Name: In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Lernen Sie den in vivo Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA-Strangbrüchen und oxidativen DNA-Schäden in Rattenleberzellen. Diese empfindliche Methode ermöglicht regulatorische Sicherheitsbewertungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration unterstützt. Wir bestätigen die ursprüngliche Veröffentlichung der CPA-Studie von Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Geschlechtsspezifische Dosis-Wirkungs-Analyse der Genotoxizität bei Cyproteronacetat-behandelten F344-Ratten. Mutationsforschung 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Ethik-Anweisung: Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) bei der US FDA / Nationales Zentrum für toxikologische Forschung genehmigt. HINWEIS: Die hier beschriebene Studiendesign basiert auf dem Protokoll , das von dem japanischen Zentrum für die Validierung alternativer Methoden (JaCVAM) für ihre Validierung des Nagetiers in - vivo - Assay alkalische Komet 18 entwickelt und weiter in OECD - Richtlinie auf Empfehlungen modifiziert basierend TG489 19 . 1. Vorbereitung <ol><li> Slide Vorbereitung <ol><li> Man löst regelmäßig schmelzender Agarose bei 1% (w / v) in Phosphatpuffer (Ca 2+, Mg 2+ frei und Phenolrot frei) durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. </li><li> Legen Sie das geschmolzene 1% Standard-Agarose-Lösung in einem 55 ° C Wasserbad und ins Gleichgewicht, die Temperatur mit dem Bad. Dip Glasobjektträger in die Agarose-Lösung, abfließen alle excess Agarose und die Rückseite der Folien sauber wischen. Legen Sie die Folien aufrecht auf eine ebene Oberfläche und lassen Sie die Folien bei RT trocknen; Speichern Sie die Folien in trockenen Ort aufbewahren. </li></ol></li><li> Herstellung von Comet-Assay-Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 0,5% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung. Auflösen niedrigschmelz Agarose in Phosphatpuffer (Ca 2+, Mg 2+ und Phenolrot frei) durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. Halten Sie die Lösung bei 37-45 ° C während Komet Dia Vorbereitung; verwerfen danach alle verbleibenden Agarose-Lösung. </li><li> Bereiten Sie Lysepuffer. Machen Sie eine 100 mM Lösung von Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Herr 372,24 g / mol), 2,5 M Natriumchlorid (NaCl, Herr 58.44 g / mol) und 10 mM Tris hydroxymethyl aminomethan (Tris-Base, Herr 121,14 g / mol) auf pH 10 mit 10 N Natronlauge (NaOH, Mr 40 g / mol) in gereinigtem Wasser, und zu justieren. Am Tag der Verwendung, Triton X100 und Dimethylsulfoxid (DMSO, Mr 78,13 g / mol) zu der Lösung hinzufügen endgültige Konzentrat zu erreichenIonen von 1% und 10% betragen, und unter Rühren bei 4-10 ° C für mindestens 30 min für die vor der Verwendung. </li><li> Machen Sie frische Enzympuffer am Tag der Nutzung. Bereiten einer Lösung, die 40 mM 2- [4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsäure (HEPES, Mr 238,3 g / mol), 100 mM Kaliumchlorid (KCl, Mr 74.55 g / mol), 0,5 mM EDTA und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA, Herr 66.463 g / mol) in gereinigtem Wasser. Den pH-Wert auf 8,0 mit 10 N Kaliumhydroxidlösung (KOH, 56,1 g / mol). Rühren bei RT und überprüfen Sie die vollständige Auflösung vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine alkalische Pufferlösung, die 300 mM NaOH und 1 mM EDTA in gereinigtem Wasser. Man rührt bei 4-10 ° C für mindestens 30 min vor der Verwendung. Messung des pH-Werts der Lösung vor der Verwendung und sicherstellen, dass der pH-Wert&gt; 13 auf. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 0,4 M Tris-Base in gereinigtem Wasser, und stellen auf pH 7,5 mit Salzsäure (HCl, Herr 36.46). Bewahren Sie die Lösung bei 4-10 ° C. Dies wird neutralisierende Puffer. </li><li> Machen Sie fresh mincing Puffer am Tag der Verwendung. Bereiten Sie eine Lösung , die 20 mM EDTA und 10% DMSO in Hanks Balanced Salt Solution enthält (HBSS, Ca 2+, Mg 2+, und Phenol - Rot frei). Lagern auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff-Stammlösung Zur Färbung Lösung herzustellen, verdünnt mit Tris-Borat-EDTA (TBE-Puffer) bei 1: 10.000 (v / v). Schützen Sie die Lösung vor Licht mit Aluminiumfolie. Lagerung bei 2-8 ° C und mit 24 Stunden verwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Rattenleber <ol><li> Euthanize Ratten mit CO 2 -Gas folgende Methoden empfohlen in den American Veterinary Medical Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: 2013 Ausgabe 20. <ol><li> Stellen Sie den CO 2 Durchflussrate bei 2,75. Legen Sie die Ratte in der Euthanasie Kammer (zB Exsikkator Glas, Rattenkäfig mit belüfteter Deckel) und schalten Sie den CO 2 durch das Flaschenventil geöffnet wird . Warten für 1,5 bis 2,5 min, bis dieRatte wird bewusstlos. Erhöhen Sie die CO 2 Strömung auf seine maximale Einstellung. Nach Beendigung der Atmung, für die Ratte in der Kammer verlassen etwa 1 min Euthanasie zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, Euthanasie durch Palpation, um zu bestätigen, dass die Ratte keinen Herzschlag hat, und Kneifen Sie die Zehen, um