Name: Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie retrovirale Integrationsstellen aus genomischer DNA amplifizieren und mittels Next-Generation-Sequenzierung kartieren. Diese bioinformatische Methode ermöglicht die präzise Analyse viraler Integrationen im Wirtsgenom.

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Wir danken unseren Kollegen Stephen Hughes und Henry Levin für Ratschläge, die kritisch war die NGS-Protokoll für retrovirale Integrationsstelle Sequenzierung im Engelman Labor zu etablieren. Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health gewährt AI039394 und AI052014 (bis ANE) und AI060354 (Harvard University Center for AIDS Research) unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein Protokoll für die Analyse der retroviralen Integrationsstellen von der ersten Virusinfektionsschritt durch Kartierung von genomischen Verteilungsmuster, beschrieben. Dieses Protokoll ist anwendbar auf jeden beliebigen Retrovirus und infizierbare Zelltyp. Darüber hinaus ist der Test sehr empfindlich Pipeline, mit dem Potential , eine zufriedenstellende Anzahl von einzigartigen Integrationsstellen von seriellen Verdünnungen der genomischen DNA äquivalent zu einer Infektion mit einer MOI von 6,4 x 10 -5 init...

Integration von viraler DNA (vDNA) in das Wirtszellgenom ist ein wesentlicher Schritt in dem retroviralen Lebenszyklus. Die Integration wird durch das virale Enzym Integrase (IN) erreicht, die zwei verschiedene katalytische Prozesse ausführt, die 1 bis zur Gründung des stabil eingeführt Provirus führen. IN - Untereinheiten greifen in die Enden der linearen vDNA , die durch reverse Transkription erzeugt wird, die höhere Ordnung intasome mit vDNA bilden Enden zusammengehalten von einem IN Multimer 2-4. IN spaltet die 3&#39; - stromabwärts gelegenen Enden der vDNA aus invariant 5&#39;-CA-3&#39; - Sequenzen in einem Verfahren , wie 3&#39;-Verarbeitung bekannt, so dass an jedem Terminus vDNA 5-8 mit reaktiven Hydroxylgruppen 3&#39; - Enden ausgespart. Die intasome wird anschließend in den Zellkern als Teil einer großen Anordnung von Host importiert und viralen Proteinen als preintegration Komplexes (PIC) bekannt 9-11. zelluläre Ziel-DNA (tDNA) Nach der Begegnung, verwendet in der vDNA 3&#39;-Hydroxyl groups die tDNA oberen und unteren Stränge in versetzter Weise zu spalten und Phosphatgruppen &#39;die vDNA zu tDNA 5 schließt sich gleichzeitig durch den Prozess der Strangtransfer 12,13. Retroviren zeigen Integration Präferenzen auf dem lokalen und globalen Maßstab. Auf lokaler Ebene bestehen Integrationsstellen Konsens von schwach konserviert Palindrom tDNA - Sequenzen, die von den vDNA Insertionsstellen 14,15 von etwa fünf Minuten vor zehn bp stromaufwärts und stromabwärts erstrecken. Weltweit 16 Retroviren zielen auf spezielle Chromatin Anmerkungen. Es gibt sieben verschiedene retrovirale Gattungen - alpha durch epsilon, lenti und spuma. Die Lentiviren, darunter HIV-1, begünstigen die Integration in den Körpern der aktiv transkribierten Gene 17, während die gammaretroviruses bevorzugt in Websites Transkriptionsstart integrieren (TSS) und aktive Enhancer - Regionen 18-20. In scharfem Gegensatz dazu wird Spumavirus stark in Richtung heterochrom voreingenommenatic Regionen, wie zum Beispiel Gen-armen Lamina-assoziierte Domänen 21. Lokale tDNA Grundeinstellungen sind zu einem großen Teil diktiert durch spezifische Netze von Nukleoprotein Kontakte zwischen IN und tDNA 13,22,23. Für die Lentiviren und gammaretroviruses, Integration in Bezug auf genomische Annotationen ist zum großen Teil bestimmt durch Wechselwirkungen zwischen IN und verwandten zellulären Faktoren 24-27. Eine Änderung , die Besonderheiten der IN-tDNA Interaktion Netzwerk 13,22,23,28 und stören oder Re-Engineering IN-Host - Faktoren - Wechselwirkungen 25-27,29-32 Strategien sind nachweislich Integration auf lokaler und globaler Ebene retargeten sind. Die Macht der DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet retroviralen Integrationsstellen zum Katalog immens in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Integrationsstellen wurden in Pionierarbeit mit aufwendige Reinigung und manuelle Klonen Techniken gewonnen nur eine Handvoll von einzigartigen Websites pro Studie 33,34 zu ergeben.Die Kombination von LM-PCR - Amplifikation von LTR-Wirt - DNA Junctions mit der Fähigkeit, individuelle Integrationsstellen zu kartieren Mensch und Maus Entwurf das Feld transformiert Genomen, wobei die Anzahl der Seiten von exogenen Gewebekulturzellinfektionen zu mehreren hundert bis tausend 17 zunehmenden gewonnen , 18. Die jüngere Kombination von LM-PCR mit NGS Methodik Bibliothek Tiefe explodierenden gesendet. Im Einzelnen ergab Pyrosequenzierung in der Größenordnung von Zehntausenden von einzigartigen Integrationsstellen 30,35-38, während Bibliotheken durch die Verwendung von DNA - Clustering sequenziert können 19-21,39 Millionen von Sequenzen ergeben. Hier beschreiben wir eine optimierte LM-PCR-Protokoll zur Amplifikation und Sequenzierung von retroviralen Integrationsstellen