Name: Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur kombinierten Aufnahme mechanisch stimulierten Afferenten-Outputs und Markierung von Nervenendigungen in Maus-Haarfollikeln. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Mechanosensation in situ.

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Die Arbeit wurde teilweise durch den Projektzuschuss des UK Medical Research Council finanziert, der an G.S.B. und R.W.B. G0601253 wurde.

Maus post mortem Gewebe Ernte müssen ethische Methoden für diese Anwendung freigegeben. Im Vereinigten Königreich ist Zervikaldislokation eine staatlich anerkannte Methode für erwachsene Mäuse (börsennotiertes Zeitplan 1 Verfahren in Großbritannien Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 und der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU). Diese Gesetzgebung wird vor Ort an der University of Aberdeen durch den Tierschutz und ethische Review Board durchgesetzt, die alle Verfahren in dem folgenden Protokoll verwendet, überprüft und genehmigt. Hinweis: Es wurden in der Forschung in Banken meldeten Diese Methoden et al 7. 1. Vorbereiten Ohren für Elektrophysiologie <ol><li> Vor Dissektion, bereiten Sie einen Standard physiologischer Kochsalzlösung, wie Liley der (1956) und sättigen sie mit 90% O 2/5% CO 2. Liley der Kochsalzlösung (mM) besteht aus: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) und Glucose(11). </li><li> Menschlich eine erwachsene Maus einschläfern, ohne den Schädel in der Nähe der Ohren zu beschädigen. Hier verwenden wir C57 / Bl6J und MF1-Mäuse aber jede Standard-Labormausstamm verwendet werden kann. Idealerweise Mäuse verwenden, die &lt;25 g sind, wenn elektrische Aufnahme mit Styrylfarbstoffs Kennzeichnung kombiniert werden soll, wie die Kennzeichnung in größeren Mäuse weniger zuverlässig ist, oft nur in eingeschränkten umschriebenen Bereichen gefunden werden. </li><li> Entfernen Sie den Kopf mit großen Schere oder Knochenschere. </li><li> Setzen Sie den Kopf dorsalen Seite nach oben in vergast Liley die in einem breiten Boden Sezieren Schale (50 cm ist in der Regel bequem) auf der Bühne eines Stereo-Präpariermikroskop. Regelmäßig (~ 10 min) Schleuse oder den Kopf mit vergast Salz versenken. </li><li> Sorgfältig einzuschneiden und die Haut an der Basis des äußeren Ohres (Ohrmuschel) mit Springbow Schere und # 3 Zange trennen, den Knorpel des äußeren Gehörgangs (EAM) ausgesetzt wird. Identifizieren Sie die Zweige des Trigeminus (mandibularis, MDV) und große Ohrmuschel Nerven, wie sie f entstehenrom der Schädel in der Spalte des Kiefergelenks und Projekt durch den Knorpel Basis der konkaven zu innervate (anterior) und konvexen (posterior) Aspekte der Ohrmuschel Haut sind. </li><li> In der Nähe des Schädels, zu identifizieren, wo die beiden Nervenäste Ausfahrt in die Nut zwischen der Backe und dem Mastoid Prozess. Maximieren ihrer Länge durch sanft die Ohrmuschel vom Schädel ziehen und die Nerven so nah an den Schädel wie möglich schneiden. </li><li> Entfernen Sie die Ohrmuschel aus dem Kopf mit Springbow Schere so, daß die distalen Stümpfe der geteilten Nerven und Minimierung der Menge an dicht pelage an der Basis des Ohres zu vermeiden, die entfernt wird. </li><li> Übertragen Sie die Ohrmuschel mit einem flexiblen Silikonkautschuk (PDMS) -lined Schüssel gefüllt mit begasten Liley der Flüssigkeit. Öffnen Sie die EAM, indem sie es an seiner schmalsten Stelle (anterior-die meisten) Punkt geteilt wird. Flatten die Ohrmuschel, vordere Haut (konkave) Seite nach unten und Pin an die PDMS sorgfältig an den Rändern mit ~ 6-8 in regelmäßigen Abständen sehr fein (~ 0,2 mm Durchmesser) Insektenstifte. </li><li> Remove die Haut des hinteren Teils der Ohrmuschel vollständig und teilweise die Ohrmuschel Knorpel durch stumpfe Dissektion mit # 3 Pinzette zu entfernen, um die vordere Haut gewährleisten intakt gelassen wird. </li><li> Mit der Spitze eines feinen Insektenstift gegriffen mit einem # 3 Pinzette vorsichtig die Zweige erstrecken (in der Regel 2) des MDV, die posterior zwischen der Haut und EAM Knorpeln entstehen. Pin diese an die PDMS mit den besten möglichen Insektenstifte, spießte das Bindegewebe angrenzenden ihren Schnittenden und nicht die Nervenstämme selbst. </li><li> Entfernen Sie die meisten der umgebenden Bindegewebe um sie herum, sorgfältig Schaden von überschüssigem vermeiden Ziehen oder Schneiden. </li></ol> 2. Die elektrophysiologischen Aufzeichnung einrichten <ol><li> Pin der Ohrmuschel Haut an die PDMS-lined Basis eines Aufnahmekammer mit feinen Insektenstifte an den Rändern (~ 6-8 pro Ohr), legen Sie die gereinigten Nerven an der Basis des Ohres in der Nähe von zwei Saugelektroden - eine für die Aufnahme (zu nehmen Sie den Nerv) und die otihr eine indifferente Elektrode (dem Neutralsignal