Multi-Target-Chromogenic Whole-mount
31. Januar 2016
Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.
Das übergeordnete Ziel der chromogenen Mehrfachziel-WISH-Methode besteht darin, die Kartierung von mRNA-Verteilungsmustern in intakten Drosophila-Embryonen zu erleichtern. Mit dieser Methode können die mRNA-Lokalisationen von drei verschiedenen Genen direkt im selben Embryo verglichen werden. Die mehrfarbige WISH kann verwendet werden, um Genexpressionskarten in sich entwickelnden Organismen schnell und zuverlässig zu erstellen. Dies kann wichtige Hinweise auf genregulatorische Interaktionen, aktive embryonale Entwicklung oder Organogenese liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass mRNA-Expressionsmuster verschiedener Gene in deutlich voneinander abweichenden und kontrastierenden Farben visualisiert werden. Auf diese Weise können eindeutige sowie überlappende Expressionsorte mit hoher Genauigkeit hervorgehoben werden. Sammeln, dechorionieren, fixieren und devitellinisieren Sie die benötigten Embryonen mithilfe standardisierter Verfahren. Lagern Sie sie bis zum Gebrauch in Methanol im Gefrierschrank. Beginnen Sie nun mit den Embryonen bei Raumtemperatur. Setzen Sie einen Insert in die erste Vertiefung einer 12-Loch-Platte ein und geben Sie zwei Milliliter Methanol hinzu. Überführen Sie die gewünschte Menge an Embryonen in den Insert, der während des gesamten Verfahrens zur Handhabung der Embryonen dient. Rehydrieren Sie nun die Embryonen durch dreiminütige Inkubationen in einer absteigenden Methanolreihe. Beginnen Sie mit 75 % Methanol in PBS, gefolgt von 50 % Methanol in PBS-T. Danach verwenden Sie 25 % Methanol in PBS-T und schließen mit zwei Inkubationen in reinem PBS-T ab. Fixieren Sie die Embryonen anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd in PBS. Entfernen Sie das Fixativ durch vier Waschschritte in PBS-T. Während der Waschschritte tauen und bereiten Sie die Arbeitslösungen für Proteinase K und Glycin auf. Nach den Waschungen permeabilisieren Sie die Embryonen drei Minuten bei Raumtemperatur in frisch zubereiteter Proteinase-K-Lösung. Stoppen Sie die Reaktion durch zwei einminütige Waschungen in frisch zubereiteter Glycin-Lösung. Führen Sie danach eine Nachfixierung der Embryonen 20 Minuten bei Raumtemperatur in 4 % Paraformaldehyd in PBS durch. Waschen Sie das Paraformaldehyd durch vier Waschungen mit jeweils drei Minuten Dauer in PBS-T aus. Überführen Sie danach die Embryonen in den Vorhybridisierungspuffer. Sie können bis zum Gebrauch im Gefrierschrank gelagert werden. Beginnen Sie damit, die Embryonen in Vorhybridisierungspuffer auf 2-Milliliter-Röhrchen zu verteilen. Portionieren Sie etwa 15 Mikroliter gesetzter Embryonen in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie nun die Embryonen bei 65
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren für die mehrfache chromogene Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung (MC-WISH) an Drosophila-Embryonen vorgestellt. Die Methode ermöglicht den simultanen Nachweis dreier verschiedener mRNA-Verteilungsmuster unter Verwendung kontrastierender Farbpräzipitate.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genexpressionsanalyse
Hintergrund
- Die Abbildung von mRNA-Verteilungsmustern ist entscheidend, um genregulatorische Wechselwirkungen zu verstehen.
- MC-WISH ermöglicht den Vergleich der Genexpression innerhalb desselben Embryos.
- Diese Technik macht eindeutige und überlappende Expressionsorte mit hoher Genauigkeit sichtbar.
- Sie ist anwendbar bei der Untersuchung der embryonalen Entwicklung und der Organogenese.
Zweck der Studie
- Um die Kartierung von mRNA-Verteilungsmustern in intakten Drosophila-Embryonen zu erleichtern.
- Um eine schnelle und zuverlässige Methode zur Erstellung von Genexpressionskarten bereitzustellen.
- Um das Verständnis von Genwechselwirkungen während der Entwicklung zu vertiefen.
Verwendete Methoden
- Sammlung und Fixierung von Drosophila-Embryonen.
- Rehydratisierung mittels absteigender Methanolreihe.
- Permeabilisierung mit Proteinase K.
- Postfixierung und Hybridisierung in Prähybridisierungspuffer.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern in unterschiedlichen Farben.
- Möglichkeit zum Vergleich der Expression von drei verschiedenen Genen gleichzeitig.
