Name: Glaucoma auslösende Verfahren in ein In Vivo Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie, Glaukom-induzierte RGC-Degeneration in Ratten durch hypertonische Salininjektion in die episklerale Vene zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht Studien zur neuronalen Schutzstrategie.

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Alle Verfahren tierischen Patienten verwendet haben in Übereinstimmung mit den Standards des Instituts für Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Western Michigan University. 1. Tiere <ol><li> Verwenden männlichen und weiblichen Ratten Alter von 3 Monaten in dieser Studie. </li><li> Halten Sie Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von KAX Cocktail für Tier Anesthesia <ol><li> Man löst 50 mg Xylazin (20 mg / ml) in 5 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1 ml Acepromazin (10 mg / ml) und 3 ml destilliertes Wasser. Gründlich durchmischen. </li><li> Sterilisieren mit einem Spritzenfilter und speichern diese Lösung in eine 10 ml Serumflasche. </li></ol> 3. KAX Injection <ol><li> Wiegen Tier (g) und zurück zum Käfig, bis sie bereit zur Injektion. </li><li> Injizieren von 0,1 ml KAX / 100 g Körpergewicht des Tieres intraperitoneal, eine 1 ml Insulinspritze mit einer 28 G Nadel. </li><li> Zulassenfür Tier zu werden bewusstlos. Überprüfen Reflexe durch die Füße und Schwanz einklemmen. </li><li> Bewahren Sie alle Tiere sicher im Labor für die Dauer der Operation. </li><li> Post-Chirurgie, ersetzen Tiere in ihren Käfigen und halten bequem in RT, bis das Bewusstsein wiedererlangt wird. Nur Rückkehr Tiere in die Tierhaltung, wenn die Tiere erwachen und ein normales Verhalten fortzusetzen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Chirurgie und Microneedle Versammlung <ol><li> Machen Sie eine sterile 2 M NaCl-Lösung. </li><li> Verwenden Sie einen Mikroelektroden - Abzieher (1C) ein 0,86 mm Innendurchmesser schwer poliert Standard und dünnwandige Borosilikat Rohr zu ziehen , in zwei fein verjüngte Glasmikronadeln (1D, 1E). </li><li> Verfüllung eines microneedle aus dem vorhergehenden Schritt mit 2 M Kochsalzlösung eine Verfüllung Spritzennadel und einer 1 ml Spritze (1B). Tippen Sie aus Luftblasen aus der Spitze der Elektrode. </li><li> Füllen Sie eine zweite 1 ml Spritze mit 2 MNaCl. Schließen Sie eine 18 G - Nadel und legen dann eine Länge (etwa 10 Zoll) von Polyethylenschlauch (Abbildung 1A). Verwenden Sie den Spritzenkolben das Polyethylenschlauch mit Kochsalzlösung durch die Nadel zu füllen. </li><li> Wenn sowohl die Mikronadeln und Schläuche mit Kochsalzlösung gefüllt sind, sorgfältig die beiden verbinden. Beseitigen jegliche Luft in der Verbindung zwischen ihnen (Figur 2). </li><li> Fein Fase die Spitze des microneedle, indem sie es sehr leicht gegen den Strich eines Kurses Papiertuch Schaben. </li><li> Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadeln durch den Kolben vorsichtig auf die Spritze, bis ein feines Flüssigkeitsstrom drückt auf dem Papiertuch zu sehen. Der Strom der Flüssigkeit sollte nicht breiter als 0,5 mm sein. </li></ol> 5. Herstellung von Tier <ol><li> Tragen Sie 1-2 Tropfen Lokalanästhetikum zu Hornhaut (Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung, USP, 0,5%). Warten Sie, bis kein Augenreflex auftritt. </li><li> Trim-Whisker mit einer Schere. </li><li> Saturate ein Wattestäbchen mit Betadin Lösung und Tupfer Bereich um den experimentellen Auge. </li><li> Mit Hilfe eines Mikroskops befestigen Sie eine hemostat den unteren Augenlid zu klemmen, um das Auge zu wölben, die episklerale Vene aussetzen und Augenbewegung beschränken. (Abbildung 3, Pfeilspitze) </li></ol> 6. Glaucoma auslösende Saline Injection <ol><li> Wenn die microneedle Montage und das Tier hergestellt werden, beginnen Injektionen. </li><li> Wenn das Tier zu Fuß / Schwanz Prise nicht mehr zu reagieren bestätigt wird, sorgfältig die episklerale Vene mit dem microneedle gewaltsam öffnen , indem sie zwischen 10 und 20 Grad zur Ader (Abbildung 3, weißer Pfeil) in einem niedrigen Winkel kommen. Eine erfolgreiche Einstich in die Vene ist offensichtlich , wenn Blut die Spitze der Mikronadeln (Abbildung 3, schwarzer Pfeil) eintritt. </li><li> Langsam und manuell ca. 50 &amp; mgr; l Kochsalzlösung in die Vene injiziert. Dies sollte etwa 10 Sekunden dauern. Die Venen werden blanch weiß wie das Salz zirkuliert throigitt das Gefäßsystem (Abbildung 4, Pfeilspitze). In einigen Regionen kann eine blutrot Aussehen (Abbildung 4, Pfeil) halten. <ol><li> Durchführen einer zweiten Injektion in die Vene, gegenüber dem Ort der ersten, gründliches retinale Schädigung des vollständigen retinalen Ganglienzellschicht zu gewährleisten. Hinweis: Innerhalb von Minuten, sollte man eine deutliche trübes Aussehen durch die Iris des Auges zu sehen, wie das Salz das Gefäßsystem zirkuliert durch. </li></ol></li><li> Lassen Sie das andere Auge unbehandelt für die Verwendung als interne Kontrolle. </li></ol> 7. Tierrettung <ol><li> Entfernen Sie die hemostat. </li><li> Verwenden Sie einen Wattedreifach antibiotische Salbe (Zink-Bacitracin, Neomycin-Sulfat, polymysin B Sulfat) auf die Website von der hemostat und an Injektionsstellen geklemmt anzuwenden. Gewebeschäden um das Auge tritt nicht auf die hemostat verwenden. </li><li> &gt; Platz narkotisierten Tieren auf einer zirkulierenden Warmwasserdecke in ihren Käfigen zu prevent Hypothermie. Halten