Name: Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die selektive Gewinnung von marginierenden Lungen-Leukozyten aus Ratten- und Mäuselungen mittels Perfusionsverfahren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzigartiger immunologischer Funktionen dieser Zellpopulation.

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Die Autoren und diese Arbeit wurden von NIH / NCI Zuschuss # R01CA172138 (auf SBE) unterstützt.

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität Tel Aviv genehmigt. 1. Rat Protokoll <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Vereinbaren 2 Schmetterling 21 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 21 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung. </li><li> Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS) -Lösung. Verwenden Sie bei RT. 35 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt. </li><li> Streamen heparinisiertem PBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu vermeiden. </li></ol></li><li> Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten <ol><li> Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören. </li><li> Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf. </li><li> Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten. </li><li> Legen Sie eine Schmetterlingsnadel in den rechten Ventrikel des Herzens, und innerhalb von etwa einer Minute sammeln, um die maximale Menge an Blut in eine Spritze (~ 6 ml von einem 250 g Tier). </li><li> Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion). </li><li> Halten Sie die Butterfly-Nadel innerhalb des rechten Ventrikels, während die Spritze ersetzt das Blut mit dem Ablaufrohr des p enthält,eristaltic Pumpe. </li><li> Legen Sie eine zweite Butterfly-Nadel in eine 5 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel verbunden ist, das Eindringen der Scheidewand zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 5 ml / min und schonend sammelt in die Spritze die ersten ml Perfusat, die mit Blut kontaminiert sind. Fortfahren, bis das Perfusat Farbe von dunkel färbt sich rot bis hellrot. (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste). </li><li> Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 5 ml Ernte Spritze mit einer 20 ml Spritze und Ernte sammeln 20 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 7 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden. </li><li> Cease den Fluss der Schlauchpumpe. </li></ol></li><li> Leukozyten-Extraktion <ol><li> Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g. </li><li> Saugen Sie das Fluid. </li><li>10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe. </li><li> 20 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. </li><li> Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs ​​(FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Maus-Protokoll <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Vereinbaren 2 Schmetterling 25 G Nadeln. Optional vorbereiten 2 stumpfkantige Schmetterling 25 G Nadeln durch die scharfe Kante der Nadel Einreichung. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente: 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, hemostat, Zahngewebe durch Autoklaven bei 121 ° C sterilisiert Zange für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung. </li><li> Bereiten heparinisiertem PBS (30 units / ml) durch Zugabe von 30 Einheiten Heparin pro ml 1x PBS-Lösung. Verwenden Sie bei RT. 25 ml ist das Minimalvolumen pro Tier benötigt. </li><li> strePBS in die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln am heparinisiert Luftblasen zu vermeiden. </li></ol></li><li> Perfusion der Lunge und der Sammlung von MP-Leukozyten <ol><li> Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Bestätigen Sie die Euthanasie durch Überwachung der Atmung Aufhören. </li><li> Nach Absetzen der Atmung zu öffnen, sofort die Peritonealdialyse und Brust Hohlräume unter Verwendung der sterilen Schere und Zahngewebe Pinzette. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt entlang der Bauch zum Xiphoidbasis auf. </li><li> Heben Sie das Brustbein mit der Pinzette vorsichtig den Brustkorb auf beiden Seiten schneiden, ohne inneren Organen oder große Blutgefäße Punktierung. Klemmen Sie einen hemostat auf dem Brustbein und rostral den Brustkorb falten Sie die Herz-Lungen-Komplex zu belichten. </li><li> Klemmen Sie die Hohlvene mit einer hemostat rückwärts Perfusion der Leber zu vermeiden (siehe Diskussion). </li><li> Legen Sie eine Schmetterlingsnadel an das Auslaufrohr der Schlauchpumpe in die richtige ven verbundentricle des Herzens, und eine zweite Schmetterlingsnadel in ein 2 ml Ernte Spritze in den linken Ventrikel des Herzens verbunden ist, avoidingpenetration des interventrikulären Septums. </li><li> Schalten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 ml / min und sammeln die ersten Milliliter Blut verunreinigten Perfusat in die Ernte Spritze, bis das Perfusat aus dunkel färbt sich rot bis blass (Entsorgen Sie das Blut kontaminierte perfuste). </li><li> Ohne Einstellung der peristaltischen Pumpe ersetzen schnell die 2 ml Ernte Spritze mit einer 10 ml Spritze und Ernte sammeln 10 ml Lungen Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 4 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, während Vakuumbildung zu vermeiden. </li><li> Cease den Fluss der Schlauchpumpe. </li></ol></li><li> Leukozyten-Extraktion <ol><li> Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 × g. </li><li> Saugen Sie das Fluid. </li><li> 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400xg für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Die Verwendung von PBS oder Medium hängt von der konsequente Einsatz der Probe. </li><li> 10 ml PBS oder Medium, Zentrifuge bei 400 × g für 10 min, und die Flüssigkeit anzusaugen. </li><li> Rekonstituieren der Zellen auf die gewünschte Konzentration, bezogen auf die Probenverwendungs ​​(FACS, PCR, etc.). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorgestellte Verfahren ermöglicht hier die selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von MP-Leukozyten. Im Vergleich zum Zirkulieren oder splenic Leukozyten wird die MP Population durch eine bestimmte Zusammensetzung der Leukozyten - Subpopulationen gekennzeichnet, höhere Aktivierungsstufen, höhere Freisetzung verschiedener Cytokine, und höhere mRNA - Spiegel von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen 2,3. Insbesondere haben wir gezeigt , dass die MP-NK - Zellen cytotoxischer als Kre...