an einen Differenzverstärker zu schaffen, siehe 7). </li><li> Für die Aufzeichnungselektrode, passen sorgfältig die Blende und die Innendurchmesser der Öffnung auf die kombinierte Dicke der beiden Nerven, so passen sie so eng wie möglich und für so große Länge wie möglich. </li><li> Zeichne die Nerven in die Elektrode durch vorsichtiges Absaugen aus einer 2 ml-Spritze mit dem anderen Ende befestigt ist mit Silikongummischlauch. Achten Sie darauf, die Nerven sind gerade, nicht gefaltet oder verdoppelt. </li><li> Entwickeln Sie einen hohen elektrischen Widerstand / Impedanz fit durch stärkere Absaugung mit Bindegewebe oder ein Fettgewebe zu ziehen einen Stecker zu bilden, die dicht verschließt die Öffnung um den Nerv. </li><li> Füllen Sie das andere (indifferent) Elektrode mit Kochsalzlösung durch Absaugen, falls erforderlich (es durch Kapillarwirkung füllen kann). </li><li> Platzieren Sie identische Aufnahme Drähte (Silber oder Platin) in die Innenbohrung der Aufzeichnungselektroden, die Kochsalzlösung in Kontakt zu treten und den Nerv(Aufnahme) oder verengt, feuerpolierte Ende (indifferent) der Elektrode. Jede Elektrode ist gelötet individuell an verschiedene Kerne von zwei-adriges geschirmtes Kabel. Stellen Sie das Bad (Masse) Elektrode (Ag / AgCl-Pellet) in das Bad und zermalmte es auf den Bildschirm der beiden Core-Kabel an die Aufzeichnungselektroden verbunden. </li><li> Führen Sie die elektrische Aktivität von den beiden Elektroden in die einzelnen Kanäle eines Differenzverstärkers, Filter (Bandgeben 0,2-2 kHz) und Blick auf dem Bildschirm eines Oszilloskops. Überprüfen Sie, dass der Kanal A (Aufnahme) und Kanal B (indifferent) die elektrischen Rauschpegel ähnlich aussehen. In diesem Stadium kann es nicht möglich sein, die normalen spontanen Aktionspotentiale in Kanal A zu sehen, bevor die beiden Elektroden ausgeglichen sind. </li><li> REDRESS keine Unterschiede in Hintergrundrauschen zwischen den Elektroden durch die Impedanz der Aufnahme (Kanal A) zu erhöhen oder indifferent (Kanal B) Elektroden. Tun Sie dies durch das Saugen areolar (adipöse) Bindegewebe weiter in jeder Elektrode und /oder die Anwendung von mehr Saugkraft auf die 50-ml-Spritze. <ol><li> Sobald &quot;ausgewogen&quot; auf diese Weise, wechseln Sie wieder auf Differential (AB) Aufnahme und suchen spontane Aktionspotentiale (APs) in der Spur oder wenn Haare am Rand der Ohrmuschel zu streicheln. Wenn keine Aktivität (spiking) gesehen wird, überprüfen Sie nochmals auf festen Sitz der Nerv in der Aufzeichnungselektrode und die areolar Bindegewebe in der indifferenten Elektrode - in der Regel die engere (höherer Widerstand) der Dichtung und der mehr gleich der Impedanz in den beiden Elektroden, desto besser. Mit der Praxis wird dies eine gute Qualität zu erreichen (&gt; 2: 1) Signal: Rausch-Verhältnis. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die electroneurogram über eine Labor-Schnittstelle und Elektrophysiologie-Software auf einem Computer ausgeführt wird. Ein Audioausgang spiking ist sehr nützlich und kann durch Einspeisen des Neurogramms über einen Audio-Verstärker und zugehörigen Audio-Lautsprecher erreicht werden. Stellen Sie die Schwelle gerade über dem Grundrauschen ist (identifiziert durch die Abwesenheit von white-noise &#39;Zischen&#39;). </li><li> Zur Erhöhung der Droge oder fluoreszierende Styrylfarbstoffs Zugang zu den lanceolate Endungen sorgfältig schälen die Unterhautfettschicht in der Nähe der Ohrmuschel Rand entfernt, ein Fenster von ~ 5 mm x 5 mm Aussetzen der Dermis und der Basis der Follikel (1A Öffnung, B ). </li><li> Pin zurück eine Falte von ~ 1 mm von Fettgewebe geräumten Ohrhaut an den vorderen Rand (auf der Ebene des Fensters nur produziert, wo zutreffend), eine klare Kochsalzlösung gefüllte Lücke zwischen den apposed Hautschichten zu verlassen. Sanft Hub entlang der gefalteten Kante die Haare mit einem Stift oder geerdeten feinen Pinzette vorsteht, ohne die Haut zu berühren, den Bereich der maximalen AP Ausgang auf dem Oszilloskop und dem unverwechselbaren &quot;klickt&quot; und &quot;Pops&quot; in den Audio-Ausgang zu finden. </li></ol> 3. Aufnahme Stimulus-evozierte Aktionspotentiale <ol><li> Positionieren Sie die mechanische Stimulationssonde - eine feuerpolierte 10 cm Borosilikat-Glas-Mikroelektrode zu einem cerami befestigtc piezoelektrische Betätigungseinrichtung - so ist die Bewegung parallel zu der Hautfalte. Setzen Sie die Spitze etwa 0,5-1 mm von Hautfalte, so dass es die Haare berührt aber nicht die Haut. Stellen Sie sicher, wirksam Stimulation durch langsam die Sondenspitze bewegen manuell die Haare abzulenken und zu beobachten / hören zum Spicken. </li><li> Verwenden Sie die Software mechanische Stimulation von 1-3 Haare zu fahren (zB 3 Sekunden bei 5 Hz Sinusoide, alle 