Sie Tiere unter Beobachtung, bis das Bewusstsein und ein normales Verhalten wiedergewonnen werden. Transport wach Tiere zurück in die Tierkolonie. Tiere bleiben in der Kolonie bis zum Zeitpunkt des Opfers. </li></ol> 8. Tieropfer und Retina Removal <ol><li> Einen Monat nach dem Verfahren zur Glaukom induzieren, Tiere werden durch CO 2 Ersticken und sekundäre Thorax - Stich eingeschläfert. <ol><li> Legen Sie das Tier in der Kammer und legte den Deckel auf sicher. </li><li> Öffnen Sie die CO 2 und Gasregelventile 20% Volumen / min CO 2 Verschiebung zu ermöglichen , Sauerstoff in der Kammer. </li><li> Lassen Sie vier bis fünf Minuten für das Tier zu verfallen. </li><li> Schalten Sie beide Ventile ab. </li><li> Entfernen Tier aus der Kammer und führen Sie eine sekundäre Thorax-Stich mit einem sterilen Skalpell. </li></ol></li><li> Nach Euthanasie, mit einem Skalpell das Bindegewebe in der Augenhöhle zu schneiden bei rund um das Auge,ng vorsichtig, nicht in den Augapfel selbst zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie sorgfältig gekrümmten Rand Schere, um den Sehnerv und alle verbleibenden Gewebe zu schneiden die intakte Augapfel zu extrahieren. Legen Sie extrahiert Augapfel in einem sterilen 60 mm x 15 mm Einweg-Petrischale mit frischem PBS. </li><li> Machen Sie eine Okularmuschel vom Augapfel. Um dies zu tun, stellen ein kleiner Schnitt mit dem Skalpell posterior nur an der Grenze zwischen der Iris und der Sklera. Folgen Sie dieser Einschnitt um den Umfang des Auges mit kleinen Feder Schere, um die Hornhaut Hemisphäre aus dem Augapfel zu entfernen. Die Halbkugel mit dem Sehnerv verbunden bleibt. </li><li> Finden Sie die sehr dünne rosa / beige Retina innerhalb des Okulars vom eingeschläfert Tier. Halten Sie die pigmentierte Schicht der Netzhaut mit abgestumpften Pinzette die Augenmuschel zu stabilisieren. Verwenden Sie ein anderes Paar geschlossener Zange sehr sanft die ganze intakte Retina necken weg von der Rückseite des Auges. Vermeiden Sie Kneifen, ziehen, oder die Netzhaut direkt zerren. </li><li> Verwenden Sie kleine Feder Schere die zu schneidenBereich, in dem der Sehnerv noch an der Netzhaut angebracht wird. </li><li> Achten Sie darauf, restliche Pigmentepithel oder Skleralgewebe von der Retina wegzuschneiden. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, Transfer sehr sanft die isolierte Retina zu einem sauberen Sylgard beschichtet 35 mm x 10 mm Petrischale mit frischem PBS. </li></ol> 9. Whole-Mount-Retina-Vorbereitung <ol><li> Einmal in der Sylgard Schüssel, verwenden Pinzette und ein Kaktus Nadel, um die Netzhaut an Ort und Stelle zu fixieren. Halten Sie die retinalen Ganglienzellschicht nach oben und Sehnerv nach unten. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Verwenden Sie kleine Schere, um die Netzhaut in vier Quadranten zu schneiden, die Form eines vier Kleeblatt machen von dem Sehnervenkopf ausstrahlen. </li><li> Pin den Quadranten der Netzhaut mit zusätzlichen Kaktus Nadeln der Retina so flach wie möglich zu machen without Streckung (Abbildung 5). </li><li> Befestigen Sie die gemerkte Retinae in der Sylgard Schale mit 3 ml 4% Paraformaldehyd O / N bei RT. </li></ol> 10. Antikörper-Färbung von Retina Anmerkung: Stain fixiert Retinae mit primären und sekundären Antikörpern zur Betrachtung Neuronen in der Netzhaut (6). <ol><li> Spülen Sie fixiert, flach montierten Retinae dreimal für jeweils 2 Min in PBS. </li><li> Permeabilisieren die Retinas mit 1% Triton X-100 mit 1% fötalem Rinderserum in PBS für 60 min. </li><li> Rinse Retinae dreimal 2 min jeweils in PBS. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren mit 1% Triton X-100 und 1% fötalem Rinderserum in PBS bei RT für 45 min. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml 1% fötalem Rinderserum in PBSmit gereinigtem Maus-anti-Ratte CD90 / Maus CD90.1 (1: 300 Verdünnung) O / N bei RT. </li><li> Spülen Retinae einmal mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml PBS (ohne FBS) mit sekundären Alexa Fluor 594 Ziege-Anti-Maus-IgG (1: 300), O / N bei RT. </li><li> Waschen Sie Retinae mit PBS liberal. </li><li> Mit einem Binokular, entfernen Sie vorsichtig Kaktus Nadeln von der Netzhaut. </li><li> übertragen vorsichtig Retinae auf Mikroskop-Objektträger mit einer Transferpipette. Achten Sie darauf, Orientierung mit retinalen Ganglienzellschicht zu halten an der Decke gegenüber. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Absorbieren überschüssiges PBS mit Kimwipe oder ein anderes derartiges Material aufnehmen. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut zu absorbieren. </li><li> 5 Tropfen ½ Glycerin und ½ PBS Gewichts als amontage Medien. </li><li> Decken Sie Retina mit Deckglas, Luftblasen vermeiden. </li><li> Sichere Deck mit klarem Nagellack, Klebstoff oder andere Kleber. </li></ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden oder konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Glaukom-ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell induzieren. Dieses Verfahren verwendet eine Injektion von hypertonischer Kochsalzlösung Vernarbung in das Trabekelwerk zu induzieren 29, 32. Die Entwicklung Gewebenarben den Abfluss von Kammerwasser okkludiert , die Druck in der vorderen Kammer erhöht. Mit verminderten Abfluss und Druck aufzubauen, wird die Linse durch elastische Bänder suspendiert schiebt wieder in den Glaskörperraum. Vitreous H...

