Name: Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kanülierung von zerebralen Parenchymarteriolen aus Mäusegehirnen für Druckmyographie-Studien. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung vaskulärer Funktion und Struktur unter physiologischen Bedingungen.

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Finanziert durch NHLBI R01HL091905 (SE), das CADASIL Forschungsstipendium (FD) der United Leukodystrophy Foundation und AHA 15POST247200 (PWP). Die Autoren danken Samantha P. Ahchay für die Bereitstellung des Bildes in Abbildung 1 und Dr. Gerry Herrera, Ph.D., für die kritischen Kommentare zum Manuskript.

1. Cannula und Kammer Vorbereitung <ol><li> Legen Rein Borosilikat-Glaskapillaren (Außendurchmesser: 1,2 mm; Innendurchmesser: 0,69 mm; 10 mm Länge) in die Nuten einer Pipettenzieher mit einem Platinfaden (Durchmesser: 100 um). </li><li> Mit geeigneten Einstellungen, ziehen Sie die Kapillare eine Kanüle mit einer langen und dünnen Spitze (Abbildung 2) mit einer Mikropipette Abzieher zu erzeugen. Die Einstellungen werden verwendet: Heat - 700, Pull - 100, Geschwindigkeit - 50, Zeit - 10. </li><li> Setzen Sie eine Kanüle in den Halter der Druck Myographions Kammer. Richten Sie die entsprechend Kanülen. </li><li> die Spitzen der Kanülen vorsichtig brechen, indem sie mit einer Pinzette unter dem Binokular auf den gewünschten Durchmesser verwendet wird. Hier zeigen wir eine Kanüle mit einer 10 &amp; mgr; m Spitze (Abbildung 2). </li><li> Füllen Sie die beiden Kanülen mit künstlichem Liquor (aCSF) , die 1,8 mM Ca 2+; Füllen der Kammer mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% RinderserumAlbumin (BSA) + 10 &amp; mgr; M Diltiazem (alle Lösungen sollten vor Beginn des Experiments frisch zubereitet werden). In Abhängigkeit von der Größe der Kammer, variiert das Volumen von aCSF zwischen 5 bis 20 ml. Lagern Sie die Kammer bei 4 ᵒ C , bis sie bereit Kanülierung zu starten. HINWEIS: Diltiazem ist eine reversible L-Typ spannungsgesteuerten Calcium-Inhibitor, der eine Erweiterung der Arteriolen verursachen wird, die Kanülierung erleichtert </li></ol> 2. Isolierung von Parenchymale Arteriolen <ol><li> Euthanize das Tier unmittelbar vor der Präparation unter Verwendung von Standardprotokollen im Labor, die von der Institution Tierpflegekommission genehmigt werden. Die Verwendung von Barbituraten oder Kohlendioxid ist bevorzugt, da andere üblicherweise verwendete Anästhetika gefäßerweiternde Wirkung im cerebralen Zirkulations 15 aufweisen. Alle tierischen Verfahren hier gezeigt wurden von Institutional Animal Care und Use Committee der University of Nevada School of Medicine, und sind in ag genehmigtreement mit den National Institutes of Health &quot;Guiding Principles in die Pflege und Verwendung von Tieren&quot;. </li><li> Euthanize das Tier unter Verwendung von Kohlendioxid. Vor dem Abtrennen des Kopfes zu gewährleisten, dass das Tier die Atmung ausgesetzt hat und nicht mehr reagiert, wenn seine Pfoten einklemmen. </li><li> Enthaupten das Tier eine scharfe Schere mit (Maus) oder Guillotine (Ratte). Entfernen Sie die Haut vom Kopf des Tieres und entlang der Mittellinie Schädelnaht geschnitten, um eine feine Spitze Schere verwenden. Mit entfernen, um eine stumpfen Pinzette (Maus) oder eine Knochenzange vorsichtig die Schädelknochen und die Gehirn- aussetzen. Entfernen Sie das Gehirn langsam und vorsichtig als nicht Oberfläche pialen Arterien zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in einen Behälter gefüllt mit 20 ml Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA auf Eis ergänzt. </li><li> Füllen Sie eine Dissektion Gericht ein Pad mit eiskaltem Ca2 + -freien aCSF ergänzt mit 1% BSA und übertragen das Gehirn mit der Bauchseite nach oben auf dieser Schale (2A) enthält. Die Schale unter einem dissecting Mikroskop (3A). Pin das Gehirn auf das Pad mit 27-Gauge-Nadeln. Achten Sie darauf, zu vermeiden, Pins in der Nähe der mittleren Hirnarterie platziert (MCA). </li><li> Localize den Kreis von Willis und dem MCA von ihm Verzweigung. Mit scharfen und Vannas Feder Schere ausgerichtet sind, schneiden Sie ein kleines Rechteck um den MCA. Stellen Sie sicher, dass Rechteck in der Nähe von 5 mm über die ganze Länge des MCA. Der obere Teil des Rechtecks ​​sollte aus dem Kreis von Willis (proximal zu dem Kreis von Willis, 2B, Pfeil) hinter dem Verzweigungspunkt sein. </li><li> Mit Hilfe der Vannas Frühjahr Schere, führen für eine Hinterschneidung in die Tiefe des Gewebes ca. 2 - 3 mm. HINWEIS: Dieser Teil ist von entscheidender Bedeutung für eine gute Isolierung von parenchymal Arteriolen, und es kann einige Versuche nehmen Sie es richtig zu machen. Wenn der Schnitt tief genug gemacht ist Anmerkung werden die isolierten parenchymal Arteriolen kurz sein; wenn der Schnitt zu tief ist, werden die Arteriolen an ihrem Verzweigungspunkt brechen, wenn die seziertGewebe wird entfernt. </li><li> Festnageln am meisten distale Ende des Hirnschnitt in das Sezieren Schale mit dem MCA nach oben (distal aus dem Kreis von Willis) unter Verwendung von Insekten Pins. Machen Sie einen flachen Einschnitt die pia in der Nähe von dem Stift zu schneiden, wobei darauf geachtet, nicht zu schneiden, zu tief in das darunter liegende Hirnrinde (sonst die Stifte nicht halten). </li><li> greifen vorsichtig auf jeder Seite der pia mit kleinen Zange und starten Sie den pia aus Rinde Peeling. Falls erforderlich, halten Sie sich an die MCA, um sicherzustellen, dass die umgebende pialen Membran nicht beschädigt wird. </li><li> Halten Sie Peeling, bis die pia die MCA enthält, aus der Rinde frei ist. Beachten Sie, dass der Widerstand gegen Abschälen an den Kreis schließen erhöhen die Willis. Seien Sie besonders vorsichtig an dieser Stelle, weil die längeren parenchymal Arteriolen in dieser Region sein wird. </li><li> Sobald der pia frei ist, legen Sie sie vorsichtig auf der Oberseite des Pad auf dem Sezieren Schale mit der Oberfläche gegen Arteriolen nach unten (2B) zu parenchymal. </li> &lt;li&gt; Mit Vannas Frühjahr Schere, schneiden Sie die seziert Arteriolen von der MCA frei heraus, sicherstellen, dass die Enden des Schiffes stumpf geschnitten werden. </li><li> Gesammelte Arteriolen kann für Druck Myographie, molekulare Analyse oder Isolierung von nativen glatten Muskulatur oder Endothelzellen verwendet werden. </li></ol> 3. Druck Myographie <ol><li> Bereiten Sie die Naht vor der Zeit. Schneiden Sie das dunkelgrüne Nylonfaden in 5 mm große Stücke und legen Sie auf der klebrigen Seite eines doppelseitigen Klebeband auf einer Petrischale. Unter dem Binokular, trennen Sie jedes Stück in seine Fäden feinen Pinzette und locker eine einfache Halbkupplung Knoten in die andere, indem ein Ende der Faden herzustellen. </li><li> Mit einer Pinzette, wählen Sie einen Knoten aus dem doppelseitigen Klebeband, um sicherzustellen, es nicht mit zu viel Druck zu greifen. Ziehen Sie den Faden in Badlösung, Rutsche Knoten auf Kanüle ein und ziehen Sie es aus der Spitze der Kanüle in einem Abstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 Nähte an jeder Kanüle zu haben. </li><li> Mantel mit einem GlasMikropipette mit einer BSA - Lösung 10% und dann den Überschuss mit Ca 2+ -freien aCSF mit 1% BSA ergänzt abspülen. </li><li> Ziehen Sie 50 ul-Lösung in die Glas-Mikropipette, ziehen ein parenchymal Arteriolen und übertragen auf den Druck Myographie Kammer. Drücken Sie den Kolben in einer fließenden Bewegung die parenchymal Arteriolen in die Kammer verzichten zu verhindern, dass es zu der inneren Kammer des Glasmikropipette kleben. </li><li> Mit Hilfe von zwei Super feinen Pinzette, öffnen Sie das Lumen des PA, wobei