DNA-Clustering NGS verwenden. Das Verfahren beinhaltet erforderliche Adaptersequenzen in die PCR-Primer und damit direkt in die amplifizierte DNA-Moleküle, wodurch ausgeschlossen ist die Voraussetzung für eine zusätzliche Adaptorligation Schritt vor der Sequencing 40. Die bioinformatische Analyse-Pipeline, von der Analyse der rohen Sequenzdaten für LTR-Wirts-DNA-Kreuzungen zur Kartierung der einzigartigen Integrationsstellen genomische Funktionen relevant, ist auch allgemein beschrieben. In Übereinstimmung mit der Priorität aus früheren methodologischen Protokolle auf diesem Gebiet etabliert 36,38,41-43 können benutzerdefinierte Skripts die Fertigstellung der einzelnen Schritte in der Bioinformatik Pipeline zur Unterstützung entwickelt werden. Die Nützlichkeit und die Empfindlichkeit des Protokolls wird durch Amplifizieren Sequenzierung mit repräsentativen Daten veranschaulicht, und Abbilden HIV-1 Integrationsstellen von Gewebekulturzellen in der ungefähren Multiplizität der Infektion (MOI) von 1,0 infiziert sind, sowie eine Titrationsreihe dieser DNA DNA nicht infizierte Zell Schritte in verdünnten bis 5-fach zu einer maximalen Verdünnung von 1: 15.625 die ungefähre äquivalente MOI von 6,4 x 10 -5 zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standard-Zellkulturmedium, kompatibel mit HEK293T Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Verschiedene Chargen von Serum müssen möglicherweise für eine optimale Virusproduktion vorgescreent werden</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotika, die der</td>DMEM-Phosphat-gepufferten</tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>zugesetzt werden sollen Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Zur Reinigung von Zellen</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Zur Ablösung adhärenter Zellen von Gewebekulturplatten</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td> SL100688 <td>DNA-Transfektionsreagenz</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &; Mikro; m Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Zur Filterung von Viruspartikel-haltigen Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Zur Degradierung von Plasmid-DNA aus Virusstämmen</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Wird zur Quantifizierung der Ausbeute der Virusproduktion</td></tr><tr><td>verwendet DNeasy Blood & Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Zur Aufreinigung genomischer DNA aus Zellen</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Mit diesem Modell des Ultraschallgeräts führen Sie zwei Zyklen mit einem Tastverhältnis von 5 % durch, Intensität von 3 Zyklen pro Stoß von 200 Zyklen und Zeit von 80 Sekunden</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td> Es <td>wird empfohlen, dass im Handel erhältliches Wasser verwendet wird, um die Möglichkeit einer Kreuzkontamination der Probe zu verringern</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR-Aufreinigung Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Wird zur Aufreinigung von DNA während des Bibliotheksaufbaus</td></tr><tr><td>verwendet End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Wird zur Reparatur von DNA-Enden von beschallten DNA-Proben</td></tr><tr><td>verwendet Klenow-Fragment (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Wird mit dATP bis A-Schwanz reparierten DNA-Fragmenten</td></tr><tr><td>verwendet dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Desoxyadenosintriphosphat</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Restriktionsendonuklease für die genomische DNA-Spaltung</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Restriktionsendonuklease zur Unterdrückung der Amplifikation der vorgelagerten HIV-1 U5-Sequenz</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzym für das kovalente Fügen kompatibler DNA-Enden</td></tr><tr><td>DNA-Oligonukleotide</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>nach Maß</td><td>Lassen Sie das Unternehmen die Oligos aufreinigen. HPLC-Aufreinigung reicht für DNAs aus < 30 Nukleotide; PAGE reinigt längere DNAs&nbsp;</td></tr><tr><td>Vorteil 2 Polymerase-Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Kommerzieller Mix mit DNA-Polymerase für</td></tr><tr><td>PCR-dNTPs (100 mM-Lösungen)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Verdünnen Sie die vier Chemikalien auf Eis mit sterilem Wasser, um die störenden Zwischenkonzentrationen von jeweils 2,5 mM zu erreichen dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spektralphotometer zur Bestimmung der DNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>Fluorometer zur Bestätigung der DNA-Konzentration in der Bibliothek der Integrationsstelle</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Tape-basierter Assay zur Bestätigung der Größenverteilung der DNA-Bibliothek an der Integrationsstelle</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Wird für NGS</td></tr></tbody></table> verwendet

amplification, next-generation-sequenzierung und genomischer dna mapping von retrovirale integration seiten