Glaukom ist eine Gruppe von Augenkrankheiten , Nervenzellen in der Netzhaut zu beeinflussen, insbesondere die retinalen Ganglionzellen 1-2. Die Axone dieser Zellen konvergieren der Sehnerv visuelle Information tragenden zum Gehirn zu werden, wo die Sicht wahrgenommen wird. Schäden an RGCs und ihre Axone führt daher zu Sehfehler. Die primären Merkmale im Zusammenhang mit Glaukom-Erkrankungen sind RGC Degeneration und Tod, erhöhter Augeninnendruck (IOP) und Papille Schröpfen und Atrophie. Diese Eigenschaften führen zu Gesichtsfeldausfällen oder vollständige, irreversible Blindheit. Derzeit hat 3 Blindheit in 70 Millionen Menschen weltweit Glaukom verursacht. Als solches ist es die drittgrößte Ursache für Erblindung 4 der Welt. Der genaue Mechanismus der RGC Tod in Glaukom bleibt unbekannt. Viel Forschung wurde das Geheimnis zu entsperren getan. Es ist jedoch bekannt, dass der primäre Risikofaktor für Glaukom ist eine Zunahme in intraokularen Drucks aufgrund unregelmäßiger Zirkulation von wässrigem Humor (AH) in der Vorderkammer des Auges. AH dient als transparent und farblos Ersatz für Blut in der avaskulären Vorderkammer des Auges. Es nährt die umliegenden Zellen, entfernt sekretiertes Abfallprodukte aus Stoffwechselprozesse, transportiert Neurotransmitter und ermöglicht die Verbreitung von Drogen und Entzündungszellen innerhalb des Auges während der pathologischen Zustände 1. Die Aufrechterhaltung der wässrigen Humor Zirkulation beinhaltet die Ziliarkörper und das Trabekelwerk. Wässrige Humor wird durch den Ziliarkörper produziert. Es fließt dann in die vordere Kammer, die allgemeine Gesundheit des Augengewebes zu halten. 75-80% der wässrigen Abflusses wird aktiv durch nichtpigmentären Ciliarepithel sezerniert, wenn die Flüssigkeit durch drei Schichten des schwammigen Gewebe im Ziliarmuskel gefiltert wird. Das Fluid tritt durch das Trabekelwerk und durch den Schlemmschen Kanal, empties in das Blutsystem 5 .Die restlichen 20 - 25% der Abfluss umgeht das Trabekelwerk und wird passiv durch Ultrafiltration und Diffusion durch die uveo-skleralen Weg abgesondert. Dieser Weg scheint relativ unabhängig von den intraokularen Druck 1 zu sein. Wenn Kammerwasserproduktion und Abfluss aus dem Gleichgewicht geraten sind, baut den Druck im Auge. Wie bereits erwähnt, diese Erhöhung des intraokularen Drucks ist der primäre Risikofaktor bei der Entwicklung von Glaukom. Ein solcher Druck bewirkt, dass eine Beschädigung der komplizierten Schichten von Neuronen in der Netzhaut auf der Rückseite des Auges. Eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen Axone des Sehnervs verursacht das Gehirn nicht mehr präzise visuelle Informationen zu erhalten. Als Ergebnis ist die Wahrnehmung des Sehvermögens verloren und vollständige Blindheit auftreten können. Bis heute gibt es keine Heilung für Glaukom. Verschiedene Behandlungsmethoden gibt, die in erster Linie den intraokularen Druck zu reduzieren wollen. Dazu gehören die topischeMedikamente Klassen wie Beta1-Rezeptorenblocker oder topische Prostaglandin-Analoga. Betablocker reduzieren die intraokulare Druck durch die Produktion von Kammerwasser 7 abnimmt. Prostaglandine fungieren IOP zu reduzieren , indem der Abfluss von Humor aquosus 8-14 erhöhen. Alpha-adrenergen Agonisten und Carboanhydrasehemmer sind auch als sekundäre Behandlungsmethoden verwendet werden. Alpha - adrenergen Agonisten erhöhen Abfluss durch den uveosklerale Weg 15-17. Carboanhydrasehemmer reduzieren die Produktion von AH durch enzymatische Hemmung 18. Viel mehr invasive Verfahren werden auch zur Behandlung von Glaukom verwendet wird. Lasertrabekuloplastik wird verwendet , 19 , um den Abfluss des Kammerwassers zu erhöhen. Eine weitere chirurgische Therapie, die so genannte Trabekulektomie schafft eine alternative Entwässerung Website AH zu filtern , wenn der traditionelle trabekulären Weg wird 20-21 blockiert. Diese Behandlungsoptionen wurden zu eff bekanntektiv IOP verringern. Jedoch bis zu 40% der Glaukompatienten für vollständigere therapeutischen Verfahren eine Notwendigkeit , den normalen IOP Ebenen zeigen anzeigt. 22,23 Zusätzlich ist Retinal Ganglion Zelltod in Glaukom gesehen irreversible sobald es und aktuellen Behandlungen beginnt nicht das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen 24-28. Dies hat die Notwendigkeit einer wirksamen neuroprotektiven Therapien hervorgehoben, dass das Überleben der Neuronen selbst ausrichten. Entwicklung von Glaukom-Modelle ist für diese Entwicklung entscheidend. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Induzierung von Glaukom-ähnliche Effekte in erwachsenen Long Evans - Ratten mit einem modifizierten Verfahren unter Verwendung von ursprünglich umrissenen von Morrison 29. In diesem Verfahren werden Injektionen von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in dem episkleralen venösen Plexus induziert Glaukom ähnlichen Bedingungen durch Gewebe Vernarbung wässrigen Abflusses in das Trabekelwerk zu einem Anstieg des intraokularen Drucks und einem signifikanten Verlust an RGCs was zu reduzieren within eines Monats nach dem Verfahren 30-31. Glaucoma-induzierenden Verfahren, wie das hier beschrieben ist, kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Entwicklungen in Glaukombehandlung.

