Name: Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in E. coli Für Röntgenkristallographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Lernen Sie die Herstellung und Reinigung des humanen Norovirus-P-Domänen-Proteins in E. coli für Röntgenkristallographie. Diese schnelle Methode liefert hochreines Protein für strukturbiologische Studien.

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Die Finanzierung für diese Studie wurde von der CHS Stiftung bereitgestellt. Wir würdigen die Proteinkristallisationsplattform innerhalb des Exzellenzclusters CellNetworks der Universität Heidelberg für das Kristallscreening und die European Synchrotron Radiation Facility für die Bereitstellung von Synchrotronstrahlungsanlagen.

1. P Domain Cloning <ol><li> Bestimmen Sie die P - Domäne kodierende Region durch Sequenzabgleich von Norovirus - Stämme (zB GII.10 Stamm, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Außerdem entfernen die flexible Region am C-terminalen Ende der P - Domäne (2A). Codonspezifische Optimierung der DNA für E. coli - Expression und umfassen BamHI (N-terminal) und NotI (C-terminal) Restriktionsstellen , um Sub-Klon der P - Domäne kodierende Region in den pMalc2x Expressionsvektor 6,7. Hinweis: Der P-Domäne codierende Region wird optimiert und durch einen kommerziellen Service synthetisiert. Die P-Domäne kodierende Region (Einsatz) beträgt etwa 1 kb in der Länge und in einem Standard-Transfervektor geliefert. </li><li> Digest 2 ug des Transfervektors mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C mit einer vom Hersteller gelieferten Puffer. </li><li> Trennen Sie die verdaute Einsatz auf einem 1% Agarosegelfür 20 min bei 135 V und reinigen die Insert-DNA aus dem Gel unter Verwendung eines kommerziellen Kits. </li><li> Bereiten Sie die pMalc2x Expressionsvektor von 2 ug dieses Vektors Digerieren mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C. Reinige den Vektor aus einem Agarosegel, wie oben beschrieben (1,3). Anmerkung: Beide Proben (1,2 und 1,4) bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Ligieren des gereinigten Inserts in dem verdauten Vektor pMalc2x an den BamHI- und NotI - Restriktionsstellen mit 1 ul T4-DNA - Ligase (400.000 U / ml) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) (2B und 2C). Verwenden Sie mindestens 20 ng des pMalc2x Vektor und einem Vektor: Insert Verhältnis 1: 3 (Molekulargewicht). Die Ligationsmix ist in der Regel ~ 20 &amp; mgr; l. </li><li> Transformieren 2 &amp; mgr; l der Ligationsmischung in 50 &amp; mgr; l chemisch kompetente E. coli DH5a Bakterienzellen ein Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 Sekunden bei 42 ° C) und wachsen in 600 unter Verwendung von&amp; mgr; l SOC-Medium für 1 Stunde bei 37 ° C. Centrifuge die transformierten Zellen für 3 min bei 1000 · g, den Überstand verwerfen und das Pellet in 30 &amp; mgr; l SOC-Medium. <ol><li> Platte der Transformationsmischung auf LB-Agar-Platten, 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion enthält, und wachsen über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie mindestens fünf Kolonien. </li></ol></li><li> Für jede der fünf Kolonien inokulieren 2-3 ml Kultur von LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Ampicillin (LB-amp) und wachsen über Nacht bei 160 rpm bei 37 ° C schüttelnd. </li><li> Extrahieren Sie die Plasmide, die aus der über Nacht Kultur eines kommerziellen Kits verwenden. Überprüfen Sie das Vorhandensein der P-Domäne Einsatz durch Sequenzierung mit einem pMalc2x Forward-Primer (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) und Reverse-Primer (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P Domain Expression <ol><li> Transformieren 1 ul (150 ng / ul - 400 ng / &amp; mgr; l) des pMalc2x Vektors kodierend für das MBP-His-P domainFusionsproteins in 50 ul kompetenten E. coli BL21 Zellen eine Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 sec bei 42 ° C) verwendet und bei 37 ° C für 1 Stunde in 600 &amp; mgr; l SOC - Medium wachsen. Subkultur in 120 ml LB-amp über Nacht bei 160 rpm und 37 ° C. </li><li> Beimpfen von neun Litern (beispielsweise 6 x 5 L Kolben mit 1,5 l Medium jeweils) von LB-amp mit der Subkultur (1: 100). Wachsen die Zellen bei 160 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C schütteln , bis die OD 600 0,4 erreicht - 0,6. Anschließend wird für ca. 1 Stunde die Temperatur auf 22 ° C abzusenken und dann mit 0,66 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 8 , um die Proteinexpression induzieren. Wachsen die Zellen über Nacht bei 22 ° C (~ 18 h). Hinweis: Die Temperatur variiert werden kann, aber wir empfehlen 22 ° C oder weniger zu verwenden. </li><li> Ernte der Zellen durch Zentrifugation (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -20 ° C. </li></ol>1. Reinigungsschritt und Protease - Spaltung <ol><li> Bereiten Puffer, die während der Proteinreinigungsschritte aus Stammlösungen verwendet werden, die Reproduzierbarkeit und die Stabilität der Experimente zu gewährleisten. Bereiten vier verschiedenen Puffern für die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), die jeweils eine andere Konzentration an Imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM und 250 mM). Für die SEC, bereiten Sie einen Gelfiltrationsexperimente Puffer (GFB) mit einer höheren Salzkonzentration, jedoch ohne Imidazol. Verwenden deionisiertem Wasser und filtern alle Puffer vor Verwendung mit einer Porengröße von 0,45 um. Hinweis: Für eine detaillierte Pufferherstellungsschema finden Sie in Tabelle 1. </li><li> Auftauen des Zellpellets aus der neun Liter Kultur und lösen sich bei 4 ° C in 150 ml PBS. Beschallen die Zellsuspension dreimal für 2 min (Leistung 130 W, 20% Amplitude, Impulsfrequenz 50%) der Zellen zu stören. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis während der Beschallung. </li><li> Centrifuge Die beschallte Zellsuspension (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) aus dem Überstand von Zelltrümmern zu trennen exprimierte Protein enthält. Sammeln Sie den Überstand und das Pellet verwerfen. </li><li> Wash und 10 ml (= 1 Säulenvolumen [CV]) Schlamm aus Nickel (Ni) -NTA Agarose-Kügelchen mit 10 mM Imidazol-Puffer in einer Chromatographiesäule äquilibrieren. Fügen Sie die äquilibrierte Ni-Perlen zu dem Überstand aus Stufe 3.3, enthaltend exprimierten MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein und Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation. </li><li> Nach der Inkubation gelten für eine Chromatographiesäule die gesamte Ni-bead-Proteinmischung. Die Säule wird langsam mit je 5 CVs von 10 mm, 20 mm und 50 mM Imidazol - Puffer mit 10 mM beginnen, dann 20 mM und letzten 50 mM (3A). </li><li> Eluieren die MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein unter Verwendung von 250 mM Imidazol - Puffer (3A). Während der Elution, überprüfen Sie die OD 280nm die Elution des Fusionsproteins zu überprüfen (der Anstieg der OD 280nm). Weiterhin Elution , bis die OD 280nm zu Tropfen ~ 0,1. Waschen der Kügelchen mit übermäßiger Mengen von 250 mM Imidazol-Puffer (mindestens 10 CVs), gefolgt von mindestens 10 CVs von 10 mM Imidazol-Puffer. Speichern Sie die Perlen für die zweite Reinigungsstufe (Abschnitt 4). </li><li> Überprüfen die Anwesenheit des MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein mit SDS-PAGE unter Verwendung eines 12% SDS-Polyacrylamidgel (10 x 8 cm) 9 (3A). Führen Sie Gel-Elektrophorese bei 45 A und 200 V für 45 min. </li><li> Konzentrat (beispielsweise eine kommerzielle Konzentrator verwendet wird ) das eluierte MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein zu einer Endkonzentration von ~ 3 mg / ml. Spalten die MBP-His-P Domäne Fusion mit HRV-3C - Protease während der Dialyse gegen 2 l 10 mM Imidazol - Puffer (~ 1: 100) über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 3A). Je nach Endvolumen von konzentriertem Protein, führen Dialyse in einer Dialysekassette oder Dialyseschlauch. Anmerkung: Die Menge der HRV-3C-Protease für die ProteinSpaltung berechnet wird entsprechend der spezifischen Protease-Aktivität (2 U / &amp; mgr; l, 1 U ist ausreichend, um 100 ug Protein abzuspalten) und der Menge des eluierten Fusionsproteins, die auf dem Expressionsniveau variiert und kann aus dem SDS-PAGE-Ergebnis (3.7 abschätzbar ). </li></ol> 4. 