Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, retrovirale Integrationsstellen aus genomischer Massen-DNA PCR-zu amplifizieren und die resultierende DNA-Bibliothek so zu sequenzieren, dass genaue Integrationsstellen auf ein Referenzgenom abgebildet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der grundlegenden und klinischen Retrovirologie zu beantworten, indem sie die Verteilung der Integrationsstellen im gesamten Wirtsgenom analysiert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die DNA-Sequenzierungstiefe und die Tatsache, dass viele Proben in einem Sequenzierungslauf gemultiplext werden können.

Einen Tag vor der Transfektion wird 3,3 mal 10 bis sechste HEK293T Zellen in 10 Milliliter supplementiertes Dulbecco's Modified Eagle's Medium in jede der fünf 100-Millimeter-Schalen gegeben. Am nächsten Tag verwenden Sie kommerziell erhältliche Transfektionsreagenzien oder Calciumphosphat, um die Zellen mit 10 Mikrogramm Plasmid zu transfizieren, das retrovirale molekulare Klone in voller Länge trägt, oder neun Mikrogramm umhüllter, elidierter einrunder Vektoren plus einem Mikrogramm eines VSV-G-Expressionskonstrukts. Geben Sie die Mischung tropfenweise zu den Zellmedien.

Nach der Transfektion inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach ca. 48 Stunden wird das virushaltige Zellmedium mit einer volumetrischen Pipette geerntet und durch Schwerkraft durch einen 0,45-Mikron-Filter geleitet. Als nächstes wird das Virus durch Ultrazentrifugation bei 200.000 g für eine Stunde bei vier Grad Celsius konzentriert.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, bis etwa 500 Mikroliter DMEM FPS übrig sind, und resuspendieren Sie das Viruspellet. Fügen Sie 20 Einheiten DNase hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bestimmen Sie die p24-Konzentration mit einem HIV-1 p24-Antigen-Capture-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Am Tag vor der Infektion 3,0 mal 10 bis fünfte HEK293T Zellen in 2,5 Milliliter DMEM FPS pro Vertiefung in eine Sechs-Well-Platte einfüllen und über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Infizieren Sie die Zellen mit einer viralen p24-Endkonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter in 500 Mikrolitern frischem DMEM FPS. Zwei Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.

Geben Sie nach zwei Stunden zwei Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes DMEM FPS in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. 48 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Ernten Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, und inspizieren Sie nach einigen Sekunden die Vertiefungen visuell auf Zellverdrängung.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM FPS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer volumetrischen Pipette 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Die Lösung wird in einen 75 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben mit 18 Millilitern vorgewärmtem FPS überführt und in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt. Ernten Sie die Zellen mindestens fünf Tage nach der Infektion wie zuvor und resuspendieren Sie sie in fünf Millilitern vorgewärmtem DMEM FPS durch Pipettieren.

Die Lösung wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.500 G zentrifugiert, dann aspiriert und der Überstand verworfen. Extrahieren Sie schließlich genomische DNA aus dem Zellpellet mit einem im Handel erhältlichen Kit. Eluieren Sie die DNA aus der mitgelieferten Ionenaustauschersäule mit 200 Mikrolitern millimolaren Tris-HCL bei pH 8,5.

Nach der Beschallung der genomischen DNA wird die beschallte DNA mit einem PCR-Aufreinigungskit aufgereinigt. Reparieren Sie als Nächstes die DNA mit einem Endreparaturset. Nach der Aufreinigung der DNA wie zuvor wird die DNA mit dem Exo-Minus-Enzym Klenow entgiftet.

Alternativ kann für die Fragmentierung durch Restriktions-Endonuklease-Verdau genomische DNA mit einem Cocktail von Enzymen geschnitten werden, die 5'TA-Überhänge erzeugen, sowie mit einem inkompatiblen Enzym wie BglII, das stromabwärts des stromaufwärts gelegenen viralen LTR spaltet. Schneiden Sie 10 Mikrogramm genomische DNA in ein Endvolumen von 100 Mikrolitern. Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Stellen Sie sicher, dass die endgültige DNA mit dem PCR-Aufreinigungskit gereinigt wird. Der Linker, der mit beschallter DNA verwendet werden soll, muss einen kompatiblen T-3'-Überhang enthalten, während der Linker für MseI-verdaute DNA einen kompatiblen 5'TA-Überhang enthalten muss. Beginnen Sie mit dem Glühen von 10 Mikromolaren der kurzen und langen Linkerstränge in 35 Mikrolitern Tris-HCL EDTA-Puffer, indem Sie auf 90 Grad Celsius erhitzen und langsam in Schritten von einem Grad Celsius pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen.

Als nächstes bereiten Sie mindestens vier parallele Ligationsreaktionen pro genomischer DNA-Probe vor, die 1,5 mikromolare ligierte Linker, ein Mikrogramm fragmentierte DNA und 800 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern enthält. Ligate über Nacht bei 12 Grad Celsius. Bei Proben, die durch Ultraschall hergestellt wurden, verdauen Sie die gereinigte Ligationsreaktion mit einem Restriktionsenzym, das stromabwärts der vorgeschalteten LTR spaltet.

Verwenden Sie 100 Einheiten des entsprechenden Enzyms unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen über Nacht. Stellen Sie sicher, dass die Endprodukte mit einem PCR-Aufreinigungskit gereinigt werden. Bereiten Sie die PCRs der ersten Runde mit den hier gezeigten Reagenzien vor.

Führen Sie die PCR der ersten Runde mit den folgenden Parametern durch: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 30 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden, 68 Grad Celsius für 45 Sekunden. Mit 68 Grad Celsius für 10 Minuten abschließen. Bündeln Sie die Reaktionen der ersten Runde und reinigen Sie die DNA wie zuvor.

Bereiten Sie dann die PCRs der zweiten Runde vor, die die hier gezeigten Reagenzien enthalten. Verwenden Sie die gleichen Zyklusparameter wie bei der PCR der ersten Runde. Führen Sie nach dem Poolen und Aufreinigen der DNA aus der zweiten Reaktionsrunde eine Qualitätskontrolle und eine Sequenzierung der nächsten Generation durch und analysieren Sie die Integrationsstellen anhand der detaillierten Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls.

Integrationsstellen aus Bibliotheken, die durch Verdau mit Restriktionsenzymen, wie links gezeigt, oder Beschallung, wie rechts gezeigt, hergestellt wurden, wurden mit Hilfe von Weblogo-Software ausgerichtet. Jede Verdünnung in der Titrationsreihe ist dargestellt, von der reinen DNA am oberen Rand der Abbildung bis zur maximalen Verdünnung von eins bis 15.625 am unteren Rand. Der Grad der Sicherheit nimmt mit zunehmender Verdünnung der infizierten Zell-DNA ab.

Dieses Bild zeigt das Sequenzlogo für die übereinstimmende Zufallskontrolle von 50.000 einzigartigen genomischen Stellen. Beachten Sie, dass die zufälligen Standorte, die aus dem MRC-Datensatz abgeglichen wurden, im Gegensatz dazu keine nennenswerten Basispräferenzen generierten. Nach der Beherrschung können Integration-Site-Bibliotheken innerhalb von drei Tagen aus genomischer DNA erstellt werden.

Das Mapping der Integrationsstelle, von der Erstinfektion bis zur abgeschlossenen Bioinformatik, kann daher in etwa zwei Wochen abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können Tausende oder sogar Millionen von einzigartigen retroviralen Integrationsstellen katalogisiert und verschiedene Analysen durchgeführt werden, um Assoziationen zwischen Insertionsstellen und genomischen Annotationen zu quantifizieren.