<table><tbody><tr><td>Xylazinhydrochlorid, mindestens 99 %</td> <td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid-Injektion, USP, 100 mg/ml&nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml Flasche</td></tr><tr><td>Acepromazinmaleat, 10 mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml Flasche</td></tr><tr><td>Serumflasche, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilikatglas</td></tr><tr><td>1 ml Insulinspritze</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G Nadel&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroelektroden-Abzieher&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Schwere polierte Standard- und dünnwandige Borosilikatrohre&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>ohne Filament, 0,86 mm</td></tr><tr><td>Microfil Spritzennadel zum Befüllen von Mikropipetten</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge Luer-Lock-Nadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Spritzennadel</td></tr><tr><td>Flexibler Polyethylenschlauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0,034 Zoll Durchmesser, ca. 10 Zoll&nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid Opthalmische Lösung, USP, 0,5 %</td> <td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; sterile Flasche&nbsp;</td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat-Klemme</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>gebogener Kante</td></tr><tr><td>Dreifache antibiotische Salbe&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Einweg-Petrischale</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10x Konzentrat</td><td>Sigma, Life Science&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x Verdünnung&nbsp;</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Feine Wissenschaft Werkzeuge&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transferpipetten, Polyethylen, unsteril</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 oder 52947-948</td><td>1 und 2 ml Teilung</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petrischale&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Kaktusnadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMD Millipore &nbsp;</td><td>PX0055-3 oder 818715.0100</td><td>Hergestellt zu einer 4%igen Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Hergestellt sowohl in einer 1%igen als auch in einer 0,1%igen Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>gereinigte Maus Anti-Ratte CD90/Maus CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Katze 554892</td><td>1:300 Verdünnung&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Maus für Ziegen</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 Verdünnung&nbsp;</td></tr><tr><td>Objektträger Corning</td><td>&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>50 % Glycerin bis 50 % PBS, nach Gewicht&nbsp;</td></tr><tr><td>Deckglas&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Dicke 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma auslösende verfahren in ein<em&gt; in vivo</em&gt; rat modell und whole-mount retina vorbereitung