darauf geachtet, nur das Ende des Gefäßes berühren. </li><li> mit der Pinzette die Kanten des parenchymal Arteriolen zu halten, sorgfältig das Gefäß auf die Kanüle ziehen. Ziehen weit genug an der Kanüle , so daß der Behälter nicht ganz am verjüngten Ende der Kanüle (3A) ist. </li><li> Lösen Sie die 2 Nähte an der Kanüle und ziehen Sie sie auf dem Schiff (3B). Raum die Fäden auseinander ein wenig auf dem Schiff, und ziehen in Richtung des Bedieners während tighzehn davon. Stellen Sie sicher, dass alle Zweige vor dem Schließen der gegenüberliegenden Ende des parenchymal arteriole abgebunden. </li><li> Drehen Kammer um und schließen Sie das andere Ende des parenchymal arteriole als Sacksack. Um das zu erreichen, öffnen Sie die Bande auf der gegenüberliegenden Kanüle und geben es auf den Arteriolen. langsam schließen, den Knoten in einer Weise, dass die parenchymal arteriole wird auf der Seite der Kanüle gebunden werden. Vermeiden Längsdehnung der Arteriolen. (3C). HINWEIS: Wenn das Ziel der Studie ist es Drogen durch das Lumen zu perfundieren, kanülieren das entgegengesetzte Ende statt der parenchymalen Arteriole zu der Seite der Kanüle zu binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanülen haben keine Salzkristalle oder interne Build-ups, die intraluminale Fluss blockieren. Regulierung der Strömungsrate in geeigneter Weise, um Scherspannung innerhalb der physiologischen Niveaus zu halten. Eine Studie von Shih et al. Zeigt Flussraten innerhalb Arteriolen bei Ratten 8, stechend und kann als erste Orientierungshilfe für pi dienenViele Studien. </li><li> übertragen Sie vorsichtig die Kammer des Mikroskops auf die Bühne für die Aufzeichnung von Gefäßdurchmesser verwendet werden. Bringen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch, Anschlusstemperaturfühler und Ein- und Ausgänge für die Perfusion auf die richtigen Röhren. Unter Druck setzen der Arteriole bis 40 mmHg intraluminalen Druck für Arteriolen Maus parenchymalen oder 50 mmHg für Ratten - Arteriolen, erhältlich ein Drucksystem unter Verwendung im Labor (Wassersäule, verbunden peristaltische Pumpe mit einem Druckwandler, etc.). 4D zeigt ein Beispiel für eine Schlauchpumpe mit einem Druckwandler verbunden, um den kanülierten Arteriole zu beaufschlagen. </li><li> Schalten Sie das System verwendet , um Veränderungen im Durchmesser (Abbildung 3E). Passen Sie die Einstellungen am Mikroskop, wie Beleuchtung und Kontrast, um die besten Erkennung möglich zu erhalten. Idealerweise sollten die Wände des Arteriole dunkel sein und das Lumen durchscheinend. Sobald die Erkennung geeignet ist, beginnen t Aufnahmeer experimentieren. </li><li> Starten Sie das Superfusionssystem. Waschen Sie die kanülierte, unter Druck stehenden parenchymalen Arteriole mit warmem (37 ᵒ C) aCSF enthaltend 1,8 mM Ca 2+ für 15 bis 20 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 3 bis 5 ml / min. Diese aCSF sollte enthalten Diltiazem oder BSA nicht. </li><li> Ersetzen Sie die regelmäßige aCSF mit 60 mM KCl aCSF die Lebensfähigkeit der Zubereitung zu bewerten. 20% Einschnürung 60 mM KCl - PAs An dieser Stelle sollte 10 aufweisen. Wenn die Arteriolen in diesem Umfang einengen nicht, zu entfernen und ein anderes arteriole kanülieren. </li><li> Waschen Sie die 60 mM KCl mit regelmäßigen aCSF. Warten Sie, bis Generation von spontanen myogenic Ton, der zu einer Stunde dauern kann. Wenn arteriole bis dahin nicht myogenic Ton haben, ersetzen Sie es mit einem anderen Arteriolen. HINWEIS: Myogenic Ton wird als graduelle, beobachtet und manchmal langsam, Verringerung des Lumendurchmesser des Gefßes ohne Stimulation durch kontraktile Agonisten oder hohen KCl-Lösung. Myogenen tone durch die folgende f berechnetormula: (1 - (aktiv Lumendurchmesser / Passiv - Lumendurchmesser)) x 100 5 Eine geeignete Menge an myogenic Ton kann