Name: Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus In Vivo Intrazellulärer Recordings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die intrazelluläre Ableitung zur Bestimmung der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Facettenauge von Schmetterlingen. Diese Methode ermöglicht Vorhersagen zum Farbsehen.

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Wir danken dem späten Rudy Limburg für die Kardan Armumfang Herstellung, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, und Raju Metherate uns Ausrüstung für die Kreditvergabe, und Almut Kelber und Kentaro Arikawa, für Ermutigung. Diese Arbeit wurde von einem National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship an KJM und NSF Zuschuss IOS-1257627 ADB unterstützt

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die intrazelluläre Aufnahme kann eine schwierige Technik, aufgrund der vielen technischen Schritte zu meistern beteiligt. Für eine erfolgreiche Experimente müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, eine richtig schwingungsisolierten Tisch zu haben, an dem das Experiment durchgeführt wird. Viele Forscher verwenden Luft-Tabellen, die vollständig die Tischplatte von der Basis trennen, überlegene Schwingungsisolierung zu geben. Unser Setup beinhaltet einen dicken Marmortisch mit einem Sand...

Die elektrischen Eigenschaften von Zellen, wie Neuronen werden durch Messen Ionenfluss durch die Zellmembranen als Änderung der Spannung oder des Stroms beobachtet. Eine Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken entwickelt worden bioelektrischen Ereignisse in Zellen zu messen. Neurone in den Augen von Tieren zugänglich sind und ihre Schaltungsanordnung ist oft weniger komplex als im Gehirn, diese Zellen gute Kandidaten für eine elektrophysiologische Untersuchung zu machen. Gängige Anwendungen von Elektro im Auge umfassen Elektroretinogramm (ERG) 1,2 und Mikroelektroden intrazelluläre Aufnahme. ERG beinhaltet in oder auf dem Auge eines Tieres eine Elektrode platziert, ein Lichtreiz Anwendung und Messung der Änderung der Spannung als Summe der Antworten aller Zellen in der Nähe 3-6. Wenn man bei der Charakterisierung von spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen speziell interessiert ist, oft mehrere Zelltypen gleichzeitig an verschiedenen Stärken auf einen bestimmten Reiz reagieren; somitschwierig sein kann, die Empfindlichkeiten von spezifischen Zelltypen aus ERG-Daten zu bestimmen, insbesondere dann, wenn verschiedene Arten von spektral ähnlichen Sehzellen im Auge sind. Eine mögliche Lösung ist transgene Drosophila mit dem Photorezeptor (Opsin) Gen von Interesse in den meisten R1-6 Zellen im Auge ausgedrückt zu schaffen und führen Sie dann ERG 7. Mögliche Nachteile dieser Methode sind nicht zu niedrig Expression des Proteins Photorezeptor 8, und die lange Zeitrahmen für die Erzeugung und das Screening von transgenen Tieren. Für Augen mit weniger Arten von spektral unterschiedlichen Photorezeptoren, die Anpassung des Auges mit farbigen Filter können mit Absenken der Beitrag einiger Zelltypen zu dem ERG, wodurch Schätzung der spektralen Empfindlichkeitsmaxima 9 helfen. Die intrazelluläre Aufnahme ist eine weitere Technik, wo eine feine Elektrode, die eine Zelle und ein Stimulus spießt angewendet wird. Die Elektrodenaufzeichnungen nur, dass indivIdual Zelle Antwort , so dass von der Aufnahme und mehreren einzelnen Zellen 10-14 spezifischen Empfindlichkeiten von physiologisch unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren ergeben. Obwohl unser Protokoll auf der Analyse der spektralen Empfindlichkeit konzentriert, sind die grundlegenden Prinzipien der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden für andere Anwendungen modifizierbar. Mit einer anderen Vorbereitung einer Probe, zum Beispiel, und mit scharfen Quarzelektroden kann man aus tiefer in den optischen Loben oder anderen Regionen im Gehirn, die sich an der Frage abhängig gefragt. Zum Beispiel Antwortzeiten