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Das Glaukom ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems retinale Ganglionzellen (RGCs). RGC Axone des Sehnervs führen für die visuelle Wahrnehmung an das Gehirn visuelle Eingabe bilden. Schäden an RGCs und ihre Axone führt zu Verlust der Sehkraft und / oder Blindheit. Obwohl die spezifische Ursache des Glaukoms nicht bekannt ist, ist der Hauptrisikofaktor für die Erkrankung ein erhöhter Augeninnendruck. Glaucoma-induzierende Verfahren in Tiermodellen sind ein wertvolles Werkzeug für Forscher, den Mechanismus der RGC Tod studieren. Diese Informationen können zur Entwicklung von wirksamen neuroprotektiven Behandlungen führen, die bei der Prävention von Verlust der Sehkraft unterstützen könnte. Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt ein Verfahren Glaukom induzieren - ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell , bei dem 50 ul von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in das episkleralen venösen Plexus injiziert. Blanchieren der Gefäße zeigt die erfolgreiche Injektion. Dieses Verfahren führt zu einem Verlust von RGCs Glaukom zu simulieren. Einen Monat nachInjektion werden die Tiere getötet und die Augen entfernt. Als nächstes werden die Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt, um eine Okularmuschel zu machen. Die Netzhaut wird dann von der Rückseite des Auges geschält und auf Sylgard Gerichte mit Kaktus Nadeln festgesteckt. An diesem Punkt Neuronen in der Netzhaut kann zur Analyse gefärbt werden. Die Ergebnisse aus diesem Labor zeigen, dass etwa 25% der RGCs innerhalb eines Monats nach dem Verfahren, wenn die interne Kontrolle im Vergleich verloren. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Retinal Ganglion Zelltod in einem in vivo Rattenmodell Glaukoms.