10 sec. Sonde Verschiebung 200-500 &amp; mgr; m), und notieren Sie die Stimulation hervorgerufenen Reaktionen in den Nerven. </li><li> Geben Sie mehrere identische mechanische Stimulation Züge in 10 Sekunden-Intervallen. Optimieren Sie die Sondenposition für die Wiederholbarkeit, dann Frequenz der Stimulation reduzieren gemäß Versuchsprotokoll (zB Tropfenwiederholungsrate von 10 s bis 30 s). </li><li> Verwenden Sie die Software AP-ähnliche Aktivität zB unter Verwendung einer einfachen Schwelle auf ~ 2x Hochfrequenzrauschamplitude und ~ 25% der größten APs zu unterscheiden. </li><li> Zählen Sie die APs Überschreiten der Schwelle als&quot;Ereignisse&quot;, Quantifizieren der Frequenz und die Eigenschaften der hergestellten APs. </li></ol> 4. Aufnahme Stimulus-evozierte Firing Kombination mit N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium -dibromid Labeling <ol><li> Um die Auswirkungen der Styrylfarbstoffe auf Stimulus-evozierte zuführenden Brennen und Klemmenbeschriftung, fügen Sie die entsprechende Konzentration eines Styrylfarbstoffs der Wahl, auf die Badelösung prüfen und mit der elektrischen Aufzeichnung fortzusetzen. </li><li> Nach der Belichtungszeit erforderlich (in der Regel mindestens 30 min), bereiten Sie die Vorbereitung auf die Follikel sehen. Klappen Sie die Hautlappen durch die Haltestifte zu entfernen, und setzen die gelöscht dermalen Bereich der Klemmenbeschriftung zu offenbaren. </li><li> Wegspülen externen Farbstoff mit farbstofffreie Kochsalzlösung, so dass 3 vollständige Änderungen der Salzlösung. </li><li> Inkubieren in der letzten Änderung des vergast farbstofffreie Kochsalzlösung für 10 bis 15 min die hartnäckigsten Farbstoff Kontamination zu ermöglichen, von exponierten / externen Membranen auszulaugen. </li><li> Entfernen Sie nicht internalisierte Farbstoff noch auf Membranen mit einem Maskierungsmittel (sulfobutylated Beta-Cyclodextrin, 1 mM, 5 min) in Kochsalzlösung. </li><li> Übertragen Sie die Aufnahmekammer auf die Bühne eines aufrechten Epifluoreszenzmikroskope und greifen in die Kammer mit der Bühne / Dia-Bewegungsmechanismus. </li><li> Illuminate die Vorbereitung mit Anregungslicht geeignet für den Styrylfarbstoffs. Verwenden Sie ein 10X oder 25X Fluoreszenzmikroskopobjektiv , um die Follikel Kennzeichnung (Abbildung 1) zu beobachten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir eine relativ einfache Herstellung entwickelt, die schnell zerlegt werden kann, hat eine geringe Dichte und Haarfollikel ermöglicht relativ selektive mechanische Stimulation einer kleinen Anzahl von Haarfollikeln. Es ist leicht zugänglich für elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell - Fluoreszenz - Bildgebung, einschließlich der Antworten Anwendung zu färben die mechanisch stimuliert Haarfollikel, dh Bildgebung Follikel mit definierten elektrophysiologischen Reaktionen sichtbar zu machen. Während wir noch nicht getan haben, scheint dieses System auch leicht zugänglich, um die sensorischen Nerven für einzelne Einheit (Einzel sensorischen Axon) Aufnahme Unterteilung und gezielte GFP-Expression unter Verwendung von für die Visualisierung sensorischer Terminal endet Morphologie. Wir haben die Ohrhautpräparat 7 verwendet die Eigenschaften der Internalisierung und Freisetzung der fluoreszierenden Membran styryl pridinium Farbstoffe zu untersuchen, eine Technik , die ursprünglich zu studieren lokalisierten Vesic entwickeltle Membran - Recycling in der synaptischen Terminals 8. In Synapsen wird Bildgebung auch bei gleichzeitiger Aufnahme von elektrophysiologischen Reaktionen in identifizierten Terminals 8,9 leicht kombiniert. Es war in diesen frühen Studien , die wir zum ersten Mal die Farbstoffe auch durch mechanosensorischen Endungen 10 internalisiert festgestellt wurden. Für sensorische Neuronen in Kultur und in Cochlea Haarzellen, viel von der Markierung durch Styryl pyridinium Farbstoffe scheint Farbstoffe , die durch die mechanosensorischen Kanäle beinhalten, die sie dann 11,12 blockieren. Die Farbstoffe beschriften dann intrazellulären Membranen, und diese Kennzeichnung ist irreversibel. In Haarzellen jedoch , die nicht mechanisch 13,14 stimuliert werden und in ausdifferenzierten primären sensorischen Nervenendigungen in situ, beispielsweise Ia Digungen in Muskelspindeln 15 und in den lanceolate Digungen hier 7 scheint Styrylfarbstoff Kennzeichnungs Membran Endozytose zu reflektieren, da die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen responses 7,15,16. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, ist es von der weiterhin Brennen während der Farbstoff Inkubation und die Reversibilität der Kennzeichnung deutlich , dass die große Mehrheit der Etikettierung in differenzierten Terminals in situ durch Internalisierung mit Recycling - Vesikel Membran. Somit ist diese einfache Technik für den kombinierten elektrischen und optischen Überwachung einer Reihe von mechanosensorischen Terminalfunktionen in ex vivo Gewebe ohne weiteres eingesetzt. Wie bei den meisten praktischen Techniken, Reproduzierbarkeit Wiederholung und Übung erfordern. Einige der wichtigsten Punkte wert besondere Aufmerksamkeit wird nun beschrieben. Während der Präparation und Aufnahme - Session, maximieren die Lebensfähigkeit des Gewebes und das Überleben durch die Vorbereitung zu gewährleisten ständig mit Kochsalzlösung durchströmt wird , vollständig mit 95% O 2/5% CO 2 gesättigt. Sicherstellen, dass die Haarfollikel nicht während dieses Prozesses verschoben, which will sensorischen Ende Brennen stimulieren. Verwenden Sie entweder eine kontinuierliche, Laminar-Flow-Perfusions-System oder sorgfältig Blase Gas durch das Organbad mit feinen Schlauch in einem Abstand von der Vorbereitung, oder sorgfältig aktualisieren Lösungen für jeden 20-30 Minuten, zu jeder Zeit die Vorbereitung unter der Salzoberfläche zu halten. Absaug- Aufzeichnungselektroden werden durch Modifizieren scharfe Elektrode Borosilikat-Pipetten normalerweise für die intrazelluläre Aufnahme verwendet gemacht. Zuerst sorgfältig die scharfen Spitzen mit # 3 Zange abbrechen die entsprechende Innendurchmesser zu geben, die Nerven und Feuerpolitur durch sehr kurze (&lt;1 sec) Exposition gegenüber Bunsenbrennerflamme zu passen (siehe 2.4 und 2.5). Um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten, wenn die Aufzeichnung, ist es wesentlich, dass die elektrische Impedanz (Widerstand) in diesen beiden Elektroden sowohl maximiert und gleich. Tun Sie dies, indem die Aufmerksamkeit auf die folgenden in den beiden Elektroden. Für die Aufzeichnungselektrode, sicherzustellen, der Innendurchmesser eine eng anliegende Passform für die Nerven ist, und die maximale Länge neRVE wird in die Aufzeichnungselektrode gezogen. Versuchen Sie, das Bindegewebe rund um die Nerven zu verwenden, um effektiv die Elektrodenspitze abzudichten. Alternativ oder zusätzlich zeichnen das schmale Ende eines geeigneter Größe, verjüngte Stück Fettgewebe in neben dem Nerv. Dann stecken Sie die Elektrodenspitze durch Anlegen starken Sog für ~ 1 min mit einer 50-ml-Spritze mit dem Rohr befestigt. Für eine gut abgedichtete Spitze wird stark abgesaugt wird einfach die Wirksamkeit des Steckers zu stärken und wird nicht mehr flüssig oder Nerv ziehen in. Um Nervenschäden zu vermeiden, sollten Sie jedoch, dass das Bindegewebe den Nerv von Kompression auf das umgebende Material und EAM Knorpel abzufedern. Die indifferente Elektrode sollte der Widerstand / Impedanz der Aufzeichnungselektrode so dicht wie möglich nachahmen. Dies geschieht durch vorsichtiges Feuerpolieren der Spitze so klein eine Öffnung wie möglich geholfen, ohne es wirklich abdichten. Wenn weitere Widerstand erforderlich ist, dann stecken Sie das Ende der indifferenten Elektrode mit adipose Bindegewebe, wie oben für die Aufzeichnungselektrode beschrieben. Die elektrokeramischer gibt exquisite Kontrolle über mechanische Verschiebung, sowohl räumlich als auch zeitlich. Achten Sie jedoch darauf elektrische Verbindungen herstellen - hohe Temperaturen zerstören sie, also nicht Lötzinn verwenden. Verwenden Sie mit Metall beladene Epoxy-Kleber, oder verwenden Sie einen Fachsteckmuffe vom Lieferanten empfohlen. Dadurch wird es sowohl fest halten und die elektrische Verbindung herzustellen. Bringen Sie das Glas anregende Sonde an die elektrokeramischer mit Standard-Epoxidharz. Feuer-Politur das Ende eines Standard-10 cm x 1,5 mm Durchmesser Borosilikat Glaskapillarröhren zur Herstellung von Patch oder scharfe Elektroden für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet, um das Risiko von Gewebeschäden zu minimieren. Wenn einzelne Haarfollikel Stimulation erforderlich ist, Feuerpolitur der Spitze ein einzelnes Haar zu passen, und die Sonde mit einem einzigen Haar in die offene Öffnung positionieren. Dies gibt exquisite Kontrolle über ein einzelnes Haar. Für Styryl dye Etikettierung ist es im Allgemeinen gleichmäßigere in Geweben von jungen Tieren. Es ist nicht ganz klar, warum, aber dies spiegelt wahrscheinlich weniger mechanische Trauma und effektiver tiefe Gewebeentnahme aus den jüngeren Geweben. Seien Sie gründlich in die schaumige Schicht ähnelnden expandiertem Polystyrol Entfernen der Haarfollikel Basen liegt. Vermeiden Sie jedoch zu stark sein, da dies die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals Risiken zu entfernen. Wenn es wenig oder keine elektrische Antwort auf Haarfollikel Bewegung ist, und Styrylfarbstoff Anwendung führt zur überwiegenden Kennzeichnung Talgdrüsen (gelb / weiß), mit ausgeprägtem Eigenfluoreszenz der Basis des Haarschaftes anstatt