festzustellen, dass die Ratte nicht seine Gliedmaßen nicht entziehen. </li></ol></li><li> Desinfizieren Sie die behaarte Haut mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie die intakte Leber mit chirurgische Scheren. Nach der Leber zu entfernen, entfernen Sie den linken Seitenlappen aus der verbleibenden Leber mit chirurgischen Schere. Platzieren Sie den linken Seitenlappen auf einem Schneidebrett und schneiden Sie zwei benachbarte 3-4 mm dicken Querschnitten mit einem Einweg einschneidig Rasierklinge. </li><li> Setzen Sie einen Querschnitt auf Filterpapier (zur Verhinderung von Kräuseln des Abschnitts) und legen Sie den Abschnitt in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von 10% NBF an Gewebe 10: 1 oder größer ist. Nach einer Fixierungszeit von mindestens 72 h, Process die Leber für die Histopathologie (siehe Abschnitt 7, unten). </li><li> Legen Sie die zweite Quer Leber Abschnitt in 5 ml eiskaltem Hacken- Puffer (Abschnitt 1.2.6) in einer 6 cm Petrischale und spülen Sie 3 mal Restblut zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Leber Abschnitt in ein neues 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml eiskaltem Hacken- Puffer. Mince die gut abgespült Leber Abschnitt mit einem Paar von feinen Schere, um die Zellen zu lösen. Der Stamm der Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb alle Gewebe Klumpen zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Einzelzellsuspension auf Eis und verwenden für Dias innerhalb 1 Stunde zu machen. Überprüfen Sie die Konzentration der Zellen durch Zählen (beispielsweise mit einem Hämozytometer oder elektronischen Zellzähler) , um sicherzustellen , daß seine Konzentration etwa 2 x10 6 Zellen / ml. </li></ol> 3. Herstellung von Comet Slides <ol><li> Man mischt ein Volumen der Einzelzellsuspension mit 10 Volumen von geschmolzenem, 37 ° C, 0,5% niedrig schmelzenden Agarose-Lösung (siehe Abschnitt 1.2.1).Pipette sofort 100 ul auf einen Objektträger mit regelmäßigen Schmelzpunkt Agarose (Abschnitt 1.1) beschichtet. Ab sofort setzen Sie ein Deckglas über die Zelle-Agarose-Gemisch. Machen Sie mindestens 8 Folien für jede Probe. HINWEIS: Alle Folien von einer Zahl oder einen ähnlichen Code und ihre Identität aufgezeichnet sollten identifiziert werden, so dass die Schieber in verblindet bewertet werden können (6.2.2 siehe weiter unten). </li><li> Legen Sie die Dias flach und kühl bis 4 ° C für 30 min. </li><li> Nachdem das Gel erstarrt ist, vorsichtig die Deckgläser entfernen und die Folien in vorgekühlte Lysepuffer (Abschnitt 1.2.2) einzutauchen. Schützen Sie die Folien aus Licht und halten Sie die Folien in der Lyse-Puffer bei 4 ° C 1 Stunde (Minimum) bis O / N (Maximum). </li></ol> 4. Enzymbehandlung von Comet Slides <ol><li> Entfernen Sie 6 der 8 Dias aus jeder Gewebeprobe aus dem Lysepuffer und spülen sie mit Enzympuffer (Abschnitt 1.2.3) bei RT für 5 min je 3x. Verwenden Sie die verbleibenden zwei Folien für den alkalischen Comet-Assay whne Enzym-Behandlung (siehe 5.1, unten). Nach dem Spülen entfernen überschüssige Flüssigkeit durch Ablassen und die Folien mit Gewebe-Blotting. </li><li> Verdünnte hOGG1 und Endo III Enzym Bestände mit Enzympuffer bei 1: 1000 (v / v). Auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Wenden Sie 200 ul der folgenden Lösungen zu den Folien aus jeder Behandlungsgruppe hergestellt: 200 ul Enzympuffer allein (2 Dias als Referenz Dias verwendet), 200 &amp; mgr; l hOGG1 Lösung (2 Dias) oder 200 &amp; mgr; l Endo III-Lösung (2 Dias). </li><li> Legen Sie die Folien in Petrischalen mit angefeuchteten Papiertüchern ausgekleidet, decken Sie die Folien mit Parafilm, und bei 37 ° C für 45 min für Endo III-behandelt und Referenz Dias und 30 min für hOGG1 behandelten Dias. </li><li> Nach der Inkubation spülen Sie die Folien mit destilliertem Wasser und weiterverarbeiten, wie in 5.2 beschrieben, weiter unten. </li></ol> 5. Abwickeln und Elektrophorese <ol><li> Für Dias nicht mit Enzymen behandelt, die Folien aus dem Lysepuffer entfernenablassen, die Folien und spülen Sie einmal mit kaltem Neutralisierungspuffer (Abschnitt 1.2.5) für 5 min Restreinigungsmittel und Salze zu entfernen. </li><li> Die Objektträger aus den Schritten 4.5 und 5.1 zufällig in einer horizontalen Gelelektrophorese Tank, unter Vermeidung von Räumen. Füllen Sie den Tank mit frisch zubereiteten pH&gt; 13-Elektrophorese-Puffer (Abschnitt 1.2.4), bis der Flüssigkeitspegel nur die Folien bedeckt (vermeiden Sie Blasen über die Agarose und stellen Sie sicher, dass der Tank-Ebene). Aufzeichnen der Puffer pH-Wert und Temperatur zu Beginn der DNA Abwickeln. </li><li> Lassen Sie die Folien in der alkalischen Puffer bleiben für 20 min zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkali haftet Schaden zu ermöglichen. </li><li> Beim Abwickeln, Programm die Stromversorgung von 0,7 V / cm in der Elektrophorese-Tank (V / cm = Volts durch den Abstand in cm zwischen den positiven und negativen Elektroden geteilt) zu erzeugen. </li><li> Nach dem Abwickeln, drücken Sie die Stromversorgung der Lauftaste. Passen Sie bei Bedarf den Strom auf 300 mA durch Anheben oder den Pufferpegel zu senken. Halten Sie the Puffer Ebene knapp über der Oberfläche der Folien. Führen Elektrophorese bei 4 ° C für 20 min. Nehmen Sie die Folie Platzierung, um die Temperatur des Puffers und der Strom (Ampere) zu Beginn und am Ende der Elektrophorese. HINWEIS: Zu viel Puffer wird in niedrigere Spannungen führen, die mit DNA-Migration stören können. </li><li> Nach der Elektrophorese neutralisieren die überschüssige Alkali durch sanft die Dias aus dem Tank heben und in Neutralisationspuffer (Abschnitt 1.2.5) für 5 min eingetaucht wird. Lassen Sie die Folien und noch zweimal wiederholen. </li><li> Befestigen Sie die Schieber nach 5 Minuten in kaltem 100% Ethanol eingetaucht wird. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen und in einem trockenen Raum für die Lagerung. </li></ol> 6. DNA-Färbung, Comet Visualisierung und Analyse <ol><li> DNA-Färbung <ol><li> Legen Sie die Folien auf einem Karton oder Metallschale und mit 200 &amp; mgr; l von Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff Arbeitslösung (siehe Abschnitt 1.2.7) zu jeder Folie und Deckel mit einem Deckglas. Schützen Sie die Folien ausLicht erlauben die Objektträger für mindestens 30 min vor scoring in Kontakt mit der Färbelösung zu bleiben. Beflecken die Folien in Chargen von 20 zu einem Zeitpunkt. </li><li> Bevor jede Folie zu lesen, sanft abgetupft überschüssige Färbelösung, wobei darauf geachtet, nicht zu stören, das Deckglas entfernt. </li></ol></li><li> Comet Visualisierung und Scoring <ol><li> Verwenden Sie eine Videokamera an einem Fluoreszenzmikroskop angebracht Live-Bilder des Kometen Folie auf dem Computer-Monitor anzuzeigen. </li><li> ein Mikroskopfeld enthaltenden Zellen in zufälliger Reihenfolge wählen. Mit Hilfe einer Maus, wählen Sie eine Zelle. Klicken Sie auf die Mitte des &quot;Komet Kopf&quot; mit der linken Maustaste der Maus. HINWEIS: Die Computersoftware alle Messparameter für die Zelle berechnet und fügt die Daten in eine Datendatei. </li><li> Ergebnis alle Zellen im aktuellen Feld (siehe Schritt 6.2.4), und verwenden Sie dann die Bühne Kontrollen des Mikroskops und der Online-Video eine andere Gruppe von Zellen zu finden. Ergebnis dieser Zellen, wie in 6.2.2 beschrieben. </li><li> Ergebnis der Schieber from rechts nach links und von unten nach oben. Wählen Sie rund 10 Felder zufällig. Während dieses Prozesses kann jeder geeignete Komet Zelle, die im Sichtfeld erscheint sollte ohne Vorspannung erzielt. HINWEIS: Partitur kein Komet, wenn einer der folgenden Punkte zutrifft: 1) auf einem der Ränder des Schiebers angeordnet ist; 2) zwei oder mehr Kometen überlappen; 3) Es gibt Schmutz in den Schwanz; 4) die Software kann zwischen dem Kopf und der Schwanz nicht unterscheiden; oder 5) die Färbung des Kerns und / oder Schwanz unterscheidet sich stark von anderen Kometen auf der Folie. HINWEIS: Kometen mit fast allen ihren DNA-Fluoreszenz in den Schwanz sind oft bezeichnet als &quot;Igel&quot; Kometen. Hedgehog Kometen sollten nicht gewertet werden, aber die Anzahl von Igeln während des Gleitens Scoring erkannt als Prozentsatz der gesamten Kometen aufgezeichnet und gemeldet werden. </li><li> Analysieren Sie mindestens 75 Kometen pro Folie, Lesen zwei Folien pro Organ / Gewebe mindestens 150 Komet Zellen / Probe insgesamt zu erhalten. Nach der erforderlichen Anzahl von Zellen, die aus einer Folie haben seinen hat, wird das Ergebnis als Tabellendatei für die spätere Datenanalyse gespeichert. </li></ol></li></ol> 7. Histopathologie Analyse <ol><li> Nach mindestens 72 h Fixierung in 10% NBF, gefolgt von Gewebe 21 Trimmen, routinemäßig verarbeiten und bettet das linke seitliche Leberlappen der Proben in einem Paraffin-Wachs - Basis Medium 22. Abschnitt die Proben bei etwa 5 Mikron und sammeln sich auf Glasobjektträger. </li><li> Beflecken die Sektionen mit Hematoxylin und Eosin (H &amp; E): <ol><li> Erhitzen Sie die Folien mit den Paraffingewebeschnitten in einem 60 ° C Ofen für 2 Stunden vor dem Färbeverfahren. </li><li> Verwenden Xylol, die Seiten zu Deparaffinisieren. Rehydrieren die Folien mit abgestuften Ethanol (EtOH) zu einem mit Leitungswasser gespült läuft. </li><li> Legen Sie die Folien in 450 ml Hämatoxylin für 2 min und 40 sec. Rinse-Folien mit Säure (2 ml Eisessig auf 450 ml entionisiertem Wasser) für 4 Sekunden gefolgt von 5 min fließendem Leitungswasser abspülen. </li><li> Platzieren Sie den geschobenes in 450 ml 70% EtOH mit 1 ml Ammoniumhydroxid für 2 min, gefolgt von Leitungswasser spülen für 2 Minuten und 30 Sekunden ausgeführt wird, und 70% EtOH Spülung für 1 min. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger mit 450 ml Eosin Y Lösung 4 ml Eisessig 3 min enthält. </li><li> Entwässern Sie die Folien mit abgestuften EtOH. Deaktivieren Sie die Folien mit Xylol (dreimal je 1 min), und halten Sie gleitet in Xylol bis Abdeckung rutscht auf den Schlitten gelegt werden. </li></ol></li><li> Untersuchen Sie die Folien durch Lichtmikroskopie, Rekord Befunde und Klasse nicht-neoplastischen Läsionen für die Schwere als 1 (minimal), 2 (mild), 3 (moderat) oder 4 (markiert). HINWEIS: Der Schweregrad für eine bestimmte Läsion angewendet wird, basierend auf den relativen Anteil der Leber mit der Läsion (minimal = &lt;1-15%; mild = 16-35%; mäßig = 36-60% und markiert = 61- 100%). </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Das Tier wird die Versuchseinheit für statistische Auswertungen berücksichtigt. DNA-Schäden als% DN ausgedrücktEin in Schwanz. </li><li> Oxidative DNA-Schäden wird wie folgt berechnet: die Referenz Dias (kein Enzymbehandlung), geben eine Schätzung der Hintergrund DNA-Strangbrüche (SB). HINWEIS: Die enzymbehandelte Folien bieten ein gewisses Maß an Strangbrüchen und oxidierte Basen (SB + OX). Eine lineare Dosis - Antwort für% DNA in tail als Funktion der DNA - Schädigung, Subtraktion von SB aus SB + OX gibt eine Schätzung der DNA - Strangbrüche von oxidiertem Pyrimidine / verändert Purine 23 annimmt. </li><li> Analyse% DNA in tail als Funktion der Dosis von Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test für paarweise Vergleiche der Reaktionen bei den behandelten Tieren zur Fahrzeugsteuerung. HINWEIS: Alle Tests werden one-tailed und einen p-Wert von weniger als 0,05 wird als Kriterium für statistische Signifikanz gesetzt. </li></ol>

<ol><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%27comet%27+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf</a> (2011).</li>
<li>Committee, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+dose-response+analysis+of+genotoxicity+in+cyproterone+acetate-treated+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Genet+Toxicol+Environ+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).</li>
<li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genotoxicity+of+estragole+in+male+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats.</a> Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).</li>
<li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genotoxicity+of+furan+in+F344+rats+at+cancer+bioassay+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+genotoxicity+assessment+of+silver+nanoparticles+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse.</a> Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).</li>
<li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyleugenol+genotoxicity+in+the+Fischer+344+rat+using+the+comet+assay+and+pathway-focused+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling.</a> Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).</li>
<li>Manjanatha, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+doxorubicin+in+F344+rats+by+combining+the+comet+assay%2C+flow-cytometric+peripheral+blood+micronucleus+test%2C+and+pathway-focused+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling.</a> Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+oxidative+damage+to+DNA+and+its+repair+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).</li>
<li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+comet+assay%3A+use+and+status+in+genotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li>
<li>Hartmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+conducting+the+in+vivo+alkaline+Comet+assay.+4th+International+Comet+Assay+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop.</a> Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+oxidative+DNA+damage+and+its+repair+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay.</a> Mutat Res. 681, 24-32 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+in+human+biomonitoring+studies%3A+reliability%2C+validation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications.</a> Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).</li>
<li>Gutzkow, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+comet+assay+using+96+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">High-throughput comet assay using 96 minigels.</a> Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).</li>
<li>International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cometassay.com/JaCVAM.pdf">http://cometassay.com/JaCVAM.pdf</a> (2009).</li>
<li>Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02">http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02</a> (2014).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li>
<li>Carson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Self-Instrumental+Text%5BTitle%5D)+AND+%22Histotechnology%22%5BJournal%5D)">A Self-Instrumental Text.</a> Histotechnology. , 25-37 (1996).</li>
<li>Dusinska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+COMET+ASSAY%2C+modified+for+detection+of+oxidised+bases+with+the+use+of+bacterial+repair+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Dusinska+Protocol+%5BInternet%5D%22%5BJournal%5D)">THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases.</a> Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF">http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF</a> (2000).</li>
<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat konkurrierende oder widersprüchliche Interessen. Die Informationen in diesen Materialien stellen keine formelle Informationsverbreitung durch die FDA dar und stellen weder die Position noch die Politik der Behörde dar.

Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Messung der direkten und oxidative DNA-Schäden in der Rattenleber auf Einzelzellebene. Das allgemeine Protokoll ist anwendbar auf jedes Gewebe , aus dem einzelne Zellen oder Zellkerne können mit minimalen Verarbeitungs induzierte DNA - Schädigung (dh DNA - Schädigung induziert nicht durch das Testmittel, sondern durch die Handhabung und Verarbeitung der tierischen Geweben) isoliert werden. In unserer Forschung haben wir alkalischen Comet-Assay auf Zellen aus dem Kno...

Die alkalische Comet-Assay misst DNA-Strangbrüche auf Einzelzellebene. Suspensionen einzelner Zellen in Agarose auf einem Mikroskop-Objektträger eingebettet und die Zellen lysiert Nukleoide zu bilden, die supercoiled Schleifen von DNA enthalten. Elektrophorese bei pH&gt; 13 führt zum Verlust von Supercoiling in DNA Schlaufen enthaltenden Strangbrüche, mit den befreit DNA-Stränge in Richtung der Anode wandernde, wodurch Kometen artigen Strukturen, die durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden kann. Fragmentierte DNA wandert aus dem &quot;Kopf&quot; des Kometen in den &quot;Schwanz&quot; auf der Basis der Größe des Fragments, und die relative Fluoreszenz des Kometenschweif im Vergleich zu der Gesamtintensität (Kopf und Schwanz) verwendet werden kann , um DNA - Bruch 1 quantifizieren , 2. Der Test ist einfach, empfindlich, vielseitig, schnell und relativ kostengünstig 1. Der Nachweis von fragmentierter DNA durch DNA-schädigende Mittel ist ein Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Zellen oder isolierten Zellkernen von indivi verwendetDoppelgewebe von Tieren, die mit potentiell genotoxischen behandelnde Material (s). Aufgrund seiner Vorteile ist die in - vivo - Comet - Assay als zweite in vivo Genotoxizität Test empfohlen (gepaart mit der in vivo - Mikrokerntest) für die Durchführung von Produktsicherheit Bewertungen in bestehenden International Conference on Harmonisation (ICH) 3 und European Food Safety Authority (EFSA ) 4 regulatorischen Vorgaben. In unserem Labor haben wir den Test zur Bewertung der in - vivo - DNA - Schäden , die durch Lebensmittelzutaten, Pharmazeutika und Nanomaterialien 5-10 induzierte eingesetzt. Rattenleber wird als ein Beispiel in diesem Protokoll verwendet werden, aber der Comet-Assay kann mit anderen Geweben / Organen von Versuchstieren, solange intakten Einzelzellen aus dem Gewebe isoliert durchgeführt werden werden. Bestimmte Arten von DNA-Schäden sind schwierig, wie DNA-Strangbrüche zu erfassen, ohne die grundlegende alkalischen Comet-Assay modifiziert wird. Im Falle der oxidative DNA-Schäden, Strang bReaks kann durch Verdau mit der Reparatur - Enzyme wie menschliches 8-Oxoguanin-DNA-N-Glycosylase - 1 (hOGG1, die Pausen bei der 8-Oxoguanin erzeugt (8-oxoGua) und Methyl-Fapy-Guanin - 11 bei oxidative Läsionen in DNA erstellt werden. auch Endonuclease III (Endo III) erzeugt Pausen hauptsächlich an oxidiertem Pyrimidine 1. Somit ist die Zugabe eines Enzym-Verdauungsschritt macht den Assay eine spezifische und sensitive Methode zur Messung oxidative DNA - Schädigung in vivo . 12 diese Assays verwendet wird , haben wir gezeigt , toxicant induzierte oxidative DNA - Schädigung in der Leber von Ratten und Mäusen , 6-8 und im Herzen von Ratten 10. Die alkalische Comet - Assay hat viele Anwendungen in der genetischen Toxikologie und Human - Biomonitoring: 1) als ein Follow-up in vivo - Test für Genotoxinen durch empfindliche identifiziert in - vitro - Tests 3,13, 2) Mechanismen der xenobiotischen-induzierte DNA - Schäden in mehreren Geweben zu bewerten 3) 14, zu untersuchen , ob einKarzinogen betreibt eine gentoxische oder nichtgenotoxisches Wirkungsweise (MOA) 7 verwenden, 4) Reparatur DNA - Schäden zu bewerten 15, 5) 16 menschliche Krankheiten und Belastungen am Arbeitsplatz zu untersuchen und 6) als potenzielle Hochdurchsatz - Screening - Test für organspezifische Genotoxizität 17.