2. Reinigungsschritt <ol><li> Äquilibrieren die Ni-Perlen aus Schritt 3.6 in 10 Imidazolpuffers mM. </li><li> Inkubieren der dialysierten Protein aus Schritt 3.7 mit den äquilibriert Ni-beads (4.1) für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation (gespalten P domain, MBP-Protein und HRV-Protease enthält). </li><li> Tragen Sie die Ni-Perlen - Mischung auf eine Säule und sammeln Sie die Flow-Through (gespalten P - Domäne) (3B). Messen Sie die Konzentration des Proteins , wie es die Spalte , bis die OD 280 nm erreicht ~ 0.1 kommt weg. Hinweis: Das MBP-His sollte die Ni-beads (3B) gebunden bleiben. </li><li> Prüfen Sie das Vorhandensein von gespaltenen P-Domäne unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem 12% Gel , wie oben (3B) beschrieben. Konzentrieren der eluierten P Domäne ~ 3 mg / ml und dialysiere über Nacht bei 4 ° C gegen GFB für nachfolgende SEC Reinigung. </li></ol> 5. 3. Reinigungsschritt <ol><li> Waschpumpen und Leitungen der HPLC-Reinigungsanlage und Pre-äquilibrieren der SEC-Säule (siehe Materialliste) mit GFB. </li><li> Injizieren der P-Domäne auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min eine Superloop (bis zu 12 ml) oder Schleife (bis zu 3 ml), je nach dem Volumen der konzentrierten Probe. Nach der Injektion abgeschlossen ist, erhöhen auf 2,5 ml / min Volumenstrom. </li><li> Da die OD erhöht und die P-Domäne aus der Säule kommt, sammeln Fraktionen von 1,5 ml. Überprüfen Fraktionen mittels SDS-PAGE mit einem 12% -Gel (4A und 4B). Pool nur die reinsten Fraktionen und konzentriere auf ~ 3 mg / ml und ~ 8 mg / ml. Hinweis: Nach ~ 110 ml (Hohlraumvolumen) die meisten Verunreinigungen aus einer SEC-Säule mit 320 ml Bettvolumen eluiert werden. DasP-Domäne wird in der Regel als ein Dimer eluiert. Elutionszeit / Volumen der P-Domäne Dimer ist abhängig von der Präparationsgüte (pg) der SEC-Säule. </li></ol> 6. Die Kristallisation des P-Domäne <ol><li> Verwenden, um die P-Domäne bei ~ 3 mg / ml und 8 mg / ml für die anfängliche Kristallisation Screening. Bereiten Sie mindestens 100 &amp; mgr; l P-Domäne pro Konzentration für Einstiegsbildern mit 384 im Handel erhältlichen Screening-Bedingungen. Screening bei 18 ° C in einer 96-Well-Plattenformat, in dem der Vorratsbehälter enthält 100 &amp; mgr; l Stammlösung und ein Tropfen besteht aus 0,2 &amp; mgr; l Stammlösung und 0,2 &amp; mgr; l Protein. </li><li> Wiederholen und optimieren erfolgreiche Kristallisationsbedingungen. Daher verwenden 15-Well-Platten, die 3 Zeilen enthalten. Stellen Sie die erste Zeile mit 100% Mutterlösung auf, die zweite Reihe mit 90% Stammlösung und 10% Wasser, und die dritte Reihe mit 80% Stammlösung und 20% Wasser. Verwenden Sie eine Tropfengröße von 2 &amp; mgr; l (1 ul Protein + 1 &amp; mgr; l Stammlösung) und 50081; l der Mutterlösung als Behältervolumen. </li><li> Verwenden Sie optimierte Kristall Bedingungen für die Co-Kristallisation des P-Domäne mit Liganden. Bereiten Platten wie in 6.2 beschrieben. Anstelle von 2 ul Tropfengröße eingesetzten Tropfen, die 1 &amp; mgr; l Mutterlösung, 1 &amp; mgr; l Protein und 1 ul-Ligand in einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Sammeln Sie Datensätze von Einkristallen mit Synchrotronstrahlung. Führen des molekularen Ersatzes unter Verwendung veröffentlichter P Domänenstrukturen mit einer hohen Sequenzähnlichkeit als erste Suche Modell 6,10-13. Hinweis: Die Anwesenheit eines Liganden zeigt sich als nicht modellierte blob der Elektronendichte. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Expression und Reinigung von Norovirus P-Domänen in hoher Qualität und Quantität. Noroviren sind nicht gut untersucht und Strukturdaten werden kontinuierlich benötigt. Unseres Wissens P Domain Produktion mit anderen Protokollen (zB GST-tagged P - Domänen) war problematisch, so weit, und eine ausreichende strukturelle Daten auf Norovirus-Wirt - Interaktion gefehlt haben. Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir in letzter Zeit wesentlich zum Verständnis der moleku...