lanceolate Digungen (orange / gelb), überenthusiastische Clearance hat die darunter liegende Gewebe beschädigt. Schließlich stark ein Farbstoff-Chelatbildner vor Bildgebung verbessert den Bildkontrast und die Qualität der endgültigen Bilder. Diese Technik könnte in einer Reihe von weiteren Studien nützlich sein. Diese Could umfassen zum Beispiel für den mechanosensorischen Kanal-Screening (n) verantwortlich für die Strecke hervorgerufenen Reaktionen, durch die Zubereitung mit pharmakologischen Liganden selektiv für Kandidatenkanälen Inkubation oder Screening-Mauslinien mit solchen Kanälen genetisch gelöscht. Letzteres könnte mit Fluoreszenz Beurteilung von Änderungen in Terminal Morphologie kombiniert werden durch genetische Manipulation in Mauslinien, zB mit Npy2r gebundenen GFP - Expression 17. Ein letztes Beispiel kann die Rolle der synaptic-like Vesikel (SLVs) 7 in diesen lanceolate Terminals Untersuchung durch die Wirkung von Modulatoren der SLV Umsatz untersucht (Ca, Mg, Latrotoxin, Glutamat - Rezeptor - Liganden) auf Dehnung hervorgerufenen Reaktionen und styryl Farbstoffaufnahme /Freisetzung. Somit eröffnet diese neue Technik eine Reihe von potentiell interessante Wege in der Forschung in den Neurowissenschaften mechansensory auf.

Die lanceolate Terminals sensorischer Axone Innervation Haarfollikeln bei Säugetieren Palisaden bilden um das Haar-Welle Epithel. Ihr Zweck ist, mechanische Verschiebung der Haare zu erkennen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung aus schnell und langsam Endungen Anpassung, die überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haar Bewegung erzeugen. Aktivität aufhört sehr schnell, wenn die Bewegung stoppt, sogar in Gegenwart von fort Verschiebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung dieses murine Ohrmuschel Modell für Korrelat Studien von Struktur und Funktion in lanceolate Terminals. Die Ohrmuschel hat viele vorteilhafte Eigenschaften für diese Endungen zu studieren. Erstens ist die Ohrmuschel im wesentlichen zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit wenig anderes Gewebe zwischen den Zugang zu den Follikeln und die Anschlüsse zu stören. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen an harten Bindegewebe seziert. Die Innervation ist leicht zugänglich und erkennbar. Während Haar follicles vorhanden sind, sind sie relativ dünn verteilt, mechanisch die Stimulation der einzelne oder kleine Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu den Nervenendigungen mit pharmakologischen Medikamenten und Farbstoffen. Das macht sie besonders geeignet für die Bildgebung Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Bildgebung kann entweder in lebenden Terminals sein, oder nach der Fixierung und weitere histologische Verarbeitung. Die Antworten von mechanosensorischen Neuronen Innervation Haarfollikeln traditionell vibrissae 1,2 und in geringerem Ausmaß, in isolierten Hautpräparate 3,4 in Nagetieren untersucht worden. Diese haben uns gelehrt, viel über die allgemeinen Grundsätze der mechanosensorischen Physiologie in den Nervenendigungen in den Haarschaft umgibt. Die vibrissal Vorbereitung ermöglicht exquisite Kontrolle über die Bewegung eines einzelnen Haarfollikel. Jedoch kann es schwierig sein, die Ausgabe aufgrund seiner Komplexität zu entschlüsseln, wie vibrissalFollikel enthalten mindestens 8 verschiedene Arten von anatomisch verschiedene mechanosensorischen Ende 5 und die Abstimmung dieser morphologischen Typen auf bestimmte elektrophysiologischen Reaktionen ist nach wie vor umstritten. Die Mäusehaut / saphenus Vorbereitung wird am häufigsten in seiner enthaarte Zustand verwendet Antworten Berührung und Schmerz zu untersuchen. Die Innervation der Haarfollikel in einem solchen Präparat ist weniger komplex , aber die Dichte der Haarfollikel, sowie das Vorhandensein von drei verschiedenen Follikel - Typen (Wache, Ahle / auchene und Zick - Zack - Haare) in solcher Nähe 6, bedeutet , dass die spezifischen Antworten des Studiums ein einzelner Follikel oder einzelne Art von Ende herausfordernd wieder. Darüber hinaus beinhaltet diese Vorbereitung eine komplexe Präparation. Schließlich Zubereitungen in sowohl vibrissal und andere Haut, ist es schwierig , die Enden , während der ex vivo Präparationen noch am Leben sind beteiligt zu visualisieren. Somit wird Gewebe Schnitte auch in GFP-exprimierenden Mauslinien erforderlich. Alternavely erfordert es weitere histologische / immunologischen Verarbeitung, wie die Fixierung und / oder Antikörper-Inkubation für Immunofluoreszenz. Wir haben daher die Ohrmuschel Vorbereitung und dem verwendeten elektrischen Aufnahmen von einer eingeschränkten Population von Haarfollikel Afferenzen zu machen und zeigen, dass Membran Radfahren in diesen lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme von Styrylpyridinium- Farbstoffe. Schließlich haben wir gezeigt, dass der Farbstoff nicht mit mechanischen Empfindlichkeit nicht beeinträchtigt, was anzeigt, es nicht die Mechanotransduktion Kanäle nicht blockiert. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Flexibles, inertes, durchscheinendes festes Silikonpolymer.</td></tr><tr><td>Nr. 3 Dumont Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Sehr feine Stifte zur sicheren Befestigung der Ohrmuschelpräparation am PDMS mit minimaler Beschädigung.</td></tr><tr><td>AC-Differenzvorverstärker</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Verstärkung der Größe des eingehenden afferenten Elektroneurogramms. Die differentielle Aufzeichnung minimiert das elektrische Fremdrauschen und die Grundliniendrift.</td></tr><tr><td>Hoch-/Tiefpassfilter</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Signalkonditionierung durch Reduzierung von elektrischem Fremdrauschen, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Stellt den Schwellenwert des Ereignismelders ein und zeigt ihn auf dem Oszilloskop an. Dies zeigt die Wirksamkeit der Erkennung von Aktionspotentialen.</td></tr><tr><td>Audioverstärker & Lautsprecher</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S Nützliches</td><td>Audio-Monitoring für das Vorhandensein von elektrischem Auslösen der sensorischen Enden beim Einstellen der mechanischen Stimulationsvorbereitung am Mikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>Wir verwenden dieses alte Modell, aber jedes Standard-Oszilloskop reicht aus.</td></tr><tr><td>Piezo-Elektrokeramik&nbsp; Wafer</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Elektrophysiologie/Computerschnittstelle</td></tr><tr><td>Piezo-Elektrokeramik&nbsp; Stromversorgung</td><td>Hausgemachter</td><td></td><td>0-200 V DC-Ausgang zur Ansteuerung der Keramikwafer-Verschiebung, mit variabler elektronischer Steuerung der Ausgabe über Aufnahme-/Stimulationssoftware und Computerschnittstelle. Wir verwenden die Spike2-Software und die 1401micro-Computerschnittstelle.</td></tr><tr><td>Elektrophysiologie-Software</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Software zur Aufzeichnung, Stimulation und Datenanalyse für Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Laborschnittstelle</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401</td><td>Mikro-Elektrophysiologie-Schnittstelle zwischen dem Verstärker/den Filtern und dem Computer. Er gibt das Elektroneurogramm ein und treibt auch das elektrokeramische Uhrwerk an.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Fluoreszierende Membransonde, die sich reversibel in das äußere Segel der Zellmembranen aufteilt. Wird überwiegend zur Überwachung der Vesikelmembran-Endo-/Exozytose verwendet.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>Ein sulfoniertes b-Cyclodextrin-Derivat, das FM1-43 (und andere Styrylpyridiniumfarbstoffe) aus den exponierten Membranen chelatisiert, so dass internalisierter Farbstoff durch Verringerung der Hintergrundmarkierung/Fluoreszenz deutlicher zu sehen ist.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochrome, gekühlte CCD-Kamera - Basismodell</td></tr><tr><td>Volocity 3D Bildanalysesoftware</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Bilderfassungs- und Analysesoftware.</td></tr></tbody></table>

kombinierte aufnahme von mechanisch stimulated afferent output und nervenendigung kennzeichnung maus haarfollikel lanceolate endings

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur Überwachung afferenten Brennens durch mechanische Verschiebung der Haare in der Maus Ohrmuschel evozierten beschrieben. Die Technik ist sehr kostengünstig und einfach mit Materialien, die üblicherweise in den meisten Elektro Laboratorien oder leicht gekauft fand geführt. Die Präparation ist einfach und schnell, mit der mechanischen durch eine generische elektrokeramischer Wafer durch proprietäre Software gesteuert bereitgestellt Verschiebung. Die gleiche Software auch Aufzeichnungen und analysiert die electroneurogram ausgegeben. Die Aufzeichnung der Aktivität hervorgerufenen Nerven ist über einen kommerziellen Differenzverstärker zu feuerpolierten Standardglas-Mikroelektroden verbunden. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Stimulation und die Aufnahmebedingungen gegeben Aufnahmequalität zu optimieren. Das System eignet sich zur Bestimmung der elektrophysiologischen und optischen Eigenschaften von lanceolate Anschlüsse der Palisadendigungen der Haarfollikel sowie dieErgebnisse aus ihrer pharmakologischen und / oder genetische Manipulation. Ein Beispiel für die Kombination von elektrischen Aufzeichnung mit mechanischer Stimulation und Markierung mit einem Styrylpyridinium- Vitalfarbstoff gegeben.