einzelner Sehzellen 15, Zell - Aktivität in den optischen Loben 16 (Lamina, Medulla oder Lobula 17), Gehirn 18 oder andere Ganglien 19 kann auch mit ähnlichen Techniken aufgezeichnet werden, oder Farbreize mit Polarisation ersetzt werden könnte 20 -22 oder Bewegungsreize 23,24. Phototransduktion, das Verfahren, mit dem LichtEnergie absorbiert und in ein elektrochemisches Signal, ist ein altes Merkmal gemeinsam fast alle heutigen Tierstämme 25. Die visuelle Pigment gefunden in Sehzellen und verantwortlich für Phototransduktion Einleitung ist Rhodopsin. Rhodopsine in allen Tieren sind aus einem Opsin - Protein, einem Mitglied der 7 transmembranen G - Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie und ein zugehöriges Chromophor hergestellt , das aus der Netzhaut oder ein ähnliches Molekül 26,27 ableitet. Opsin Aminosäuresequenz und chromophore Struktur beeinflussen die Absorption von auf verschiedene Wellenlängen von Licht Rhodopsin. Wenn ein Photon durch den Chromophor absorbiert wird das Rhodopsin aktiviert wird, einen G-Protein - Kaskade in der Zelle initiiert, die an der Öffnung der membrangebundenen Ionenkanäle 28 schließlich führt. Anders als die meisten Neuronen unterziehen Sehzellen abgestufter Potentialänderungen, die Lichtreizes als relative Änderung der Reaktionsamplitude mit wechselnden gemessen werden kann. Typischerweise eine gegebenePhotorezeptortyp drückt nur ein Opsin - Gen (obwohl Ausnahmen existieren 8,10,29-31). Anspruchsvolle Farbsehen, wie sie in vielen Wirbeltieren und Gliederfüßern gefunden wird, wird mit einem komplexen Auge von Hunderten oder Tausenden von Sehzellen erreicht jeweils ein oder gelegentlich mehr Rhodopsin Arten ausdrücken. Visuelle Information wird durch den Vergleich Antworten, die über dem Fotoaufnehmer Mosaik über komplexe nachgeschalteten neuronalen Signalisierung im Auge und Gehirn erfasst, was in der Wahrnehmung eines Bildes komplett mit Farbe und Bewegung. die rohen Antworten eines Sehzellen auf unterschiedliche Wellenlängen des Lichts über die intrazelluläre Aufnahme Nach der Messung ist es möglich, seine spektrale Empfindlichkeit zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf dem Prinzip der Univariance, die besagt , dass eine Reaktion der Photorezeptorzelle auf der Zahl der Photonen abhängig ist, aber nicht auf die besonderen Eigenschaften der Photonen absorbiert es 32 absorbiert. Jedes Photon, das abso istrbed von Rhodopsin wird die gleiche Art von Reaktion induzieren. In der Praxis bedeutet dies , dass eine rohe Reaktionsamplitude der Zelle entweder aufgrund einer Erhöhung der Lichtintensität (mehr Photonen zu absorbieren) zu erhöhen, oder zu einer Verschiebung der Wellenlänge in Richtung auf seine maximale Empfindlichkeit (höhere Wahrscheinlichkeit von Rhodopsin , dass die Wellenlänge absorbieren). Wir nutzen dieses Prinzip in Bezug zellulären Reaktionen bei bekannter Intensität und der gleichen Wellenlänge zu Reaktionen bei unterschiedlichen Wellenlängen und der gleichen Intensität, aber unbekannten relative Empfindlichkeit. Zelltypen werden oft von der Wellenlänge, bei der ihre Empfindlichkeit Peaks identifiziert. Hier zeigen wir eine Methode für die intrazelluläre Aufnahme und Analyse der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Auge eines Schmetterlings, mit einem Fokus auf machen diese Methode besser zugänglich zu der weiteren Forschung. Obwohl die intrazelluläre Aufnahme in der Literatur häufig bleibt, vor allem in Bezug auf das Farbsehen bei Insekten, haben wir gefunden, that Beschreibungen der Materialien und Verfahren sind in der Regel zu kurz für die Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Wir präsentieren diese Methode im Video-Format mit dem Ziel, die leichter Replikation ermöglicht. Wir beschreiben auch die Technik leicht erhältlich und preisgünstige Ausrüstung. Wir wenden uns an gemeinsamen Vorbehalte, die oft nicht gemeldet werden, die Forschung verlangsamen, wenn eine neue und komplexe Technik zu optimieren.