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviren zeigen Unterschrift Integration Präferenzen auf beiden lokaler und globaler Ebene. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für (1) Erzeugung verschiedener Bibliotheken von retroviralen Integrationsstellen mit ligationsvermittelte PCR (LM-PCR) und Next-Generation-Sequencing (NGS), (2) die Abbildung der genomischen Ort jedes Virus- Host-Junction mit bedtools, und (3) die Daten für statistische Relevanz zu analysieren. Genomische DNA aus infizierten Zellen extrahiert wird durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch Beschallung fragmentiert. Nach geeigneter DNA end-Reparatur werden doppelsträngigen Linker ligiert an die DNA-Enden, und semi-nested PCR wird unter Verwendung der Primer komplementär zu sowohl der langen terminalen Wiederholung (LTR) Ende des Virus und dem ligierten Linker-DNA durchgeführt. Die PCR-Primer tragen Sequenzen für DNA clustering während NGS erforderlich ist, das Erfordernis für separate Adaptorligation negieren. Qualitätskontrolle (QC) wird durchgeführt, um DNA-Fragment Größenverteilung zu bewerten und anzupassener DNA-Einbau vor NGS. Sequence-Ausgabedateien werden gefiltert für LTR-haltigen liest, und die Sequenzen der LTR und den Linker definieren, werden abgeschnitten entfernt. Getrimmten Wirtszellsequenzen sind mit einem Bezugsgenom kartiert BLAT verwenden und für minimal 97% Identität zu einem eindeutigen Punkt in dem Referenzgenom filtriert. Einzigartige Integrationsstellen sind für benachbarte Nukleotid (nt) Sequenz und Verteilung in Bezug auf verschiedene genomische Merkmale geprüft. Unter Verwendung dieses Protokolls, Integrationsort Bibliotheken von hoher Komplexität kann von genomischer DNA in drei Tagen konstruiert werden. Das gesamte Protokoll, das exogene virale Infektion von empfänglichen Gewebekulturzellen zur Integrationsstelle umfasst Analyse kann somit in etwa ein bis zwei Wochen durchgeführt werden. Neue Anwendungen dieser Technologie beziehen sich auf Langzeitanalyse von Integrationsstellen von HIV-infizierten Patienten.

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments , die Empfindlichkeit von NGS zu veranschaulichen für die Integrationsstellen von einer Kultur von infizierten Zellen gewonnen wird . Nicht infizierte Zell - DNA wurde in dem im Durchschnitt jede Zelle eine Integration 40 enthaltene genomische DNA von einer Infektion zu seriell verdünnt verwendet. 15.625: Verdünnungen wurden in Schritten von fünf zu einer maximalen Verdünnung von 1 hergestellt. G...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Retrovirus-Integrationsstellen aus genomischer Gesamt-DNA mittels PCR zu amplifizieren und die resultierende DNA-Bibliothek zu sequenzieren, sodass die genauen Integrationspositionen einer Referenzsequenz zugeordnet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der grundlegenden und klinischen Retrovirologie zu beantworten, indem die Verteilung der Integrationsstellen im gesamten Wirtsgenom analysiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Tiefe der DNA-Sequenzierung sowie darin, dass viele Proben in einem einzigen Sequenzierdurchlauf multiplexiert werden können.Einen Tag vor der Transfektion 3,3 × 10⁶ HEK293T-Zellen in jeweils 10 ml supplementiertem Dulbecco's Modified Eagle's Medium in fünf 100-mm-Platten ansäen. Am nächsten Tag die Zellen mit 10 µg Plasmid, das vollständige retrovirale molekulare Klone trägt, oder mit 9 µg umhüllten, verkürzten Einzelrundvektoren zusammen mit 1 µg eines VSV-G-Expressionskonstrukts, mittels handelsüblicher Transfektionsreagenzien oder Calciumphosphat transfizieren. Die Mischung tropfenweise dem Zellkulturmedium hinzufügen.Nach der Transfektion die Zellen in einem befe

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Forschung

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Biology

Biologie

Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren...

Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

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Erfahren Sie, wie Sie retrovirale Integrationsstellen aus genomischer DNA amplifizieren und mittels Next-Generation-Sequenzierung kartieren. Diese bioinformatische Methode ermöglicht die präzise Analyse viraler Integrationen im Wirtsgenom.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

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