Die elektroAufnahmeAnordnung, mit dem subkutanem Fettgewebe die Haarfollikel freizulegen, ist in 1A gezeigt. Ein Teil dieses freiliegenden Bereich mit einer höheren Vergrößerung in Hellfeldbeleuchtung in 1B gezeigt. die Ohrmuschel Folding-Marge in diesem Bereich auf sich selbst nach oben und zurück macht die Epidermis. Dies positioniert die Haare am Rand des Falzes horizontal, in einer idealen Situation für mechanische Stimulation mit einem stumpfen Sonde (nicht gezeigt) vorstehen. 1C zeigt , dass nach der Farbstoff Belichtung und der Rand in die aufgeklappte Position zurückkehrt wiederum die Follikel stimuliert in dieser Position sind mit einem Styryl pyridinium-Farbstoff markiert. Elektron von Präparaten zeigen in der Regel laufenden AP - Aktivität auch in Abwesenheit von auferlegte Bewegung der Glasfasersonde, einschließlich APs der größten Größe (2A <strOng&gt; i-iii). Aktivität erfolgt bei einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 20 Impulse / s ( &quot;Spikes&quot; Trace), keine Struktur oder Anzeichen von Tonus zeigt, wie die Autokorrelation für die Intervalle zwischen den Perioden der Stimulation sind recht flach. Während 5 Hz, 100 &amp; mgr; m mechanische Stimulation der Haarwellen, in der Regel Gesamtleistung steigt auf 20-50 Impulse / sec, oder 4-10 pro Sinuszyklus. Der Bau der Zyklus Histogramme dann zeigt starke Mitnahme (so genannte &quot;phasenverriegelnden &#39;) der Antworten (Abbildung 2Bi-iii)). Das ist ziemlich wiederholbar, obwohl die Phase der Wellenform , bei der die Antworten gesperrt sind nach ihrer Position abhängt, das heißt , an welcher Stelle in der Bewegung der schwingenden Sonde kontaktiert er das Haar. Eine einfache Schwellendetektion (horizontale Linie , die die Neurogramms Spuren in einer Kreuzung (i-iii)) wurde für diese Analyse verwendet. Allerdings kann die Aufnahme-Software-Funktionalität oft in eine anspruchsvollere Art und Weise verwendet werden, umdiskriminieren Merkmale von Spike Größe und Form. Dies kann dann Antworten von bestimmten Afferenzen isolieren, indem diese Eigenschaften Pseudo-Single-Unit-Aufzeichnung Analyse durchgeführt werden zu können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> Abb . 1: Elektrophysiologische Aufnahmeanordnung und N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromid Labeling des Haarfollikels Afferent Lanceolate Endungen (A) Eine Ohrmuschel Vorbereitung für eine elektrophysiologische Versuchsaufbau zeigt die Ohrmuschel Orientierung, die Lage der Nerven, die Aufzeichnungselektroden und der belichtete Bereich des Follikel Innervation nach Entfernen Fettgewebe. (B) Mehrere Haarfollikel sind in Hellfeld - Beleuchtung im Bereich der darüberliegenden Fettgewebe bis in die Dermis gelöscht. Die dunkle, in der Regel zweilappig, Formen sind Talgdrüsen. ( <stRong&gt; C) vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereich in B) zeigt zwei lanceolate mit dem Styryl - Farbstoff markiert Digungen N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium - dibromid und nach mechanischer Stimulation durch Epifluoreszenzmikroskopie abzubildenden . Ab 7, mit freundlicher Genehmigung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> Abbildung 2: (A) Stimulus-evozierte Aktivität von der Maus Pinna aufgezeichnet. (Ai-iii) Beispiele, entnommen aus drei verschiedenen Experimenten, der Tätigkeit von kontinuierlichen Neurogramme von Ohrmuschel in Standard Liley der Salzlösung. Jeder Datensatz zeigt einen 5 sec Schnitt etwa 5 Minuten nach dem Start der Aufzeichnung, einschließlich einer 3 Sekunden Dauer von Sinus Verschiebung alsMall Anzahl von Haarwellen. Die mechanische Stimulation wurde alle 30 Sekunden während des gesamten kontinuierlichen Aufzeichnung wiederholt, die in der Regel für 1-2 Stunden dauerte. Benutzerdefinierte Skriptdateien markiert einzelne Ereignisse, die eine Schwelle durch die horizontalen Cursor (Spikes), sowie den Beginn eines jeden sinusförmigen Zyklus (Periode) eingestellt gekreuzt. (AIV) Das Befehlssignal für Sinus Verschiebung. (B) Analyse von Stimulus-evozierte Schmettern Aktivität. (Bi-iii) Zyklus Histogramme in 3 ° Bins aus den Neurogramms Proben (Ai-iii) jeweils konstruiert, die Antworten von mutmaßlichen lanceolate Endungen auf mechanische Stimulation von 5 Hz Sinus Verschiebung von Haarwellen durch eine Glassonde zeigt. Beachten Sie die markierte Phasenverriegelung, in verschiedenen Phasen des Zyklus, in Abhängigkeit von ihrer Position relativ zu der Ausgangsposition der mechanischen Sonde. (Biv) Normalized Sonde Verschiebung Sinuskurve; die tatsächliche Amplitude betrug ungefähr 100. 