Leukocyten zu den Kapillaren der Lunge anhaftenden (dh marginating-Lungen (MP) Leukozyten) 1 gezeigt wurden verschiedene Leukozyten - Zusammensetzung und einzigartige Aktivität aufweisen , verglichen mit Leukozyten von anderen Immun Kompartimente (zB Zirkulations, Milz, Knochenmark) 2- 4. Zum Beispiel, MP-Leukozyten zeigen eine höhere natürliche Killerzellen (NK) Zytotoxizität gegen verschiedene Tumorzellen, im Vergleich zu zirkulierenden und splenic NK-Zellen, sowie differenzierte Boten-RNA (mRNA) Ebenen und erhöhte Sekretion von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen. Die Zusammensetzung von Zellen ist auch aus der zirkulierenden Leukozyten unterschieden als MP-Leukozyten ein höheres Verhältnis von angeborenen / adaptive Immunität gegenüber zirkulierende Leukozyten (50% vs. 30%, jeweils). Das Ziel des hier vorgestellte Methode selektive Ernte von MP-Leukozyten zu ermöglichen, um diese wichtige und einzigartige Immunfach (Zellpopulation) zu untersuchen und zu eluciDate die Auswirkungen verschiedener Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen. Um die Bedeutung dieser einzigartigen Bevölkerung zu verstehen, ist es wichtig zu beachten , dass das Immunsystem steuern kann zirkulierenden Tumorzellen, Mikrometastasen und Resterkrankung durch in - vivo - Funktionen der zellvermittelten Immunität (CMI). Diese Fähigkeit ist offensichtlich trotz der Präzedenzfall Versagen des Immunsystems , den Primärtumor zu steuern und durch reichlich in vivo Nachweis von Krebspatienten und Tiermodellen 5 unterstützt. Wichtig ist , dass diese Ergebnisse oft nicht mit in vitro und ex vivo - Studien, die berichten , dass die meisten autologe Tumorzellen - Zytotoxizität durch zirkulierende Leukozyten in Blutproben von Menschen und Tieren (gemessen durch Zytotoxizitätsassays) resistent sind 6,7. Diese Diskrepanz kann auf die in vivo Existenz verschiedener Leukozyten - Populationen, wie der zuvor zurückzuführengenannten MP Leukozytenpopulation und seine Subpopulation von aktivierten NK - Zellen spezifisch 3. Tatsächlich syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent erwiesen worden waren, wurden durch MP-NK - Zellen werden lysiert 3,8 gezeigt. Somit werden die angeblich &quot;NK-resistente &#39;MADB106 Zellen, die Lungen von fischer344 (F344) -Ratten metastasieren von MP-NK-Zellen kontrolliert, aber nicht durch zirkulierende oder splenic NK-Zellen, die gewöhnlich ihre leichte Zugänglichkeit gegeben sucht. Gereinigte und aktive MP-Leukozyten sind nicht zugänglich über die Standard - Ernteverfahren von Leukozyten aus den Lungen, die auf das Lungengewebe Schleifen oder biologischen Abbau 9 basieren. Unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu Gewebeverarbeitung Ansätze. Zunächst erntet die Perfusion Ansatz selektiv MP-Leukozyten, um sie von anderen Zellen zu trennen, die von der Lunge parenchymal, interstitielle stammen, und bronchoalveoläre compartments. Zweitens besser ist die Perfusion Technik bewahrt die Integrität und das physiologische Milieu von MP-Leukozyten, im Gegensatz zum Schleifen und biologische Verarbeitung Ansätze, die Zellen schädigen, ihre Morphologie zu verändern, und die Produktion und Freisetzung von verschiedenen Faktoren induzieren, die Immunaktivität modulieren und speziell NK unterdrücken Zytotoxizität 10. Die Lungen sind eine wichtige Zielorgan für Krebsmetastasen und für verschiedene Infektionskrankheiten. Alle zirkulierenden malignen Zellen und infizierten Zellen gehen durch die Lungenkapillaren, wo sie benötigen, mit Endothelzellen und resident Leukozyten zu verformen und zu interagieren. Unter diesen Bedingungen können zirkulierenden Zellen leicht durch resident MP-Leukozyten ausgerichtet sein. Es scheint also von Vorteil, biologisch aktivierten Leukozyten in diesem Immunraum zu haben, und es ist wichtig, diese einzigartige MP-Population in verschiedenen biologischen, experimentellen und klinischen Einstellungen zu studieren. Es ist erwähnenswert, dass sy zu beachtenstemic Immunaktivierung durch verschiedene biologische-response-modifiers (zB Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I: C) oder Typ-C CpG - Oligodesoxynukleotide (CpG-C - ODN)) wurden MP-Leukozyten mehr als zirkulierende Leukozyten 3 gezeigt , zu aktivieren , 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic Pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly Nadel</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Butterfly Nadel</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4"</td></tr> <tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic-Lösung</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic-Lösung</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr>Pinzette <td></td><td></td><td></td>mit<td>abgestumpften Kanten</td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hämostatisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Schweineschleimhaut (ohne Konservierungsstoffe)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selektive ernte von marginating-lungen-leukozyten