Menschliche Noroviren sind die Hauptursache der akuten Gastroenteritis weltweit 1. Diese Viren gehören zur Familie der Caliciviridae, von denen es mindestens fünf Gattungen, einschließlich Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus und Nebovirus. Trotz ihrer hohen Einfluss auf das Gesundheitssystem und die weite Verbreitung, die Untersuchung der menschlichen noroviruses wird durch das Fehlen eines stabilen Zellkultursystem behindert. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder antivirale Strategien zur Verfügung. Das Norovirus Hauptkapsidprotein, genannt VP1, kann in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne 2 geteilt werden. Die P-Domäne wird durch ein flexibles Scharnier (H) Region der S-Domäne verbunden. Die S-Domäne bildet ein Gerüst, um die Virus-RNA, während die P-Domäne den äussersten Teil des viralen Capsid bildet. Die P-Domäne versammelt in biologisch relevanten Dimere, wenn sie in Bakterien exprimiert. Die P dimer mit Kohlenhydratstrukturen in Wechselwirkung tritt, bezeichnet als histo-Blutgruppenantigene (HBGAs) , die als lösliche Antigene im Speichel vorhanden sind und auf bestimmte Wirtszellen 3 gefunden. Die P domain-HBGA Interaktion wird gedacht für Infektions 4 wichtig. Tatsächlich ergab eine kürzlich veröffentlichten Bericht die Bedeutung von synthetischen HBGAs oder Bakterien , die für die menschliche Norovirus - Infektion in vitro 5 HBGA-Ausdruck zu bringen. Aktuelle Studien der Wirtszelle Befestigung noroviruses Bezug hauptsächlich mit virusähnlichen Partikeln (VLPs) durchgeführt , die in Insektenzellen oder die mit rekombinanten P Domänen exprimiert in Escherichia coli (E. coli) exprimiert werden kann. Um zu verstehen, können die P-Domäne-HBGA Wechselwirkungen auf atomarer Ebene, P Domain-HBGA komplexe Strukturen werden Röntgenkristallographie gelöst werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die P-Domäne Expression und Reinigung, die für Röntgen Crystall verwendet Produktion von P-Domäne in hoher Quantität und Qualität werden könnengraphie. Außerdem kann dieses Verfahren für andere Calicivirus P-Domänen und nicht-strukturelle Proteine ​​angewendet werden. Die P - Domäne wird Codon-optimiert für E. coli - Expression und in einem Standard - Transfer - Vektor geklont. Die P-Domäne wird dann in einen Expressionsvektor re-kloniert, das einen Polyhistidin (His) Markierung und ein Mannose-bindendes Protein (MBP), die durch eine Protease-Spaltstelle gefolgt werden codiert. Das MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein wird in E. ausgedrückt coli, durch drei Reinigungsschritten gefolgt. Das MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein wird unter Verwendung von immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Als nächstes wird das Fusionsprotein mit humanem Rhinovirus (HRV) -3C Protease gespalten und die P-Domäne von MBP-His durch eine zusätzliche IMAC-Reinigungsschritt abgetrennt wird. Schließlich wird die P-Domäne unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Das gereinigte P-Domäne können dann für die Röntgenkristallographie verwendet werden. Screening von Proteinkristallisationsbedingungen ist perfoRMED mit im Handel erhältlichen Screening-Kits unterschiedliche P Domäne Proteinkonzentrationen verwendet wird. Kristallwachstum beobachtet und die vielversprechendste Bedingungen optimiert sind. Mit den hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, vom Gen zum Protein zu gehen innerhalb von weniger als vier Wochen zu strukturieren. Deshalb ist unsere Methode der P Domain Expression, Reinigung und Kristallisation eignet Norovirus-Wirt-Interaktion auf molekularer Ebene zu untersuchen und wichtige Daten liefern zu unterstützen, up-to-date Impfstoff-Design und Wirkstoff-Screening.

