Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Retrovirus-Integrationsstellen aus genomischer Gesamt-DNA mittels PCR zu amplifizieren und die resultierende DNA-Bibliothek zu sequenzieren, sodass die genauen Integrationspositionen einer Referenzsequenz zugeordnet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der grundlegenden und klinischen Retrovirologie zu beantworten, indem die Verteilung der Integrationsstellen im gesamten Wirtsgenom analysiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Tiefe der DNA-Sequenzierung sowie darin, dass viele Proben in einem einzigen Sequenzierdurchlauf multiplexiert werden können.

Einen Tag vor der Transfektion 3,3 × 10⁶ HEK293T-Zellen in jeweils 10 ml supplementiertem Dulbecco's Modified Eagle's Medium in fünf 100-mm-Platten ansäen. Am nächsten Tag die Zellen mit 10 µg Plasmid, das vollständige retrovirale molekulare Klone trägt, oder mit 9 µg umhüllten, verkürzten Einzelrundvektoren zusammen mit 1 µg eines VSV-G-Expressionskonstrukts, mittels handelsüblicher Transfektionsreagenzien oder Calciumphosphat transfizieren. Die Mischung tropfenweise dem Zellkulturmedium hinzufügen.

Nach der Transfektion die Zellen in einem befeuchteten Zellkulturschrank bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach etwa 48 Stunden das virushaltige Zellkulturmedium mit einer Vollpipette gewinnen und durch einen 0,45-Mikron-Filter per Schwerkraftfiltration leiten. Anschließend das Virus durch Ultrazentrifugation bei 200.000 × g für eine Stunde bei vier Grad Celsius konzentrieren.

Nach der Zentrifugation das Überstand bis auf etwa 500 Mikroliter DMEM FPS entfernen und das Virus-Pellet resuspendieren. 20 Einheiten DNase hinzufügen und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die p24-Konzentration mit einem HIV-1-p24-Antigen-Capture-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmen.

Am Tag vor der Infektion 3,0 × 10⁵ HEK293T-Zellen pro Vertiefung in 2,5 mL DMEM FPS in einer 6-Loch-Platte ansäen und über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren. Die Zellen mit einer endgültigen viralen p24-Konzentration von 500 ng/mL in 500 µL frischem DMEM FPS infizieren. Zwei Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren.

Nach zwei Stunden zwei Milliliter DMEM FPS, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurden, in jede Vertiefung geben und die Platte in den Inkubator zurückstellen. 48 Stunden nach der Infektion das Medium entfernen und die Zellen mit zwei Millilitern phosphatgepufferter Salzlösung waschen. Die Zellen durch Zugabe von 0,5 Millilitern Trypsin-EDTA, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, ablösen und nach einigen Sekunden die Vertiefungen visuell auf Zellablösung überprüfen.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM FPS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie sie vorsichtig zehnmal mit einer Vollpipette auf- und abpipettieren. Überführen Sie die Lösung in einen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturgefäß, der 18 Milliliter vorgewärmtes DMEM FPS enthält, und stellen Sie ihn zurück in den Zellkultur-Inkubator. Mindestens fünf Tage nach der Infektion ernten Sie die Zellen wie zuvor und resuspendieren sie durch Pipettieren in fünf Milliliter vorgewärmtem DMEM FPS.

Zentrifugieren Sie die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 2.500 G, anschließend saugen und verwerfen Sie den Überstand. Extrahieren Sie abschließend genomische DNA aus dem Zellpellet mithilfe eines im Handel erhältlichen Kits. Eluieren Sie die DNA aus der beigefügten Ionenaustauschsäule mit 200 Mikrolitern millimolarer Tris-HCl bei pH 8,5.

Nach der Sonifikation der genomischen DNA reinigen Sie die sonifizierte DNA mithilfe eines PCR-Reinigungskits. Anschließend reparieren Sie die DNA mit einem Endreparaturkit. Nach erneuter Reinigung der DNA wie zuvor, fügen Sie mittels des Klenow-Exo-Minus-Enzyms einen A-Schwanz an die DNA an.