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonale (MP) Leukozyten sind Leukozyten, die am inneren Endothel der Lungenkapillaren haften. Es wurde gezeigt, dass MP-Leukozyten im Vergleich zu Leukozyten anderer Immunkompartimente eine einzigartige Zusammensetzung und Eigenschaften aufweisen. Es gibt Hinweise auf eine höhere Zytotoxizität natürlicher Killerzellen und ein ausgeprägtes pro- und antiinflammatorisches Profil der MP-Leukozytenpopulation im Vergleich zu zirkulierenden oder Milzimmunozyten. Das hierin vorgestellte Verfahren ermöglicht die selektive Entnahme von MP-Leukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Mäusen oder Ratten. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Extraktion von Lungenleukozyten, wie z. B. dem Zerkleinern von Gewebe und dem biologischen Abbau, werden bei dieser Methode ausschließlich Leukozyten aus den Lungenkapillaren gewonnen, die nicht mit parenchymalen, interstitiellen und broncho-alveolären Zellen kontaminiert sind. Darüber hinaus bewahrt die Perfusionstechnik die Integrität und das physiologische Milieu der MP-Leukozyten besser, ohne physiologische Reaktionen aufgrund der Gewebeverarbeitung hervorzurufen. Diese einzigartige MP-Leukozytenpopulation ist strategisch günstig gelegen, um abnormale zirkulierende Zellen zu identifizieren und darauf zu reagieren, da alle zirkulierenden bösartigen Zellen und infizierten Zellen beim Passieren der Lungenkapillaren zurückgehalten werden und physisch mit Endothelzellen und ansässigen Leukozyten interagieren. Daher kann die selektive Entnahme von MP-Leukozyten und ihre Untersuchung unter verschiedenen Bedingungen unser Verständnis ihrer biologischen und klinischen Bedeutung verbessern, insbesondere im Hinblick auf die Kontrolle zirkulierender aberranter Zellen und lungenbedingter Krankheiten.

Der MP-Fach weisen eine unterschiedliche Leukozyten-Subset Zusammensetzung im Vergleich zu Leukozyten zirkulieren. Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse wurden Leukozyten-Subpopulationen identifiziert und die Zusammensetzung von sowohl zirkulierenden Leukozyten und MP zu charakterisieren quantifiziert. Granulozyten und Lymphozyten wurden basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungen identifiziert. Innerhalb der Lymphozyten wurden NKRP-1 helle Zellen NK - Zellen, CD3 +...