sich je nach Behandlungen, Zerrungen, Spezies, Transgenen, usw.. In der Regel reicht physiologischen myogenic Ton 15 bis 30% 5. </li></ol> 4. Beispiel Druck Myographie Experimente: Agonist-induzierte Konstriktion und Myogenic Reaktivität <ol><li> Bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen eines Agonisten der Wahl in aCSF mit geeigneten Konzentrationen. Für das aktuelle Beispiel wurde der Thromboxan A 2 -Rezeptor - Agonisten U46619 verwendet. Eine Stammlösung von 1 ml U46619 bei einer Konzentration von 1 mM, wurde hergestellt. Transfer von 100 &amp; mgr; l der 1 mM-Lösung in ein neues Röhrchen 900 ul aCSF enthält eine 10-fache Verdünnung des Medikaments zu machen, in einer Lösung führt, die 100 uM U46619. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 Verdünnungen im Bereich von 1 mM bis 100 nM eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve constrictor vorzubereiten. </li><li> Ergänzen Sie diegesamte Volumen der Lösung der Agonist (1 ml für die erste Dosis, gefolgt von 900 &amp; mgr; l aller nachfolgenden Dosen) enthält, zu 100 ml Superfusion aCSF. Dies wird zu einer zusätzlichen 100-fachen Verdünnung des Agonisten führen. Somit sind die Endkonzentrationen von Agonist in dem Bad Bereich von 10 pM bis 10 uM. Lassen Sie Arteriolen für ~ 10 min in jeder Konzentration inkubiert, bis luminalen Durchmesser einen stationären Zustand erreicht. </li><li> Waschen Sie den Agonisten aus durch PAs mit aCSF ohne Drogen Superfusion, bis der PA Durchmesser wieder auf den ursprünglichen Wert. Inkubieren Sie die parenchymal arteriole in Ca 2+ -freien aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA maximale Dilatation und aufzeichnen passiven Durchmesser der Arteriolen zu induzieren. </li><li> Entfernen Sie die parenchymal arteriole aus der Kanüle durch vorsichtiges Herausziehen während in das Ende der Beziehungen halten. Waschen Sie die Behälterkammer mit Doppel entsalztem Wasser Schutt und mehr als Agonisten zu entfernen. Füllen Sie die Kammer mit Ca2+ -freien aCSF + BSA und kanülieren andere arteriole. Es ist nicht mehr als ein Versuch pro Arteriole empfohlen durchzuführen. </li><li> Um eine myogenic Reaktivität Experiment durchführen, lassen Sie den parenchymal Arteriolen bei 40 mmHg intraluminale Druck äquilibrieren bis spontane myogenic Ton erzeugt wird (wie oben beschrieben). Reduzieren Sie die intraluminale Druck auf 5 mmHg und erlauben PA für ~ 5 äquilibrieren - 10 min, bis luminalen Durchmesser stabilen Zustand erreicht. Erhöhen Sie den intraluminalen Druck schrittweise das Intervall der Wahl (zum Beispiel 5-140 mmHg in 20 mmHg-Schritten). </li><li> Nicht die Arteriole zu intraluminalen Druck unter 5 mmHg belichten, wie Zusammenbruch verursachen könnte und das Endothel schädigen, wodurch die Ergebnisse des Experiments zu verändern. </li><li> Am Ende der Druckkurve, die superfuse parenchymalen Arteriole mit Ca 2+ -freiem aCSF (ohne BSA) , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M Diltiazem + 2 mM EGTA und wiederholen Sie die Druckstufen an den Ausgangs lowest Druck. Hinweis: Dies wird die passive Durchmesser der PA geben, die% myogenic Ton zu berechnen notwendig sind, definiert durch die Formel:% Ton = (1 - (aktiv Durchmesser / Passiv-Durchmesser)) x 100. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Cerebral parenchymal Arteriolen sind hohe Beständigkeit Arteriolen mit wenigen Anastomosen und Zweige, die unterschiedliche neuronale Populationen perfuse. Diese spezialisierten Blutgefäße sind zentrale Akteure bei zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung durch Astrozyten vermittelte Vasodilatation 1. Die Bedeutung dieser spezialisierten Blutgefäße in der zerebralen Gefäßerkrankung ist seit etwa 50 Jahren bekannt, als die Pionierarbeit von Dr. Miller Fisher in den Gebieten von lacunar Inf...