- Hohe Genauigkeit bei der Identifizierung überlappender Expressionsstellen.
- Potentielle Anwendungen bei der Untersuchung genregulatorischer Mechanismen.
Schlussfolgerungen
- MC-WISH ist eine effektive Methode zur Analyse der mRNA-Verteilung in Embryonen.
- Die Technik liefert Einblicke in die Dynamik der Genexpression während der Entwicklung.
- Sie kann ein wertvolles Werkzeug für Forschende sein, die die Entwicklungsbiologie untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels chromogener Mehrfachziel-Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung (MC-WISH) lassen sich räumliche Genexpressionsmuster mehrerer Gene direkt innerhalb intakter Embryonen vergleichen, wodurch die Aufklärung von Koregulation und regulatorischen Beziehungen die mechanistische Entschärfung bei der Target-Validierung unterstützt. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem hochauflösende und reproduzierbare Messwerte der transkriptionellen Aktivität in für Krankheiten relevanten Entwicklungsmodellen bereitgestellt werden. Die Anwendbarkeit des Verfahrens auf Drosophila- und Zebrafisch-Embryonen macht es zu einem skalierbaren Werkzeug für die Untersuchung von Signalwegen und phänotypischen Screenings in präklinischen Modellsystemen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Abbildung räumlicher Beziehungen zwischen Genexpressionsdomänen, um Wechselwirkungen von Signalwegen zu klären.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Visualisierung eindeutiger und überlappender mRNA-Standorte mit hoher Genauigkeit.
- Prädiktiver Wert: Verbessert die Selektion von Projekten, indem mechanistische Unklarheiten in genregulatorischen Netzwerken während der embryonalen Entwicklung und Organogenese verringert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem zuverlässige, multiplexe Genexpressionskarten erstellt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch simultane Detektion von drei mRNA-Spezies in kontrastierenden Farben.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform und eine zuverlässige Evaluierung von Substanzen, indem quantitative, räumliche Messwerte in intakten Proben bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung, indem der räumliche Kontext der Genexpression über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg erhalten bleibt.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem präzise Expressionsorte definiert werden, die die Ausrichtung von Biomarkern und die Relevanz für die Krankheit beeinflussen.
- Mechanistische Risikominimierung: Konzentriert sich auf den Vorhersagewert, indem ein direkter Vergleich transkriptioneller Dynamiken in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
MC-WISH fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung des Targets bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und liefert räumlich aufgelöste transkriptionelle Daten, die zum frühen mechanistischen Verständnis und zur Bereitschaft von Assays beitragen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem direkte Vergleiche von mRNA-Verteilungsmustern in intakten Embryonen ermöglicht werden.
- Screening: Stellt bereitstellbare Assays durch reproduzierbare, multiplexfähige farbmetrische Ausgaben bereit, die den direkten Vergleich der Genexpression erlauben.
- Analytik: Erzeugt quantitative räumliche Messungen mittels chromogener Präzipitation, wodurch der Vergleich verschiedener Bedingungen sowie die Analyse von Co-Expression erleichtert wird.
- Translationale Forschung: Erhält den entwicklungsgeschichtlichen Kontext von der Entdeckungsphase bis zu präklinischen Stadien aufrecht und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern in Organogenesemodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode über verschiedene Projekte hinweg, da sie auf mehrere Modellsysteme (Drosophila, Zebrafisch) anwendbar und an verschiedene Genpanels anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem Unsicherheiten bei der Gen-Ko-Expression und regulatorischen Wechselwirkungen verringert werden.
- Operativer Wert: Bietet Standardisierung und Skalierbarkeit durch standardisierte chromogene Detektion und kryogespeicherte Embryonen-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominimierung von Targets durch hochpräzise räumliche Kartierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Priorisierung, indem klare visuelle Daten zur Expressionssignalüberlappung und Einzigartigkeit für Go/No-Go-Entscheidungen bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Embryologie, Nukleinsäurehybridisierung und chromogener Nachweistechnik.
- Benötigt farbmetrische Geräte auf Basis von alkalischer Phosphatase und eine Standardinfrastruktur der Molekularbiologie.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise im Bereich Probendesign, Haptenmarkierung und Farbentwicklungsprotokolle über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Erfordert Anpassungen beim Übertragen zwischen Drosophila- und Zebrafischembryonen aufgrund von Unterschieden in Permeabilität und Fixierung.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Eindringtiefe der Sonden in fortgeschrittenen Embryonalstadien sowie die begrenzte Signal-Multiplexfähigkeit aufgrund der verfügbaren chromogenen Farbtöne.
