

Klicken Sie dann in der unteren rechten Ecke auf Start, um die Aufnahme zu starten. Minimieren Sie die Kanäle drei und vier und passen Sie die X- und Y-Skala an. Lassen Sie die Software dann für die Dauer des Experiments laufen.

Für die Stimulation von Weißlicht können Sie bis zu 10 einzelne Reaktionen aufzeichnen, wobei das ND-Filterrad auf den höchsten OD eingestellt ist, der noch eine Reaktion hervorruft. Hier wird die Änderung des Ansprechverhaltens bei 3,0 OD und 2,0 OD gezeigt. Zeichnen Sie als Nächstes in jeder Kombination die gleiche Anzahl von Antworten von 3,5 bis 0,0 OD auf, um eine Intensitätskurve des Antwortprotokolls bereitzustellen. Bevor Sie die Reaktion der Zelle auf alle Wellenlängen mit den Interferenzfiltern aufzeichnen, finden Sie zunächst schnell die Spitzenwellenlänge.

Ohne ND-Filter im Strahlengang platzieren Sie dort einen UV-durchlässigen Filter und beobachten Sie kurz die Ansprechamplitude. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem blauen Sendefilter, einem grünen Sendefilter und einem roten Sendefilter, der eine Vorstellung davon geben sollte, wo der Spitzenwert liegen wird. Nehmen Sie unter der Filterwellenlänge auf, die die maximale Reaktion ergibt, bevor Sie zu einem anderen Interferenzfilter wechseln.

Lassen Sie die Zelle zwischen der Aufnahme und nachfolgenden Filtern auf ein bis zwei weiße Lichtblitze reagieren, ohne dass ein Filter im Strahlengang vorhanden ist, um zu überwachen, ob sich die Spitzenreaktion im Laufe der Zeit verschlechtert. Nehmen Sie dann mit anderen Interferenzfiltern auf und lassen Sie bis zu 10 Antworten pro Filter zu. Dies ist ein Beispiel für eine große negative Spannungsänderung, die kurz vor dem Eintritt in eine Zelle zu sehen ist.

Hier ist eine saubere Aufnahme zu sehen, die wenig Hintergrundrauschen und ein großes depolarisierendes Ansprechverhalten aufweist, typischerweise von mindestens 40 Millivolt. Und hier ist ein Beispiel für eine schlechte Aufnahme, aufgrund der negativen Potentialänderung nach dem Hauptpeak. Dies ist ein weiteres Beispiel für eine schlechte Aufnahme.

Das Ruhepotential unterliegt großen Schwankungen, und die große Menge an Hintergrundgeräuschen kann die Amplitude des Frequenzgangs verdecken. Dies ist ein repräsentatives Beispiel für spektrale Empfindlichkeit, die aus einer einzigen Aufnahme abgeleitet wurde. Die Zelltypen werden nach der Spitzenempfindlichkeit bei einer ähnlichen Wellenlänge und der Gesamtform des Empfindlichkeitsspektrums klassifiziert.

Dieselben Zelltypen werden dann gemittelt, und die mittlere Empfindlichkeit wird mit Standardfehlerbalken bei jeder Wellenlänge dargestellt. Diese Grafik zeigt die spektrale Empfindlichkeit von drei typischen Zelltypen, die in einem Insekt vorkommen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Verhaltensexperimente durchgeführt werden, um festzustellen, ob alle Photorezeptorzelltypen zur Farbunterscheidung beitragen oder nicht.