<table><tbody><tr><td>Schmetterlingspuppen</td><td></td><td></td><td>Mehrere lokale Arten verfügbar, benötigen USDA-Genehmigungen für den Versand. Carolina Bio Supply verfügt über mehrere Insektenarten, die innerhalb der USA bestellt werden können, ohne dass zusätzliche Genehmigungen erforderlich</td></tr> sind <tr><td>Großer Kunststoffzylinder</td><td></td><td></td><td>Jede Kammer, die befeuchtet bleibt</td></tr><tr><td>, funktioniert Insektenstifte, Größe 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe's</td><td></td><td>Jede Honig- oder Saccharoselösung funktioniert</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel ist jetzt ein Teil der Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel ist jetzt ein Teil der Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel ist jetzt ein Teil der Newport</td></tr><tr><td>Corporation Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel ist jetzt ein Teil der Newport Corporation</td></tr><tr><td>Schienenträger, klein (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel ist jetzt Teil von Newport</td></tr><tr><td>Corporation Gewindeadapter, 8-32 Stecker auf 1/4-20 Stecker, Packung mit 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Montagepfosten, 1,0 Zoll, 0,5 Zoll Durchmesser, Edelstahl, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Optischer Pfostenhalter ohne Schlupf, 2 Zoll, 0,5 Zoll Durchmesser Pfosten, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fester Linsenanschluss, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fester Linsenanschluss, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Kondensorlinsen</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Konvexe Siliziumdioxid-Linse, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Filterrad mit sechs Positionen, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filterradhalterung Nabe</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Konkave Siliziumdioxid-Linse, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Kollimatorhalter</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Kollimierende Strahlsonde</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Aderendhülsenkonverter, SMA-Anschluss auf 11 mm Standard-Aderendhülse</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Mit diesem Adapter kann die Glasfaser in den Kollimatorhalter eingesetzt werden.</td></tr><tr><td>600 μm m Durchmesser UV-vis Faser obtic</td><td>Kabel Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel ist jetzt Teil der Newport</td></tr><tr><td>Corporation Shutter mit Antriebseinheit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallic-ND-Filter, 0,1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallic-ND-Filter, 0,3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallic-ND-Filter, 0,5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallischer ND-Filter, 1,0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallischer ND-Filter, 2,0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV-Quarzglas Metallischer ND-Filter, 3,0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal Lampe</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Stör-Bandpassfilter, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Störbandpassfilter, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Interferenz-Bandpassfilter, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td></td><td></td><td>Es funktioniert jede Metallkonstruktion, die geerdet werden kann und die zum Versuchsaufbau passt.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop, 6X, 12X, 25X, 50X Vergrößerung</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Jedes Stereomikroskop ist geeignet</td></tr><tr><td>Mikroskopstativ mit Schwingarm und schwerem Sockel</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Jeder schwere Sockel mit Arm eignet sich für</td></tr><tr><td>Kardanarm</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung, siehe Abbildung 4</td></tr><tr><td>Fiber-lite Hochleistungsbeleuchtung</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Für Beleuchtungsmuster</td></tr><tr><td>Fiber-lite Schwanenhals-Lichtleiter</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Jeder Schwanenhals-Lichtleiter ist geeignet</td></tr><tr><td>Marmortisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erhöhter Holztisch</td><td></td><td></td><td>Durch diesen Tisch sollte ein Loch geschnitten werden, damit der Sandkasten auf dem darunter liegenden Marmortisch ruhen kann</td></tr><tr><td>Holzkiste gefüllt mit Sand</td><td></td><td></td><td>nach Maß, jede Kiste mit Sand</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probentisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krokodilklemme Drähte zur Erdung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolierter Kupferdraht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht mit 0,125 mm Durchmesser</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510 BNC-Kabel</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorverstärker mit Kopfstufe</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Noise Reducer</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-Triggering, ohne Sonde</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-Adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab Hardware 2/20</td><td>ADI Instrumente</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Software für Laborcharts</td><td>ADI</td><td>instruments Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Pulse Generator</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Borosillikat Glaskapillaren mit Filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffrohr</td><td></td><td></td><td></td>mit Schlitz</tr><tr><td>Wachs bei niedriger Schmelztemperatur Lötkolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Weller-Plattform</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit Kugel-und-Sockel-Magnetfuß</td><td>Hama Foto und Video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelschneidiger Kohlenstoffstahl, zerbrechliche Rasierklinge</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der sehzellen spektrale empfindlichkeit in einem insekt modell aus<em&gt; in vivo</em&gt; intrazellulärer recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intrazellulärer Aufnahme ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um zu bestimmen, wie eine einzelne Zelle auf einen gegebenen Reiz reagieren. In einer Vision Forschung, hat die intrazelluläre Aufnahme war in der Vergangenheit eine übliche Technik zu studieren Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen auf verschiedene Lichtreize verwendet, die noch heute verwendet wird. Es bleibt jedoch ein Mangel an detaillierten Methodik in der Literatur für die Forscher die intrazelluläre Aufnahme Experimente im Auge zu replizieren wollen. Hier präsentieren wir das Insekt als Modell für die Untersuchung Augenphysiologie allgemeiner. Insekten Sehzellen sind in der Nähe der Oberfläche des Auges angeordnet und sind daher leicht zu erreichen, und viele der Mechanismen in der Vision beteiligt sind, über Tierphyla konserviert. Wir beschreiben das grundlegende Verfahren für in vivo intrazelluläre Aufnahme von Sehzellen im Auge eines Schmetterlings, mit dem Ziel, diese Technik für Forscher mit wenig Erfahrung in electrophysiology. Wir stellen die Grundausstattung benötigt, wie ein Live-Schmetterling zur Vorbereitung der Aufnahme, wie ein Glas-Mikroelektrode in eine einzelne Zelle einfügen, und schließlich die Aufnahmeverfahren selbst. Wir erklären auch die grundlegende Analyse der rohen Reaktionsdaten für die spektrale Empfindlichkeit der einzelnen Zelltypen zu bestimmen. Obwohl unser Protokoll über die Bestimmung spektraler Empfindlichkeit konzentriert, andere Reize (zB polarisiertes Licht) und Variationen des Verfahrens sind zu diesem Setup anwendbar.