Die cerebrale Durchblutung wird eindeutig organisiert die metabolischen Anforderungen von zentralen Neuronen zu unterstützen, Zellen, die Energie speichert und sind daher sehr empfindlich gegenüber Veränderungen in der Sauerstoffdruck und die Lieferung von notwendigen Nährstoffe begrenzt haben. Als besondere neuronale Subpopulationen aktiv wird , wenn bestimmte Aufgaben durchgeführt werden, fördert die Gefäß eine stark lokalisierte Zunahme der Perfusion 1 lokale Hypoxie und die Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Dies ist eine Form von funktionellen Hyperämie als neurovaskulären Kopplung bekannt ist , und ist abhängig von der einwandfreien Betrieb der Gefäß - Nerven - Einheit, bestehend aus aktiven Neuronen, Astrozyten und Hirnarterien 2. Intrazerebrale parenchymal Arteriolen, eine Gruppe von Blutgefäßen parenchymal umfasst, durchdringt und präkapillaren Arteriolen, sind für diese Reaktion von zentraler Bedeutung , und es ist dann kritisch , sie einzeln zu untersuchen , um 3 neurovaskulären Kopplung zu untersuchen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Parenchymale Arteriolen sind klein (20 bis 70 &amp; mgr; m Innendurchmesser) mit hohem Widerstand der Blutgefäße, die unterschiedliche neuronale Populationen im Gehirn perfuse. Verästelung von pial Arterien auf der Oberfläche eindringen parenchymalen Arteriolen in das Hirnparenchym zu einem fast 90 ᵒ Winkel des Untergrundes der Mikrozirkulation zu füttern (Abbildung 1). Diese Arteriolen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der entsprechenden Perfusionsdruck, da sie die am weitesten distal gelegene glatten Muskulatur haltigen Gefäßen Schutz der Kapillaren sind. Im Gegensatz zu der Oberfläche pialen Zirkulation fehlt parenchymal Arteriolen Nebenzweige und Anastomosen und folglich sind &quot;Engpässe&quot; der zerebralen Durchblutung 4. Als Ergebnis trägt Dysfunktion von parenchymalen Arteriolen zur Entwicklung von zerebrovaskulären Krankheiten wie vaskulären kognitiver Beeinträchtigung und kleine ischämischen Schlaganfällen (auch als stille oder lacunar Hübe bekannt). Studien INDICATe , dass Dysfunktion parenchymal Arteriolen durch essentielle Hypertonie 5, chronischem Stress 6 und ist ein frühes Ereignis in Modell genetischen Maus Kleingefäßerkrankung 7 induziert werden. Weiterhin ist experimentell induzierten Okklusion einzelner eindringende Arteriolen bei Ratten ausreichend kleinen ischämischen Schlaganfällen zu verursachen, die zylindrisch sind in Form, ähnlich 8 bei älteren Menschen beobachtet diese. Zusätzlich zu diesen anatomischen Unterschiede, Funktionsmechanismen Regulieren kontraktilen unterscheiden zwischen pial Arterien und Arteriolen Parenchym. Myogenen Vasokonstriktion größer in parenchymalen Arteriolen 9, möglicherweise wegen des Mangels an extrinsischen Innervation 10, verschiedene Arten der Mechanotransduktion 11 und Unterschieden in der intrazellulären Ca 2+ 12,13 in vaskulären glatten Muskelzellen signalisiert. Hinweise darauf, dass Endothel-abhängige gefäßerweiternde Mechanismen unterscheiden sich auch zwischen diesen Vascular Segmente mit einem stärkeren Vertrauen auf Mechanismen aufweisen parenchymal Arterien beteiligt Ca 2+ -aktivierten K + -Kanäle und elektrotonische Kommunikation innerhalb der Gefäßwand im Vergleich zu diffusionsfähig Faktoren wie Stickoxid und Prostazykline 14. Daher gesammelten Daten in Experimenten pialen Arterien verwendet, kann nicht unbedingt gelten Arteriolen parenchymal, eine Lücke in unserem Wissen über die lokalen Kontrolle der zerebralen Perfusion zu verlassen. Trotz ihrer Bedeutung sind parenchymal Arteriolen in beträchtlichem Ausmaß untersuchtes, in erster Linie aufgrund der technischen Herausforderungen , mit Isolierung und Montage für Ex - vivo - Studie. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und zerebrale parenchymale Arteriolen kanülieren, die für Druck Myographie verwendet werden kann oder das Gewebe für Immunomarkierung, Elektrophysiologie, Molekularbiologie, und biochemische Analyse zu isolieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit</stark></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Isolation/Kanülierung</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Superfeine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &mu; l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Steriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dunkelgrünes Nylongewinde</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Einzelgefäß-Kammer-Lebendsysteme</td><td> Instrumentierung</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Druckservoregler mit Schlauchpumpe</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vierkanal-Recorder mit LabScribe 3 Aufzeichnungs- und Analysesoftware</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heizeinheit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kanülierung von cerebral parenchymale arteriolen