Alternativ zur Fragmentierung durch Restriktionsendonukleaseverdauung genomische DNA mit einem Enzymgemisch schneiden, das 5'TA-Überhänge erzeugt, sowie mit einem inkompatiblen Enzym wie BglII, das stromabwärts von dem stromauf gelegenen viralen LTR schneidet. 10 Mikrogramm genomische DNA in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern schneiden. Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Stellen Sie sicher, dass die endgültige DNA mit dem PCR-Reinigungskit aufgereinigt wird. Der mit sonifizierter DNA verwendete Linker muss einen kompatiblen T-Überstand an der 3'-Ende enthalten, während der Linker für mit MseI geschnittene DNA einen kompatiblen 5'-TA-Überstand enthalten muss. Beginnen Sie damit, 10 Mikromolar der kurzen und langen Linkerstränge in 35 Mikroliter Tris-HCl-EDTA-Puffer zu hybridisieren, indem Sie den Ansatz auf 90 Grad Celsius erhitzen und dann schrittweise um ein Grad Celsius pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Bereiten Sie anschließend pro genomischer DNA-Probe mindestens vier parallele Ligationsreaktionen vor, die 1,5 µM ligierten Linker, ein Mikrogramm fragmentierte DNA und 800 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 50 µL enthalten. Führen Sie die Ligation über Nacht bei 12 °C durch. Bei Proben, die durch Sonifikation hergestellt wurden, verdauen Sie die gereinigte Ligationsreaktion mit einem Restriktionsenzym, das stromabwärts vom upstream gelegenen LTR schneidet.

Verwenden Sie 100 Einheiten des geeigneten Enzyms unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen über Nacht. Stellen Sie sicher, dass die Endprodukte mithilfe eines PCR-Reinigungs-Kits gereinigt werden. Bereiten Sie die PCR der ersten Runde mit den hier gezeigten Reagenzien vor.

Führen Sie die PCR der ersten Runde mit den folgenden Parametern durch: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 30 Zyklen mit jeweils 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und 68 Grad Celsius für 45 Sekunden. Schließen Sie mit 68 Grad Celsius für 10 Minuten ab. Poolsen Sie die Reaktionen der ersten Runde und reinigen Sie die DNA wie zuvor.

Bereiten Sie anschließend die PCR der zweiten Runde mit den hier gezeigten Reagenzien vor. Verwenden Sie dieselben Zyklenparameter wie für die PCR der ersten Runde. Führen Sie nach dem Zusammenführen und Reinigen der DNA aus der Reaktion der zweiten Runde eine Qualitätskontrolle sowie eine Sequenzierung der nächsten Generation durch, und analysieren Sie die Integrationsstellen gemäß den detaillierten Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls.

Integrationsstellen aus Bibliotheken, die durch Verdau mit Restriktionsenzymen (links gezeigt) oder durch Sonifikation (rechts gezeigt) hergestellt wurden, wurden mithilfe von Web-Logo-Software ausgerichtet. Jede Verdünnung in der Titrationsserie ist dargestellt, beginnend mit unverdünnter DNA am oberen Rand der Abbildung bis hin zur maximalen Verdünnung von 1 zu 15.625 am unteren Rand. Das Maß an Sicherheit nimmt mit zunehmender Verdünnung der DNA infizierter Zellen ab.

Dieses Bild zeigt das Sequenzlogo für die abgeglichene zufällige Kontrolle von 50.000 eindeutigen genomischen Stellen. Beachten Sie, dass die zufälligen Stellen aus dem MRC-Datensatz im Vergleich dazu keine nennenswerten Niveaus an Basenpräferenzen erzeugten. Sobald die Methode beherrscht ist, können Integrationsstellen-Bibliotheken innerhalb von drei Tagen aus genomischer DNA hergestellt werden.

Die Kartierung der Integrationsstellen kann daher von der anfänglichen Infektion bis zur abgeschlossenen Bioinformatik in etwa zwei Wochen abgeschlossen werden. Mit dieser Methode können Tausende oder sogar Millionen eindeutiger retroviraler Integrationsstellen erfasst und vielfältige Analysen durchgeführt werden, um Assoziationen zwischen Insertionsstellen und genomischen Annotationen zu quantifizieren.