Für viele Elemente der Aufnahme - Setup, eine schriftliche Beschreibung liefert nicht genügend Detail. 1 ist eine schematische Darstellung der Komponenten in der gesamten Aufnahme - Setup beteiligt. In Figur 2 Spektren werden für weißes Licht und jeden Interferenzfilter ein Gefühl dafür , warum ein Korrekturfaktor benötigt wird, aufgetragen , und was benötigt wird , um diese Korrektur zu berechnen. 3 zeigt Bilder und ein Diagramm des Cardan Arm , die für diese ...

Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen.

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus<em&gt; In Vivo</em&gt; Intrazellulärer Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode der intrazellulären Ableitung besteht darin, die spektrale Empfindlichkeit einzelner Photorezeptorzellen im zusammengesetzten Auge eines Insekts in vivo zu bestimmen. Mit dieser Methode können wir feststellen, ob die Wellenlängen des Lichts, auf die eine Zelle empfindlich reagiert, durch Filterpigmente beeinflusst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir anhand der spektralen Empfindlichkeiten einzelner Photorezeptoren vorhersagen können, welchen Farbbereich ein Tier wahrnehmen kann.Um sich auf die Aufnahme vorzubereiten, schalten Sie die Xenonlampe mindestens 45 Minuten vor dem Experiment ein und schalten Sie den Mikroelektrodenzieher mindestens 30 Minuten vor dem Ziehen der Glaselektroden ein. Schalten Sie danach die gesamte Aufnahmeelektronik ein. Stellen Sie sicher, dass der Verschluss standardmäßig geschlossen ist, sodass kein Licht durch das Glasfaserkabel gelangt.Danach feine Borosilikatglasmikroelektroden mit dem Mikroelektrodenzieher ziehen. Die Elektroden mit dreimolarer Kaliumchloridlösung rückwärts befüllen. Um die Probe vorzubereiten, unter dem Mikroskop einen einzelnen Schmetterling mit hei&szlig;em Wachs in einem kleinen Plastikröhrchen befestigen, sodass der Kopf bewegungsunf&auml;hig ist und aus einem Ende des Röhrchens hervorragt.Fixieren Sie dann den Rüssel, die Fühler und die Flügel mit Wachs. Danach drücken Sie das Abdomen mit einem trockenen Wachsstück nach unten. Halten Sie die Röhre feucht, indem Sie ein angefeuchtetes Papiertuch in die Röhre hinter das Abdomen des Exemplars legen.Stellen Sie sicher, dass das Präparat vollständig bewegungslos ist. Befestigen Sie anschließend das Röhrchen mit einem kleinen Wachsstück auf einer kleinen Plattform mit Kugelgelenk, die an einer magnetischen Basis befestigt ist. Setzen Sie unter einem Stereomikroskop einen Silberdraht über den Mundteil in den Kopf ein, der als Referenzelektrode dient.Bevor das Experiment beginnt, befestigen Sie den Draht dauerhaft an der Plattform. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge ein kleines Loch in die linke Hornhaut und verschließen Sie es mit Vaseline, um Austrocknung zu verhindern. Sobald die Hornhaut geöffnet ist, führen Sie die Ableitelektrode so schnell wie möglich ins Auge ein, da die Hämolymphe im Auge rasch verhärtet und das Einführen einer Elektrode unmöglich macht.Führen Sie die Dissektion nach Möglichkeit an dem Gerät durch, an dem auch die Aufzeichnung erfolgen soll. Anschließend verbinden Sie den Masseanschluss der Verstärkereinheit mit der Referenzelektrode auf der Präparatplattform mithilfe der Krokodilklemmen. Befestigen Sie die Elektrode am Elektrodenhalter.Setzen Sie anschließend den Silberdraht in die Kaliumchloridlösung innerhalb der Mikroelektrode ein. Beleuchten Sie die Probe unter einem Stereomikroskop mit einer Lichtquelle, die mit Schwanenhals-Anschlüssen ausgestattet ist, während Sie die Elektrode in das Auge einführen. Stellen Sie den Elektrodenhalter so ein, dass die Mikroelektrode genau über der zuvor in die Hornhaut geschnittenen Öffnung positioniert ist.Danach senken Sie die Mikroelektrode mit Hilfe des Mikromanipulators in das Auge ab, bis ein Stromkreis geschlossen wird. Sobald sich die Elektrode im Auge befindet, schwenken Sie das Stereomikroskop aus dem Faradayschen Käfig heraus. Schalten Sie die Lichtquelle, die das Präparat beleuchtet, aus und lassen Sie das Insekt 10 bis 20 Minuten im Dunkeln, um eine Dunkeladaption zu ermöglichen.Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode, indem Sie einen Nanoampere-Strom anlegen und die Spannungsänderung notieren. Der Widerstand sollte typischerweise zwischen 100 und 250 Megaohm liegen. Aktivieren Sie anschließend den Pulsgeber, um während der gesamten Dauer des Experiments einen Lichtblitz auszulösen, und richten Sie das Glasfaserkabel auf das Auge aus.Überprüfen Sie das Oszilloskop auf Spannungsänderungen bei jedem Lichtblitz. Eine negative Spannungsänderung bedeutet, dass die Elektrode die Zelle noch nicht erreicht hat. Bewegen Sie das Glasfaserkabel um das Präparat, bis eine maximale Spannungsantwort beobachtet wird.Um eine depolarisierende Lichtantwort zu erzeugen, bewegen Sie den Mikromanipulator hin und her, wodurch sich die Elektrode geringfügig vertikal bewegt, während Sie leicht auf den Sockel des Elektrodenhalters klopfen oder die „Buzz“-Funktion auf dem Vorverstärker verwenden. Nehmen Sie solange kleine Einstellungen vor, bis eine depolarisierende Lichtantwort auf dem Oszilloskop erscheint. Anschließend justieren Sie den Glasfaserkabel, um das größte depolarisierende Signal zu finden.Nehmen Sie kleine Einstellungen mit einem Mikromanipulator vor und nutzen Sie bei Bedarf die „Buzz“-Funktion des Verstärkers, um sicherzustellen, dass die Elektrode die Zelle stabil aufzeichnet. Eine stabile Aufzeichnung sollte kaum oder gar keine Änderungen im Ruhepotential aufweisen, ein geringes Hintergrundrauschen aufweisen und eine stets große depolarisierende Antwort zeigen. Es ist entscheidend, eine stabile Aufzeichnung zu haben, bei der das Ruhepotential der Membran nicht verrauscht ist und sich im Zeitverlauf nicht verändert.Die Antworten sollten groß und positiv sein, ohne Hyperpolarisation. Sobald die Einrichtung stabil ist, öffnen Sie die Software und schließen Sie das Dialogfeld namens „Experiments Gallery“, um ein Popup-Fenster mit vier Kanälen zu öffnen. Stellen Sie die Spannungsskala in der oberen rechten Ecke des Softwarefensters auf 500 Millivolt ein.Klicken Sie dann unten rechts auf „Start“, um die Aufnahme zu beginnen. Minimieren