Dieser Abschnitt stellt die Gerätekomponenten und Verfahren verwendet , um Glaukom ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Ratten Glaukom Modell induzieren. Wir zeigen die einzelnen Werkzeuge und Geräte mit einer hypertonen Kochsalzlösung-Injektion auszuführen verwendet, die eine Erhöhung des intraokularen Druckes bewirkt. Wir zeigen die Injektion in den episkleralen venösen Plexus mit seinen charakteristischen Blanchierung Effekt und die trübes Aussehen der vorderen Kammer, der ...

Das Glaukom ist durch eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen gekennzeichnet. Die Induktion des Glaukoms in Tiermodellen kann Aufschluss über die Erforschung dieser Krankheit geben. Hier skizzieren wir ein Verfahren, das den Verlust von RGCs in einem in vivo Rattenmodell induziert und die Vorbereitung von Whole-Mount-Netzhäuten für die Analyse demonstriert.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch die Induktion glaukomähnlicher Bedingungen einen erheblichen Verlust retinaler Ganglienzellen in der Netzhaut der Ratte herbeizuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten des Glaukoms und des neuronalen Schutzes zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einen schleichenden Verlust retinaler Ganglienzellen verursacht, der dem beim menschlichen Glaukom beobachteten Verlauf ähnelt. Um dieses Verfahren zu beginnen, ziehen Sie zwei fein zugespitzte Glasmikronadeln aus einem schweren, polierten, standardmäßigen dünnwandigen Borosilikat-Röhrchen mit einem Mikroelektrodenzieher. Füllen Sie anschließend eine Mikronadel mit zwei molarer Kochsalzlösung unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze auf. Schlagen Sie die Luftblasen aus der Spitze der Elektrode heraus.Füllen Sie anschließend eine zweite Ein-Milliliter-Spritze mit zwei molarer NaCl-Lösung. Verbinden Sie sie mit einer 18-Gauge-Nadel und befestigen Sie die Nadel an einem 25-cm-Polyethylen-Schlauch. Füllen Sie mithilfe des Spritzenstempels den Polyethylen-Schlauch über die Nadel hinweg mit Kochsalzlösung.Wenn sowohl die Mikronadel als auch die Schlauchleitung mit Kochsalzlösung gefüllt sind, verbinden Sie beide vorsichtig. Entfernen Sie jegliche Luft in der Verbindung, indem Sie die Luftblasen vorsichtig herausschlagen. Anschließend beveln Sie die Mikronadelspitze leicht ab, indem Sie sie vorsichtig über ein Papiertuch streichen.Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadel, indem Sie den Kolben der Spritze vorsichtig nach unten drücken, bis ein feiner Flüssigkeitsstrahl auf dem Papiertuch sichtbar ist. Der Flüssigkeitsstrahl sollte nicht breiter als 0,5 Millimeter sein, um die intakte Beschaffenheit der Nadelspitze sicherzustellen. Bei diesem Verfahren überprüfen Sie nach der Anästhesie des Tieres mit dem KAX-Cocktail die Reflexe, indem Sie leichte Quetschungen an den Pfoten oder am Schwanz vornehmen, um sicherzustellen, dass das Tier bewusstlos ist.Danach die Barthaare mit einer Schere kürzen. Anschließend einen Wattestäbchenapplikator mit Betaisodona-Lösung tränken und die Region um das experimentelle Auge abwischen. Unter dem Mikroskop mit einer Hämostaseklemme das untere Augenlid festklemmen, um den Augapfel vorwölben zu lassen, die episklerale Vene freizulegen und die Augenbewegung einzuschränken.Danach durchstechen Sie vorsichtig die episklerale Vene mit der Mikronadel in einem Winkel zwischen 10 und 20 Grad zur Vene. Ein erfolgreicher Einstich in die Vene liegt vor, wenn Blut in die Spitze der Mikronadel eindringt. Injizieren Sie langsam 50 µL Kochsalzlösung in die Vene.Die Venen werden blassweiß, während das Salz durch das Gefäßsystem zirkuliert, doch einige Bereiche können ein blutrotes Aussehen beibehalten. Der entscheidendste einzelne Schritt dieses Verfahrens erfolgt während der Injektion der zwei Molaren Salzlösung. Es ist unerlässlich, dass eine Aufhellung im Gefäßsystem eintritt, um einen erfolgreichen Ausgang sicherzustellen.Ein stabiler Nadelhalt und ein Winkel von 20 Grad sind für diesen Eingriff entscheidend. Danach sollte eine zweite Injektion in die Vene durchgeführt werden, um eine vollständige Schädigung der Schicht der retinalen Ganglienzellen