<table><tbody><tr><td>Deckgläser (Nr. 1, 24 x 50 mm) &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Dinatrium</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ frei)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarose</td></tr><tr><td>Normalschmelzende Agarose (NMA)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Papierstreifen für pH-Tests (pH 7,5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumclorid</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgeretiketten (0,94 x 0,5 Zoll)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; Gold&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Sockel&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (40 & Mikro; m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Endonuklease III (Nth)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr></tbody></table>

in - vivo - alkaline comet assay und enzymmodifizierten alkaline comet assay zur messung von dna - strangbrüchen und oxidative dna - schäden in der rattenleber

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Nicht reparierte DNA-Schäden können zu genetischer Instabilität führen, was wiederum die Krebsentwicklung fördern kann. Daher ist die Identifizierung potenzieller DNA-schädigender Stoffe wichtig für den Schutz der öffentlichen Gesundheit. Der in vivo alkalische Kometen-Assay, der DNA-Schäden als Strangbrüche nachweist, ist besonders relevant für die Bewertung der genotoxischen Gefahren von Xenobiotika, da seine Reaktionen die in vivo Absorption, Gewebeverteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) von Chemikalien sowie den DNA-Reparaturprozess widerspiegeln. Im Vergleich zu anderen In-vivo-DNA-Schadenstests ist der Assay schnell, empfindlich, visuell und kostengünstig, und durch die Umwandlung oxidativer DNA-Schäden in Strangbrüche mit spezifischen Reparaturenzymen kann der Assay oxidative DNA-Schäden auf effiziente und relativ artefaktfreie Weise messen. Die Messung von DNA-Schäden mit dem Comet-Assay kann sowohl unter Verwendung akuter als auch subchronischer toxikologischer Studiendesigns durchgeführt werden, und durch die Integration des Comet-Assays mit anderen toxikologischen Bewertungen erfüllt der Assay die Anforderungen des Tierschutzes, indem er die tierischen Ressourcen maximal nutzt. Ein weiterer großer Vorteil der Assays besteht darin, dass sie nur eine geringe Menge an Zellen benötigen und die Zellen nicht aus proliferierenden Zellpopulationen stammen müssen. Die Assays können auch mit einer Vielzahl von menschlichen Proben durchgeführt werden, die von klinisch oder beruflich exponierten Personen gewonnen wurden.

Die in vivo alkalischen Komet - Test wurde in Verbindung mit dem enzymmodifizierten Comet - Assay durchgeführt , sowohl direkt als auch oxidative DNA - Schädigung in der Leber von Ratten , die mit Cyproteronacetat (CPA) 5 behandelt , zu messen. CPA ist ein synthetisches hormonelle Medikament , das Lebertumoren bei männlichen Ratten zu induzieren benötigt höhere Dosen induziert im Vergleich zu Frauen 24 Rattenlebertumoren in einer geschlechtsspezifische Art ...

Der alkalische Kometen-Assay misst DNA-Strangbrüche in eukaryotischen Zellen. Durch Hinzufügen eines Endonuklease III- oder humanen 8-Oxoguanin-DNA-N-Glykosylase-Verdauungsschritts kann der Assay oxidative DNA-Schäden effizient nachweisen. Wir beschreiben Methoden zur Verwendung dieser Assays zum Nachweis von DNA-Schäden in der Leber von Ratten.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Das übergeordnete Ziel des in-vivo-Alkalischen-Kometen-Assays und des enzymatisch modifizierten alkalischen Kometen-Assays besteht darin, direkte und oxidative DNA-Schäden gleichzeitig auf Einzelzell-Ebene zu messen. Diese Methode wurde ursprünglich als regulatorisches Werkzeug für die Sicherheitsanalyse von von der FDA regulierten Produkten vorgeschlagen. Sie kann wesentliche Fragen in Bereichen beantworten, die von der regulatorischen Sicherheitsbewertung über die molekulare Epidemiologie bis hin zur grundlegenden Krebsforschung reichen.Diese Technik ist empfindlich und vielseitig einsetzbar und außerdem relativ kostengünstig. Sie kann DNA-Schäden praktisch in jedem tierischen Gewebe nachweisen. Im Allgemeinen war bekannt, dass bei dieser Methode die schnelle Herstellung von Einzelzell-Suspensionen aus verschiedenen Geweben schwierig ist und dies eine Herausforderung darstellen kann.