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intrazerebrale parenchymal Arteriolen (PAs), die parenchymal Arteriolen umfassen, eindringende Arteriolen und präkapillaren Arteriolen, sind hohe Beständigkeit Blutgefäße aus pialen Arterien und Arteriolen und tauchen in das Hirnparenchym Verzweigung. Einzelne PA einen diskreten zylindrischen Gebiet des Parenchyms perfuse und die Neuronen darin enthaltenen. Diese Arteriolen sind ein zentraler Akteur in der Regulation des zerebralen Blutflusses global beide (zerebrovaskuläre Autoregulation) und lokal (funktionelle Hyperämie). PAs sind Teil der neurovaskuläre Einheit, eine Struktur, die innerhalb des Gehirns regionalen Blutfluss zu Stoffwechselaktivität entspricht, und umfasst auch Neuronen, Inter und Astrozyten. Perfusion durch PAs ist mit der Aktivität von Neuronen in diesem bestimmten Gebiet und steigt in neuronalen Metabolismus führen zu einer Vermehrung der lokalen Perfusion verursacht durch Dilatation des Zuführungs PA verknüpft. Verordnung von PAs unterscheidet sich von der besser charakterisiertepialen Arterien. Druck-induzierte Vasokonstriktion größer in PAs und gefäßerweiternde Mechanismen variieren. Darüber hinaus erhalte PAs nicht extrinsische Innervation von perivaskulären Nerven - Innervation ist intrinsische und indirekt in der Natur durch den Kontakt mit astrozytären Endfüßen. So Regelung in Bezug auf Datenkontraktions durch Studien angehäuft pialen Arterien mit übersetzt nicht direkt an Funktion PA zu verstehen. Weiterhin bleibt es unbestimmt, wie pathologische Zustände, wie Bluthochdruck und Diabetes, PA Struktur und Reaktivität beeinflussen. Diese Wissenslücke ist eine Folge der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit PA Isolierung und Kanülierung teilweise. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung und Kanülierung Nagetier PAs. Weiterhin zeigen wir Beispiele von Experimenten, die mit diesen Arteriolen durchgeführt werden kann, einschließlich Agonisten induzierte Konstriktion und myogenen Reaktivität. Obwohl der Schwerpunkt dieses Manuskript auf PA Kanülierung und Druck Myographie ist, isoliert PAs kann auch für die biochemische, biophysikalische, molekularen und Imaging-Studien verwendet werden.