sicherzustellen. Innerhalb weniger Minuten sollte sich eine deutlich trübe Erscheinung durch die Regenbogenhaut des Auges zeigen, während das Salz durch das Gefäßsystem zirkuliert.Verwenden Sie nun ein Skalpell, um das Bindegewebe in der Augenhöhle um das Auge herum zu durchtrennen, wobei darauf zu achten ist, den Augapfel selbst nicht zu verletzen. Anschließend durchtrennen Sie vorsichtig den Sehnerv und alle verbleibenden Gewebestrukturen, um den intakten Augapfel mit der Schere mit gekrümmter Schneide zu entnehmen. Legen Sie den entnommenen Augapfel in eine sterile Petrischale, die frische PBS enthält.Als Nächstes wird aus dem Augapfel durch einen kleinen Schnitt mit dem Skalpell knapp hinter der Grenze zwischen Iris und Sklera eine Augentasse hergestellt. Der Schnitt wird entlang des Augenumfangs fortgesetzt, um die Hornhaut-Halbkugel vom Augapfel zu trennen. Unter Fixierung der pigmentierten Netzhautschicht mit einer Pinzette zur Stabilisierung der Augentasse wird mit einer zweiten Pinzette vorsichtig die rosa-beige, ganz intakte Netzhaut von der Hinterseite des Auges gelöst.Schneiden oder kneifen Sie anschließend den Bereich ab, an dem der Sehnerv an die Netzhaut angeheftet ist. Achten Sie darauf, jegliches verbleibende Pigmentepithel oder sklerales Gewebe von der Netzhaut zu entfernen. Überführen Sie dann die isolierte Netzhaut vorsichtig in eine saubere, mit Sylgard beschichtete Petrischale, die frische PBS enthält.Wenn sich die Netzhaut einmal in der Sylgard-Schale befindet, befestigen Sie sie an Ort und Stelle. Halten Sie die Schicht der retinalen Ganglienzellen nach oben und den Sehnerv nach unten gerichtet. Schneiden Sie anschließend die Netzhaut in vier Quadranten, sodass sie die Form eines vierblättrigen Kleeblatts annimmt, das sich vom Sehnervenkopf aus strahlt.Dann fixieren Sie die Quadranten der Netzhaut mit zusätzlichen Kaktusnadeln, um die Netzhaut so flach wie möglich zu legen, ohne sie zu dehnen. Anschließend fixieren Sie die fixierte Netzhaut in der Sylgard-Schale mit drei Milliliter 4 % Paraformaldehyd über Nacht bei Raumtemperatur, bevor Sie die Standardfärbeprotokolle durchführen. Hier sehen Sie einen Vergleich zwischen dem unbehandelten Kontrollauge und dem experimentellen Auge einen Monat nach der Injektion einer Glaukom-induzierenden Kochsalzlösung.Die retinalen Ganglienzellen sind mit einem Antikörper gegen Thy 1.1 markiert. Das Verfahren führt zu einer Verringerung der Anzahl der RGCs, zur Defaszikulation der Axone von den Hauptaxonbündeln sowie zu einer Verformung der Rundheit der verbleibenden RGCs. Dies sind die charakteristischen defaszikulierenden Axone, die auf die Injektion von Kochsalzlösung zurückzuführen sind.Ein Blutgefäß wird innerhalb der Netzhaut gezeigt, und dies sind die Axonbündel. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in 30 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets eine frische, scharfe, abgeschrägte Mikronadel zu verwenden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Immunzytochemie, Western Blots, In-situ-Hybridisierung, mRNA-Sequenzierung oder Verhaltensanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche, mit Glaukom verbundene Fragen zu beantworten, beispielsweise wie der Verlust retinaler Ganglienzellen die Sehschärfe von Tieren beeinflusst. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich des Glaukoms neuronale Schutzstrategien an Ratten untersuchen konnten. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen signifikanten Verlust retinaler Ganglienzellen bei der Ratte durch eine hypertone Kochsalzlösungs-Injektion in die episklerale Vene hervorrufen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Bosco, A., et al.  In vivo Dynamik der retinalen Mikrogliaaktivierung während der Neurodegeneration: Konfokale ophthalmoskopische Bildgebung und Zellmorphometrie beim Mausglaukom. J. Vis. Exp. (2015) Dieses Video zeigt die In-vivo-Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms. Eine transgene Maus mit fluoreszierenden Protein-exprimierenden retinalen Mikroglia wird unter einem Ophthalmoskop positioniert. Infrarotbeleuchtung wird verwendet, um den Sehnervenkopf (ONH)...