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da sie sowohl eine gewisse Kunst als auch Wissenschaft erfordert. Nachdem die Ratten gemäß dem schriftlichen Protokoll mit Kohlendioxidgas euthanasiert wurden, ertasten Sie, um zu bestätigen, dass die Ratte keinen Herzschlag mehr hat, und kneifen Sie in die Zehen, um zu überprüfen, ob die Ratte ihre Gliedmaßen nicht zurückzieht. Desinfizieren Sie die Haut mit Ethanol und öffnen Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Bauchhöhle, bevor Sie die intakte Leber entfernen.Mit einer Schere wird der linke Seitenlappen vom übrigen Organ getrennt und auf ein Schneidebrett gelegt. Anschließend werden mit einer Einweg-Rasierklinge zwei benachbarte, 3 bis 4 Millimeter dicke Querschnitte angefertigt. Ein Querschnitt wird auf Filterpapier gelegt und danach in 10 % neutral gepuffertes Formalin (NBF) überführt.Legen Sie den zweiten Leberabschnitt in fünf Milliliter eiskaltes Zerkleinerungspuffer in einer sechs Zentimeter großen Petrischale und spülen Sie diesen dreimal aus, um das restliche Blut zu entfernen. Überführen Sie anschließend den Leberabschnitt in ein neues zwei Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das ein Milliliter eiskalten Zerkleinerungspuffer enthält. Zerkleinern Sie den Abschnitt mit einer feinen Schere, um die Zellen freizusetzen, und filtrieren Sie dann die Zellsuspension mithilfe eines 40-Mikrometer-Zellsiebs, um eventuelle Gewebeklumpen zu entfernen.Stellen Sie die Einzelzell-Suspension auf Eis und überprüfen Sie mithilfe eines Hämozytometers, ob die Konzentration etwa zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter beträgt. Zum Herstellen der Komet-Präparate mischen Sie ein Volumen der Einzelzell-Suspension mit zehn Volumina einer geschmolzenen 0,5-%-Lösung von Low-Melting-Agarose bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie sofort 100 Mikroliter auf einen zuvor mit Agarose beschichteten Objektträger und bedecken Sie die Agarose-Zell-Mischung mit einem Deckglas.Legen Sie die Objektträger flach hin und kühlen Sie sie bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nachdem das Gel erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser und tauchen Sie die Objektträger in vorab gekühlte Lysepufferlösung ein. Inkubieren Sie im Dunkeln bei vier Grad Celsius für eine Stunde bis über Nacht.Nach der Inkubation sechs der acht für jede Gewebeprobe vorbereiteten Objektträger aus dem Lysepuffer entnehmen und sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit Enzympuffer bei Raumtemperatur waschen. Anschließend überschüssige Flüssigkeit mit Gewebe abtupfen. Danach die hOGG1- und Endo-III-Enzymstammlösungen im Verhältnis 1 zu 1000 mit Enzympuffer verdünnen und auf Eis stellen.Legen Sie die Objektträger in mit angefeuchteten Papiertüchern ausgelegte Petrischalen und geben Sie 200 Mikroliter der folgenden Lösungen auf die Objektträger jeder Behandlungsgruppe. Geben Sie zwei Objektträgern allein Pufferlösung, zwei Objektträgern hOGG1-Lösung und zwei Objektträgern Endo-III-Lösung und decken Sie die Objektträger mit Parafilm ab. Anschließend inkubieren Sie die mit Endo III behandelten und die Referenz-Objektträger bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten und die mit hOGG1 behandelten Objektträger für 30 Minuten.Nach der Inkubation die Objektträger entleeren und für die Referenzpräparate kalte Neutralisierungspuffer verwenden, um restliche Detergenzien und Salze zu entfernen. Anschließend die enzymbehandelten Objektträger mit destilliertem Wasser spülen. Die Objektträger zufällig in einem horizontalen Gelelektrophoresebehälter platzieren, wobei Lücken vermieden werden sollen.Dann frisch hergestelltes Elektrophorese-Puffer in den Tank geben, wobei Blasen vermieden werden sollen, bis die Objektträger gerade bedeckt sind. Das Netzteil auf 0,7 Volt pro Zentimeter einstellen und die Objektträger 20 Minuten im alkalischen Puffer inkubieren, um die Entwindung der DNA und die Expression der alkaliempfindlichen Schäden zu ermöglichen. Die Position der Objektträger, die Temperatur des Puffers und die Stromstärke dokumentieren.Nach der Inkubation zum Entwinden stellen Sie den Elektrophoresebehälter auf vier Grad Celsius. Drücken Sie dann die Taste „Run“ am Netzteil und stellen Sie gegebenenfalls den Strom durch Erhöhen oder Senken des Pufferstands auf 300 Milliampere ein, wobei dieser gerade über den Objektträgern liegen sollte. Führen Sie die Proben 20 Minuten lang durch, bevor Sie erneut die Position der Objektträger, die Temperatur des Puffers und die Stromstärke aufzeichnen.Nach der Elektrophorese die Objektträger vorsichtig aus dem Tank nehmen und in einen Neutralisierungspuffer zur Neutralisierung des überschüssigen Alkalis eintauchen. Anschließend die Objektträger abtropfen lassen und die Neutralisierung noch zweimal wiederholen. Danach die Objektträger mit kaltem 100 %igen Ethanol fünf Minuten lang fixieren.Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen und lagern Sie sie in einer trockenen Umgebung. Um die DNA anzufärben, stellen Sie die Objektträger auf ein Karton- oder Metalltablett und geben Sie 200 µL der Arbeitslösung des fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoffs auf jeden Objektträger, bevor Sie diesen mit einem Deckglas abdecken. Schützen Sie die Objektträger vor Licht und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang.Danach die Objektträger auswerten, indem überschüssige Färbelösung vorsichtig abgeblottet wird, wobei darauf geachtet werden muss, das Deckglas nicht zu stören. Anschließend den Kometen-Objektträger auf den Tisch eines mit einer Videokamera ausgestatteten Fluoreszenzmikroskops legen und zufällig ein Feld mit Zellen auswählen. Nach dem Öffnen der Kometen-Assay-Software mit der Maus eine Zelle auswählen und dann mit der linken Maustaste auf das Zentrum des Kometenkopfes der Zelle klicken.Die Software berechnet die Parameter für die Zelle und fügt diese einer Datendatei hinzu. Sobald alle Zellen im aktuellen Feld ausgewertet wurden, wechseln Sie zu einem anderen Feld und wiederholen die Auswertung aller geeigneten Kometzellen, ohne eine Auswahl vorzunehmen. Werten Sie 10 zufällige Felder und mindestens 75 Kometen pro Objektträger aus.Speichern Sie die Daten abschließend in einer Tabellenkalkulation für die spätere Analyse. Wie zuvor berichtet, ist CPA ein synthetisches hormonelles Medikament, das bei Ratten leberspezifische Tumore in geschlechtsspezifischer Weise induziert, wobei eine fünfmal höhere Dosis erforderlich ist, um Lebertumore bei männlichen Ratten im Vergleich zu weiblichen zu induzieren. Wie hier gezeigt, zeigte der in-vivo-Alkalischen-Comet-Assay sowie der enzymatisch modifizierte Comet-Assay, dass eine fünfmal höhere Dosis von CPA erforderlich war, um bei männlichen Lebern im Vergleich zu weiblichen eine signifikante Zunahme von DNA-Schäden hervorzurufen.Hydroxysteroid-Sulfotransferase oder HST wird bei erwachsenen weiblichen Ratten im Vergleich zu erwachsenen männlichen Ratten 15-fach stärker exprimiert. Der HST-Stoffwechsel ist ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt bei der Aktivierung von CPA zu DNA-bindenden Metaboliten. Wie hier zu sehen ist, war die durch CPA induzierte oxidative DNA-Schädigung im Allgemeinen in den Lebern männlicher Ratten stärker ausgeprägt als in denen weiblicher Ratten und daher bei männlichen Ratten weniger wahrscheinlich, die Tumorbildung zu begrenzen.Wie in diesen Tabellen berichtet, zeigte die histopathologische Untersuchung der Lebern von CPA-behandelten Ratten keine Anzeichen für agenteninduzierte Apoptose oder Nekrose, was frühere Schlussfolgerungen bestätigt, dass die positiven Ergebnisse des Komet-Assays nicht auf einer sekundären Wirkung der Zytotoxizität beruhen. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, eine Einzelzell-Suspension zu gewinnen und die Komet-Assay-Präparate so schnell wie möglich herzustellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der genetischen Toxikologie DNA-Schäden und deren Reparatur quantitativ praktisch in jedem tierischen Gewebe sowie auch in menschlichen Proben untersuchen konnten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein besseres Verständnis dafür entwickelt haben, wie man den in-vivo-Alkalischen-Kometen-Assay zusammen mit dem enzymatisch modifizierten Kometen-Assay verwendet, um gleichzeitig Spuren von alkylierendem und oxidativem DNS-Schaden auf Einzelzellebene in tierischen Geweben nachzuweisen. Bitte bedenken Sie, dass der Umgang mit Reagenzien, die DNS-Schäden verursachen, äußerst gefährlich sein kann. Tragen Sie stets die persönliche Schutzausrüstung, wenn Sie diese Verfahren durchführen.

in-vivo-alkaline-comet-assay-enzyme-modified-alkaline-comet-assay-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir einen alkalischen Einzelzell-Elektrophorese-Assay zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrang-DNA-Brüchen in Doxorubicin-behandelten Zellen. Alkalische Bedingungen stören die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen DNA-Basenpaaren, was zu einer vollständigen Abwicklung und Trennung der DNA-Stränge führt. Dies ermöglicht eine differentielle Migration von unbeschädigten und beschädigten DNA-Fragmenten im Agarosegel nach der Elektrophorese, wodurch eine...

Basische Einzelzell-Gelelektrophorese: eine empfindliche Technik zur quantitativen Abschätzung von DNA-Schäden in einzelnen Krebszellen nach Chemotherapie

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif...

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Lernen Sie den in vivo Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA-Strangbrüchen und oxidativen DNA-Schäden in Rattenleberzellen. Diese empfindliche Methode ermöglicht regulatorische Sicherheitsbewertungen.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber (Video) | JoVE Journal

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Weitere Videos entdecken