Sie die Kanäle drei und vier, und stellen Sie die X- und Y-Skala ein. Lassen Sie die Software anschließend für die gesamte Dauer des Experiments laufen.Bei der Stimulation mit weißem Licht werden bis zu 10 einzelne Antworten aufgezeichnet, wobei das ND-Filterrad auf der höchsten Extinktion (OD) steht, die noch eine Antwort hervorruft. Hier wird die Änderung der Antwort bei 3,0 OD und 2,0 OD gezeigt. Danach werden die gleiche Anzahl von Antworten von 3,5 bis 0,0 OD in jeder Kombination aufgezeichnet, um eine Antwort-Log-Intensitätskurve zu erstellen. Bevor die Antwort der Zelle auf alle Wellenlängen mithilfe der Interferenzfilter aufgezeichnet wird, bestimmt man zunächst schnell die Spitzenwellenlänge.Ohne ND-Filter im Lichtweg setzen Sie einen UV-durchlässigen Filter ein und beobachten kurz die Amplitude der Antwort. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem blau-durchlässigen, einem grün-durchlässigen und einem rot-durchlässigen Filter, um eine Vorstellung davon zu erhalten, bei welcher Wellenlänge die maximale Antwort liegt. Notieren Sie die Aufzeichnung unter der Filterwellenlänge, die die maximale Antwort liefert, bevor Sie zu einem anderen Interferenzfilter wechseln.Zwischen den Aufnahmen mit nachfolgenden Filtern sollte die Zelle auf ein bis zwei Blitze mit weißem Licht ohne Filter im Lichtweg reagieren, um zu überwachen, ob die Spitzenantwort im Laufe der Zeit abnimmt. Danach Aufnahmen mit anderen Interferenzfiltern durchführen und bis zu 10 Antworten pro Filter zulassen. Dies ist ein Beispiel für eine große negative Spannungsänderung, die unmittelbar vor dem Eindringen in eine Zelle beobachtet wird.Hier ist eine saubere Aufnahme gezeigt, die wenig Hintergrundrauschen aufweist und eine große depolarisierende Antwort, typischerweise von mindestens 40 Millivolt. Und hier ist ein Beispiel einer schlechten Aufnahme, bedingt durch die negative Potentialänderung nach dem Hauptpeak. Dies ist ein weiteres Beispiel einer schlechten Aufnahme.Das Ruhepotential zeigt starke Schwankungen, und die hohe Menge an Hintergrundrauschen kann die Amplitude der Antwort verdecken. Dies ist ein repräsentatives Beispiel für die spektrale Empfindlichkeit, abgeleitet aus einer einzelnen Ableitung. Die Zelltypen werden anhand der maximalen Empfindlichkeit bei einer ähnlichen Wellenlänge sowie der Gesamtform des Empfindlichkeitsspektrums klassifiziert.Die gleichen Zelltypen werden anschließend gemittelt, und die mittlere Empfindlichkeit wird mit Standardfehlerbalken bei jeder Wellenlänge dargestellt. Dieses Diagramm zeigt die spektralen Empfindlichkeiten von drei typischen Zelltypen, die bei einem Insekt vorkommen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden.Mit dieser Methode können Verhaltensexperimente durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob alle Typen von Photorezeptorzellen zur Farbdiskriminierung beitragen oder nicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Photorezeptoraktivität im Auge einer immobilisierten Drosophila, das eine präzise Messung von Spannungsänderungen als Reaktion auf Lichtreize ermöglicht.

Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

Das Video zeigt, wie die elektrische Aktivität in den Photorezeptorneuronen des Ommatidiums von Drosophila aufgezeichnet wird, indem eine Ganzzellkonfiguration etabliert wird. Es hebt die Aktivierung transienter Rezeptorpotentialkanäle durch Lichtimpulse hervor, was zu messbaren Quantenbumps führt.

Ganzzell-Spannungsklemmen-Aufzeichnungen von Drosophila-Photorezeptoren

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur intrazellulären Aufzeichnung von Photorezeptorzellen im Auge eines Schmetterlings in vivo und zur Bestimmung der spektralen Empfindlichkeit einzelner Zelltypen. Diese Technik ermöglicht es, die Empfindlichkeit einzelner Photorezeptorzellen gegenüber unterschiedlichen Lichtreizen zu untersuchen.

In vivo Intrazelluläre Aufzeichnung der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptorzellen bei einem Schmetterling

Quelle: Wagner, K. et al., Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen. J. Vis. exp. (2022). Dieses Video zeigt die Visualisierung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten TRPL-Proteinen. Es beschreibt die Vorbereitung transgener Fliegen für die Bildgebung, die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Photorezeptorzellen und die Quantifizierung des TRPL-Transports...

Untersuchung des Transports von Membranproteinen in Drosophila-Photorezeptorzellen

Scharfe Mikroelektroden ermöglichen eine genaue elektrophysiologische Charakterisierung der Photorezeptor- und visuellen Interneuronenleistung in lebenden Drosophila. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode qualitativ hochwertige Spannungsreaktionen einzelner Zellen auf kontrollierte Lichtstimulation aufzeichnen kann. Diese Methode ist ideal, um die neuronale Informationsverarbeitung in Facettenaugen von Insekten zu untersuchen.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Ein Protokoll zur Untersuchung der Desensibilisierung und Empfindlichkeit sebung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit wird vorgestellt.

Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus

Wir präsentieren ein Protokoll zur elektrophysiologischen Charakterisierung bistabiler Photopigmente: (i) Ausnutzung der Ladungsverschiebungen innerhalb der Photopigmentmoleküle nach Photonenabsorption und ihrer riesigen Menge in den Photorezeptoren und (ii) Ausnutzung der Absorptionsspektrenunterschiede von Rhodopsin- und Metarhodopsin-Photopigmentzuständen. Diese Protokolle sind nützlich, um nach Mutationen zu suchen, die bistabile Photopigmentsysteme betreffen.

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Erfahren Sie die intrazelluläre Ableitung zur Bestimmung der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Facettenauge von Schmetterlingen. Diese Methode ermöglicht Vorhersagen zum Farbsehen.

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus

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