In vivo Bildgebung von retinalen Mikroglia in einem Mausmodell des Glaukoms

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Hier stellen wir ein Protokoll okulärer Hypertension im murinen Auge zu induzieren, die in dem Verlust von retinalen Ganglionzellen führt, wie bei Glaukom beobachtet. Magnetische Mikrokügelchen werden in die vordere Kammer injiziert und angezogen, um den Kammerwinkel unter Verwendung eines Magneten den Abfluss von Kammerwasser zu blockieren.

Ein Magnet Microbead Occlusion Modell Ocular Hypertension Abhängige Glaucoma in Mäusen zu induzieren

Der folgende Bericht beschreibt, wie das Nagetiermodell der nicht-arteriitischen anterioren ischämischen Optikusneuropathie (rNAION) unter Verwendung der entsprechenden Farbstoff-, Kontaktlinsen- und Laserparameter repliziert werden kann. Wir zeigen auch die geeigneten Schritte zur Beurteilung der rNAION-Läsion in vivo auf.

Das Nagetier-Modell der nonarteritic anteriore ischämische Optikusneuropathie (rNAION)

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Untersuchung einer Form der chemischen Neurostimulation Wholemount Ratte Netzhäute in Vitro mit dem Neurotransmitter Glutamat. Chemischen Neurostimulation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen elektrischen Neurostimulation der Netzhaut Neuronen für die Behandlung von irreversible Blindheit durch Photorezeptor degenerativen Erkrankungen verursacht.

Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat In-vitro-

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Chronische okulärer Hypertension wird induziert durch die Anwendung einer Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen, was zu funktionellen und strukturellen Verschlechterung der retinalen Ganglienzellen, die konsistent mit Glaukom.

Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Lernen Sie, Glaukom-induzierte RGC-Degeneration in Ratten durch hypertonische Salininjektion in die episklerale Vene zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht Studien zur neuronalen Schutzstrategie.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein

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