<table><tbody><tr><td>P-Domäne DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gensynthese</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; Vektor</td><td>Auf Anfrage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Säule Chromatographiesäule</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2,5 x 10 cm, auch in anderen Größen</td></tr><tr><td>möglich Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>diverse</td><td>Cutoff von 10 kDa, 30 kDa und 50 kDa verwendet</td></tr><tr><td>Subklonierungseffizienz DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemisch kompetent E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC Säule</td></tr><tr><td>JCSG Core Suites</td><td>Qiagen</td><td>diverse</td><td>4 Siebe mit je 96 Vertiefungen</td></tr><tr><td>Kohlenhydrate</td><td>Dextra Laboratories, UK</td><td>verschiedene</td><td>Blutgruppenprodukte</td></tr></tbody></table>

herstellung von humanen noroviren hervorstehendem domains in<em&gt; e. coli</em&gt; für röntgenkristallographie

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Die Norovirus-Kapsid eines einzigen großen strukturellen Protein zusammengesetzt ist, bezeichnet VP1. VP1 in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne unterteilt. Die S-Domäne bildet eine zusammenhängende Gerüst um die virale RNA, während die P-Domäne Formen viraler Spitzen auf der S-Domäne enthält und Determinanten für die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen. Die P - Domäne bindet Kohlenhydratstrukturen, dh., Histo-Blutgruppenantigene, die für Norovirus - Infektionen wichtig sind gedacht zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode für hochwertige Norovirus P-Domänen in hohen Ausbeuten herzustellen. Diese Proteine ​​können dann für die Röntgenkristallographie und ELISA verwendet werden, um die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen zu studieren. Die P-Domäne wird zuerst in einen Expressionsvektor kloniert und exprimiert dann in Bakterien. Das Protein wird gereinigt drei Schritte ausführen, die Metall-Ionen-Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie immobilisiert beinhalten. ImGrundsätzlich ist es möglich, zu klonen, Express, zu reinigen und zu kristallisieren Proteine ​​in weniger als vier Wochen, die in diesem Protokoll zur Analyse von neu entstehenden Norovirus-Stämme ein schnelles System macht.

Die schematische Darstellung der beschriebenen Protokoll ist in 1 dargestellt. Das Protokoll 6 Hauptteile umfasst , die Klonierung des Zielgens die Expression umfassen einen dreistufigen Reinigung und Kristallisation. 2 veranschaulicht die Konstruktion des Expressionskonstrukts (EC) und Eigenschaften des pMalc2x Expressionsvektor. Die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des pMalc2x Vektor zeigt Restriktions und Proteasespaltstellen. Abb...

Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp).

Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist die Herstellung und Reinigung der hervorstehenden Domäne des humanen Norovirus in E. coli, um ein äußerst reines Protein für die Röntgenkristallographie zu erhalten. Unser Protokoll zur Proteingewinnung, Reinigung und Kristallisation ist schnell, robust und kann für strukturelle sowie nichtstrukturelle Proteine verwendet werden. Der Vorteil dieses Protokolls liegt darin, dass unsere Proteine sehr rein sind und Kristalle bilden können, die bis zu hoher Auflösung diffraktieren.Je nach unserer Erfahrung könnte das Protokoll für weniger lösliche Proteine angepasst werden müssen. Beispielsweise können das Wachstumsmedium oder die Wachstumstemperatur während der Proteinexpression geändert werden. Zunächst einen Mikroliter des pMalc2x-Vektors, der für das MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein kodiert, mittels eines Standard-Transformationsprotokolls in 15 Mikroliter kompetente E.coli BL21-Zellen transformieren.Geben Sie 600 Mikroliter SOC-Medium zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Überimpfen Sie die transformierten Zellen in 120 Milliliter LB-Ampicillin und kultivieren Sie über Nacht bei 160 U/min und 37 Grad Celsius.Inokulieren Sie neun Liter LB-Ampicillin mit der Subkultur. Kultivieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 160 rpm, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,6 erreicht. Anschließend senken Sie die Temperatur für etwa eine Stunde auf 22 Grad Celsius ab.Es ist wichtig, bis zur Erreichung einer Temperatur von 22 Grad Celsius zu warten, bevor mit einer geringen Menge IPTG induziert wird, um die lösliche Proteinsynthese zu ermöglichen. Induzieren Sie die Proteinsynthese mit 0,66 Millimolar IPTG. Kultivieren Sie die Zellen nach der Induktion über Nacht bei 22 Grad Celsius.