5A zeigt eine repräsentative Verengung der Maus PAs auf 60 mM KCl aCSF die Integrität der Zubereitung zu bewerten. 30% in Gegenwart von 60 mM KCl - PAs sollte zwischen 15 verengen. Wenn die Verengung unter 15%, entsorgen Sie die PA und ein anderes kanülieren, wie es legt nahe, dass die Arteriolen bei der Isolierung und Kanülierung beschädigt wurde. 5B stellt PA Verengung Konzentrationen des Th...

Dieses Manuskript beschreibt ein einfaches und reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von intrazerebralen Arteriolen (eine Gruppe von Blutgefäßen, die parenchymale Arteriolen, penetrierende Arteriolen und präkapilläre Arteriolen umfasst) aus Mäusen, die in Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekularen Studien verwendet werden sollen.

Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zerebrale Arteriolen zu isolieren und für Untersuchungen der Gefäßfunktion und -struktur mittels Druck-Myographie vorzubereiten. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der zerebrovaskulären Forschung zu beantworten, beispielsweise, wie sich das zerebrale Mikrogefäßsystem schnell an Veränderungen des intraluminalen Drucks oder des Nährstoffbedarfs oder bei pathologischen Bedingungen anpasst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zusätzlich zum intraluminalen Druck eine Überdruckbeaufschlagung der Arteriole ermöglicht, was wichtige physiologische Bestimmungsfaktoren der Gefäßfunktion darstellen. Beginnen Sie damit, mithilfe eines Mikropipettenzuggeräts mit den entsprechenden Einstellungen, wie hier aufgeführt, Kapillaren zu ziehen, um Kanülen herzustellen. Setzen Sie eine Kanüle in den Halter einer Myographiekammer ein, richten Sie sie aus und brechen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer Pinzette die Spitze auf den gewünschten Durchmesser, beispielsweise 10 Mikrometer, wie hier gezeigt. Füllen Sie beide Kanülen mit Zerebrospinalflüssigkeit oder aCSF, das 1,8 Millimolar