Marginating-pulmonale Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir die selektive Entnahme dieser Subpopulation von Lungenleukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Ratten und Mäusen. Marginating-pulmonale Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für durch Blut übertragbare und lungenbedingte Krankheiten zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Perfusion von Maus- oder Rattenlungen durchzuführen, um marginierende pulmonale Leukozyten gezielt zu gewinnen, die an dem inneren Endothel der Lungencapillaren haften. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung dieser spezifischen Population von Leukozyten, die einzigartige Eigenschaften und spezifische hämatologische Funktionen aufweist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ausschließlich Leukozyten aus den Lungencapillaren gewinnt und somit Zellen aus dem parenchymatösen, interstitiellen und bronchoalveolären Kompartiment ausschließt.Die Durchführung dieses Verfahrens wird von Liat Sorski und Lee Shaashua, zwei Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstriert. Vor Beginn des Verfahrens leiten Sie heparinisiertes PBS durch die Schläuche der Peristaltikpumpe und die Butterfly-Nadeln, um etwaige Luftblasen zu entfernen. Unmittelbar nach dem Erliegen der Atmung öffnen Sie mit sterilen Scheren und Zahn-Gewebetupfer die Bauch- und Brusthöhle der euthanasierten Ratte durch einen medianen Bauchschnitt bis zum Processus xiphoideus. Verwenden Sie anschließend die Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie vorsichtig den Rippenkorb beidseits durch. Befestigen Sie eine Hämostaseklemme am Brustbein und klappen Sie den Rippenkorb rostral auf, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Führen Sie dann eine Butterfly-Kanüle in den rechten Ventrikel des Herzens ein und sammeln Sie die maximale Blutmenge. Wenn das gesamte Blut gesammelt wurde, die Vena cava mit einer Hämstoppe verschließen, um eine retrograde Perfusion der Leber zu vermeiden. Dann, unter Festhalten der Flachnadel im rechten Ventrikel, die Blutspritze durch das Ausflussrohr der peristaltischen Pumpe ersetzen und eine zweite Flachnadel, die mit einer fünf Milliliter fassenden Sammelspritze verbunden ist, in den linken Ventrikel einführen. Nun die peristaltische Pumpe auf eine Geschwindigkeit von etwa fünf Milliliter pro Minute einschalten und die ersten Milliliter verunreinigten Perfusats vorsichtig in die Sammelspritze aufsammeln, bis das Perfusat von dunkelrot zu blassrot wechselt.Dann, ohne den Pumpvorgang zu unterbrechen, die fünf Milliliter sammelnde Spritze schnell durch eine 20-Milliliter-Spritze ersetzen und 20 Milliliter Lungenperfusat mit einer Geschwindigkeit von sieben Millilitern pro Minute sammeln, um die marginationellen pulmonalen Leukozyten der Ratte zu gewinnen. Achten Sie auf die allmähliche Verfärbung der Lunge von einem blassen Rot zu einem klaren Weiß, was auf eine erfolgreiche Perfusion hinweist. Sobald das gesamte Perfusatvolumen gesammelt ist, stoppen Sie den Fluss der peristaltischen Pumpe und überführen Sie das gesammelte Perfusat in ein Reagenzglas.Anschließend das Perfusat zentrifugieren und den Überstand absaugen. Heparinisiertes PBS durch die Schläuche der Peristaltikpumpe und die Butterfly-Nadeln leiten, um Luftblasen zu entfernen. Um marginierende pulmonale Leukozyten aus der Maus zu gewinnen, unmittelbar nach dem Stillstand der Atmung sterile Scheren und Zahn-Gewebezangen verwenden, um durch einen medianen Bauchschnitt bis zum Processus xiphoideus die Bauch- und Brusthöhle zu öffnen.Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie den Rippenkorb auf beiden Seiten durch. Befestigen Sie eine Hämostaseklemme am Brustbein und klappen Sie den Rippenkorb nach kranial, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Klemmen Sie die Vena cava mit einer Hämostaseklemme ab, um eine retrograde Perfusion der Leber zu vermeiden, und führen Sie die Butterfly-Nadel in den rechten Ventrikel des Herzens ein.Dann, während die Butterfly-Kanüle in der rechten Herzkammer gehalten wird, verbinden Sie die Butterfly-Kanüle mit dem Auslassrohr der peristaltischen Pumpe und führen eine zweite Butterfly-Kanüle, die mit einer zwei Milliliter fassenden Sammelspritze verbunden ist, in die linke Herzkammer ein. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie eine Geschwindigkeit von etwa zwei Millilitern pro Minute ein. Sammeln Sie vorsichtig das erste Milliliter des kontaminierten Perfusats in der Sammelspritze, bis das Perfusat von dunkelrot zu blassrot wechselt.Dann, ohne den Peristaltikpumpenfluss zu unterbrechen, die zwei Milliliter sammelnde Spritze schnell durch eine 10-Milliliter-Spritze ersetzen und 10 Milliliter Lungenperfusat mit einer Perfusionsrate von vier Millilitern pro Minute sammeln. Achten Sie auf die allmähliche Verfärbung der Lunge von einem blassen Rot zu einem klaren Weiß, was auf eine erfolgreiche Perfusion hinweist. Sobald das gesamte Lungenperfusat gesammelt wurde, stoppen Sie den Fluss der Peristaltikpumpe und überführen Sie das gesammelte Perfusat in ein Reagenzglas.Anschließend das Perfusat zentrifugieren und den Überstand abpipettieren. Der marginierende pulmonale Kompartiment weist eine andere Zusammensetzung an Leukozyten-Subpopulationen auf als diejenige der zirkulierenden Leukozyten. Tatsächlich machen angeborene Immunzellen, einschließlich Granulozyten, Monozyten und natürliche Killerzellen, mehr als 50 % der Leukozytenpopulation im marginierenden pulmonalen Kompartiment aus.Im Vergleich zu weniger als 30 % des zirkulierenden Zellkompartiments. Im Gegensatz dazu finden sich die T-Zell- und dendritischen Zellpopulationen im marginierenden pulmonalen Kompartiment in geringeren Anteilen als bei den zirkulierenden Zellen. Im marginierenden pulmonalen Kompartiment ist ein um das Dreifache höherer Prozentsatz an großen natürlichen Killerzellen vorhanden als im zirkulierenden Zellkompartiment, obwohl die Gesamtzahl der natürlichen Killerzellen insgesamt ähnlich ist.Außerdem ist die Fähigkeit natürlicher Killerzellen aus dem marginierenden pulmonalen Kompartiment, Tumorzellen zu lysieren, größer als die der zirkulierenden natürlichen Killerzellen, gemessen mittels eines standardmäßigen Chromfreisetzungsassays gegenüber mindestens zwei verschiedenen Tumorzelllinien. Zusätzlich führt eine immunologische Stimulation durch die in-vivo-Gabe von Poly I:C zu einem stärkeren Effekt auf die zytotoxische Aktivität der marginierenden pulmonalen natürlichen Killerzellen im Vergleich zu den zirkulierenden natürlichen Killerzellen, wenn MADB106-Zielzellen verwendet werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb weniger Minuten durchgeführt werden.Mithilfe dieser Techniken lässt sich eine selektive Gewinnung von MP-Leukozyten durchführen. Die Untersuchung dieser Leukozyten wird unser Verständnis ihrer biologischen und klinischen Bedeutung voranbringen, insbesondere im Hinblick auf die Kontrolle zirkulierender aberranter Zellen und lungenspezifischer Erkrankungen. Nach diesem Verfahren können die Zellen mittels Durchflusszytometrie, PCR oder einem anderen gewünschten Test charakterisiert und analysiert werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man marginationierende pulmonale Leukozyten gewinnt.

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von marginierenden Leberleukozyten aus der Mausleber durch erzwungene Perfusion.

Isolierung von marginierenden hepatischen Leukozyten aus einer Mausleber

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Marginating-hepatische Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir eine Methode zur selektiven Entnahme dieser spezifischen Leberzellpopulation durch erzwungene Perfusion der Leber von Ratten oder Mäusen. Marginating-hepatische Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für hepatische Erkrankungen und Metastasen zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Beseitigung und Reinigung der Lungenarterie endothelialen Zellen (PAECs), die sich zu den Ballon-Tipps von Swan-Ganz Katheter halten, während sie während rechts Herzkatheter in der Lungenarterie eingeklemmt sind und bleiben an der Luftballon nach Entnahme aus dem Körper des Patienten.

Ernte von Endothelzellen von Sprechblasentipps Swan-Ganz Katheter nach rechts Herzkatheter

Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus  Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Lernen Sie die selektive Gewinnung von marginierenden Lungen-Leukozyten aus Ratten- und Mäuselungen mittels Perfusionsverfahren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzigartiger immunologischer Funktionen dieser Zellpopulation.

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

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