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation ein. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Zellpellet bei 20 Grad Celsius ein. Bereiten Sie die Puffer, die für die Schritte der Proteinreinigung verwendet werden, aus Stammlösungen gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.Tauen Sie das Zellpellet aus der neun Liter großen Kultur auf und lösen Sie es in 150 Milliliter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei vier Grad Celsius auf. Sonizieren Sie die Zellsuspension dreimal für jeweils zwei Minuten, um die Zellen zu lysieren. Zentrifugieren Sie die sonizierte Zellsuspension, um Zelltrümmer vom Überstand zu trennen, der das exprimierte MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein enthält.Sammeln Sie den Überstand und verwerfen Sie das Pellet. Waschen und equilibrieren Sie eine 10-Milliliter-Suspension aus Nickel-NTA-Agarose-Kügelchen mit 10-Millimolar-Imidazol-Puffer in einer Chromatographiesäule. Geben Sie die equilibrierten Nickel-Kügelchen zum Überstand, der das exprimierte MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius unter langsamer Rotation.Nach der Inkubation die gesamte Nickel-Perlen-Protein-Mischung auf eine Chromatographiesäule auftragen. Die Säule langsam mit jeweils fünf Kolonvenvolumina an Puffer mit 10 Millimolar, 20 Millimolar und 50 Millimolar Imidazol bei vier Grad Celsius waschen. Das MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein mit Puffer aus 250 Millimolar Imidazol bei vier Grad Celsius eluieren.Während der Elution die optische Dichte bei 280 Nanometern überprüfen, um die Elution des Fusionsproteins zu bestätigen. Die Elution fortsetzen, bis die optische Dichte bei 280 Nanometern auf etwa 0,1 abgesunken ist. Bei vier Grad Celsius die Kügelchen mit einem Überschuss an 250 Millimolar-Imidazol-Puffer, gefolgt von 10 Millimolar-Imidazol-Puffer, waschen.Die Kügelchen für den zweiten Reinigungsschritt aufbewahren. Die Anwesenheit des MBP-His-P-Domänen-Fusionsproteins mittels Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE, unter Verwendung eines 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gels überprüfen. Anschließend das eluierte MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein auf eine Endkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter konzentrieren.Die Menge an Protease, die erforderlich ist, um die MBP-His-P-Domänenfusion effektiv zu spalten, muss sorgfältig berechnet werden. Sie hängt von der Gesamtmenge des eluierten Fusionsproteins und vom SDS-PAGE-Ergebnis ab. Spalten Sie die MBP-His-P-Domänenfusion mit HRV 3C-Protease während einer Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius gegen zwei Liter 10 Millimolar-Imidazol-Puffer.Je nach endgültigem Volumen des konzentrierten Proteins die Dialyse in einer Dialysiskassette oder in Dialyserohr durchführen. Die beiseitegestellten Nickelkügelchen in einem Puffer mit 10 Millimolar Imidazol äquilibrieren. Das dialysierte Protein, das die gespaltene P-Domäne, das MBP-Protein und die HRV-Protease enthält, 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit langsamer Rotation mit den äquilibrierten Nickelkügelchen inkubieren.Die Nickelperlenmischung auf eine Säule auftragen und den Durchlauf bei vier Grad Celsius sammeln. Dies ist die gespaltene P-Domäne. Die Proteinkonzentration während des Austritts aus der Säule bestimmen, bis die optische Dichte bei 280 Nanometern etwa 0,1 erreicht.Das MBP-His sollte an die Nickel-Kügelchen gebunden bleiben, während die gespaltene P-Domäne im Durchlauf eluiert wird. Überprüfen Sie das Vorhandensein der gespaltenen P-Domäne mittels SDS-PAGE mit einem 