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Rennert, R. C., et al. Umfassende endovaskuläre und offene chirurgische Behandlung von zerebralen arteriovenösen Malformationen.  J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video zeigt die offene chirurgische Resektion einer zerebralen arteriovenösen Malformation (AVM) im menschlichen Gehirn. Der Eingriff umfasst die Schaffung eines Knochenlappens, den Zugang zum Subarachnoidalraum, die Identifizierung und den Verschluss von Speisearterien und Drainagevenen sowie die vorsichtige Entfernung der AVM. Die...

Offene chirurgische Resektion zerebraler arteriovenöser Malformationen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung der Endothelröhren aus dem Hirnparenchym der Maus. Durch eine Kombination aus enzymatischem Verdau und mechanischer Dissoziation entsteht eine intakte Röhre mit Endothelzellen.

Präparation von zerebralen Endotheltuben aus parenchymalen Arteriolen der Maus

Quelle: Larpthaveesarp, A., et. al. Transientes Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie des neonatalen Schlaganfalls bei P10-Ratten. J. Vis. exp. (2017)Dieses Video zeigt die Etablierung des Modells des Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen. Die Arteria carotis interna (ICA) wird freigelegt und eine Ligatur wird gesichert, um den Blutfluss zu begrenzen. Durch die ICA wird ein Verschluss eingeführt, um die Arteria cebraralis media zu erreichen. Der Welpe darf...

Erzeugung eines Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen zur Induktion einer lokalen Hirnischämie

Wir beschreiben eine sehr reproduzierbare Methode zur dauerhaften Verschluss von einem Nagetier großen zerebralen Blutgefäßen. Diese Technik kann mit sehr wenig peripheren Schäden, minimale Blutverlust, eine hohe Rate der langfristigen Überleben und konsistente Infarktvolumen Einklang mit der menschlichen klinischen Bevölkerung erreicht werden.

Permanent Cerebral Gefäßverschluss<em&gt; Über</em&gt; Double Blattschraube und Durchtrennung

Chirurgie ist der Goldstandard für zugänglich Arteriovenious Fehlbildungen (AVMD) und präoperative Embolisation kann dieses Verfahren zu vereinfachen. Wir beschreiben unser Ansatz für inszenierte endovaskuläre Embolisation und offene Resektion der AVMD und bieten ein repräsentatives klinischen Beispiel Hervorhebung der Vorteile des Chirurges umfassend ausgebildeten neurovaskuläre führt ein multidisziplinäres Team klinische .

Umfassende endovaskuläre und offene chirurgische Behandlung der zerebralen arteriovenösen Malformationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Protokoll für die Isolierung von Arteriolen von der Netzhaut der Ratte, die in elektrophysiologische, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien verwendet werden können.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Das vorliegende Manuskript beschreibt, wie Hippocampus-Arteriolen und Kapillaren aus dem Maushirn isoliert werden können und wie man sie für Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekulare Studien unter Druck setzt.

Ex Vivo Druck hippocampal Kapillare-Parenchymale Arteriole Vorbereitung für die funktionelle Studie

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für Forscher dar, um den Verschluss der mittleren Hirnarterie an Mäusen mit der modifizierten Longa-Methode der Arteria carotis externa durchzuführen. Die in diesem Artikel vorgestellten Modifikationen zielen darauf ab, die Genauigkeit des Verschlusses der mittleren Hirnarterie zu erhöhen und eine vollständige Reperfusion zu gewährleisten.

Optimierung der Methode des Verschlusses der Arteria cerebralis longa für eine vollständige Reperfusion

Lernen Sie die Isolierung und Kanülierung von zerebralen Parenchymarteriolen aus Mäusegehirnen für Druckmyographie-Studien. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung vaskulärer Funktion und Struktur unter physiologischen Bedingungen.

Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen

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