12%-Gel wie zuvor. Nachdem die eluierte P-Domäne auf etwa drei Milligramm pro Milliliter angereichert wurde, dialysieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius gegen Puffer für die Gelfiltration zur anschließenden Reinigung mittels Größenausschlusschromatographie.Spülen Sie die Pumpen und Leitungen des Systems zur Reinigung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und präkonfigurieren Sie die Größenausschlusschromatographiesäule mit Puffer für die Gelfiltration. Injizieren Sie die P-Domäne mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute über einen Superloop oder einen Loop auf die Säule, abhängig vom Volumen der konzentrierten Probe. Nach Beendigung der Injektion erhöhen Sie die Flussrate auf 2,5 Milliliter pro Minute.Wenn die optische Dichte ansteigt und die P-Domäne von der Säule eluiert wird, sammeln Sie Fraktionen von 1,5 Milliliter. Die P-Domäne wird üblicherweise als Dimer eluiert. Nach Überprüfung der Fraktionen mittels SDS-PAGE mit einem 12 %igen Gel werden nur die reinsten Fraktionen vereinigt und auf etwa drei Milligramm pro Milliliter sowie auf etwa acht Milligramm pro Milliliter konzentriert.Verwenden Sie die P-Domäne für die anfängliche Kristallisationsscreening in einer Konzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter und acht Milligramm pro Milliliter. Bereiten Sie für die anfänglichen Screenings mit 384 kommerziell verfügbaren Bedingungen mindestens 100 Mikroliter der P-Domäne pro Konzentration vor. Führen Sie das Screening bei 18 Grad Celsius im 96-Well-Plattenformat durch, wobei das Reservoir 100 Mikroliter Mutterlösung enthält und ein Tropfen aus 0,2 Mikrolitern Mutterlösung und 0,2 Mikrolitern Protein besteht.Optimieren Sie die Bedingungen für eine erfolgreiche Kristallisation mithilfe von 15-Loch-Platten, die drei Reihen enthalten. Verwenden Sie 500 Mikroliter Mutterl&ouml;sung als Reservoirvolumen. Bereiten Sie die erste Reihe mit 100 % Mutterl&ouml;sung vor.Die zweite Reihe mit 90 % Stammlösung und 10 % Wasser. Und die dritte Reihe mit 80 % Stammlösung und 20 % Wasser. Bereiten Sie den Hänge-Tropfen mit einer Tropfengröße von zwei Mikrolitern vor, indem Sie ein gleiches Volumen Protein und Stammlösung mischen.Verwenden Sie die optimierten Kristallisationsbedingungen, um die P-Domäne gemeinsam mit Liganden zu kristallisieren. Bereiten Sie die Platten wie zuvor vor, verwenden Sie jedoch Tropfen mit einem Volumen von jeweils einem Mikroliter Muttermittel, einem Mikroliter Protein und einem Mikroliter Ligand mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter anstelle von zweimikroliter-Tropfen. Gezeigt ist hier ein repräsentatives SDS-PAGE-Ergebnis, das die Menge an eluiertem MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein nach dem ersten Reinigungsschritt darstellt, bei dem das MBP-His-P-Domänen-Fusionsprotein mittels Nickel-NTA-Agarose-Kügelchen gereinigt wird.Nach der Trennung des MBP-His von der gespaltenen P-Domäne wird die Menge der eluierten gespaltenen P-Domäne ebenfalls mittels SDS-PAGE analysiert. Nach dem endgültigen Reinigungsschritt mittels Größenausschlusschromatographie führte die Kristallisationsscreening zu optimierten Kristallisationsbedingungen. Hier ist das Beugungsmuster einer hervorstehenden Domäne dargestellt.Im Prinzip ist es möglich, Proteine in weniger als vier Wochen zu klonieren, zu exprimieren, zu reinigen und zu kristallisieren, wodurch dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Analyse neu auftretender Norovirus-Stämme wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Qualität wichtiger ist als die Quantität. Aufgrund der hohen Qualität der gereinigten P-Domänen eignen sich weitere Studien, darunter Immunisierungen zur Antikörperproduktion, NMR-Experimente und ELISA-basierte Untersuchungen.Außerdem kann die gereinigte P-Domäne zur Komplexbildung mit Antikörperfragmenten und Nanobodies verwendet werden. Nach dem Anschauen dieses Protokolls sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Norovirus-P-Domänen in hoher Qualität exprimiert und gereinigt werden können.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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