1, m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Eine einfache und neuartige Technik zur Aufzeichnung afferenter Entladung aufgrund mechanischer Stimulation von lanzettlichen Enden von Palisadenenden, die Mausohren, Haut, Haarfollikel innervieren, wird vorgestellt.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle und einfache Methode zur Kombination von Live-Cell-Imaging und elektrophysiologischer Ableitung an neuronale Endigungen zu demonstrieren, die bekanntermaßen schwer zugänglich und mechanisch empfindlich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Mechanosensation zu beantworten, beispielsweise die Rolle von synaptisch-ähnlichen Vesikeln oder die Pharmakologie von in Betracht kommenden Mechanotransduktionskanälen in vollständig differenzierten Endigungen in situ.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie äußerst einfach ist und dennoch visuellen Zugang zu vollständig differenzierten Endigungen für physiologische Untersuchungen ermöglicht. Obwohl sich diese Methode auf die afferente Innervation der Haarfollikel konzentriert, kann sie auch Einblicke in andere mechanosensorische Systeme mit niedrigerer Reizschwelle liefern, wie zum Beispiel Muskelspindeln, Merkel-Sinnesendigungen und Barorezeptoren. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Entwicklung neuer pharmakologischer Zielstrukturen zur Regulation mechanischer Sensoren, einschließlich der Therapie einer gestörten Blutdruckregulation.Nachdem ein junges erwachsenes Mäuschen enthauptet wurde, platzieren Sie den Kopf mit der dorsalen Seite nach oben in eine 50 cm breite Unterseite-Schale mit gasgesättigter Liley-Lösung unter einem Stereomikroskop. Spülen Sie etwa alle 10 Minuten den Präparationsbereich gründlich mit gasgesättigtem Silan. Schneiden Sie nun vorsichtig die Haut an der Basis der Ohrmuschel mit einer Federbogenschere und einer Pinzette Nr. 3 ein und lösen Sie sie ab.Legen Sie die Innervation und den Knorpel des äußeren Gehörgangs frei. Identifizieren Sie die Äste der mandibulären Abteilung des Nervus trigeminus und des Nervus auricularis magnus, während sie aus dem Schädel in der Spalte des Kiefergelenks austreten. Diese beiden Nervenäste ziehen durch den Knorpel, um die konkave und konvexe Seite der Ohrmuschelhaut zu versorgen.Danach im Bereich zwischen Kiefer und Warzenfortsatz die Stellen identifizieren, an denen die Äste des Nervus trigeminus austreten. Die Nervenabschnitte freilegen, indem das Ohrmuschelgewebe vorsichtig vom Schädel abgezogen wird. Sobald sie freigelegt sind, die Nerven so nahe wie möglich am Schädel durchtrennen.Verwenden Sie anschließend eine Schere mit Federbügel, um die Ohrmuschel vom Kopf zu entfernen. Vermeiden Sie es, die distalen Stümpfe der geteilten Nerven zu durchtrennen, und minimieren Sie die Menge an dichtem Haar. Überführen Sie die Ohrmuschel in eine mit Silikonkautschuk ausgelegte Petrischale, die mit gespülter Liley-Lösung gefüllt ist.Öffnen Sie nun das äußere Gehörgang durch Teilung an seiner engsten Stelle. Anschließend wird die Ohrmuschel mit der konkaven Seite nach unten flachgedrückt und entlang der Ränder mit regelmäßig verteilten, sehr feinen Insektennadeln fixiert. Entfernen Sie danach die freiliegende dorsale Haut vollständig von der Ohrmuschel und dem darunterliegenden Knorpel durch stumpfe Dissektion mit einer Schere.Beschädigen Sie die vordere Haut während dieses Schritts nicht. Greifen Sie dann mit einer Pinzette eine feine Insektennadel und dehnen Sie vorsichtig die durchtrennten Äste der Mandibularabteilung, die hinter dem Haut- und dem Knorpel des äußeren Gehörgangs austreten, leicht nach außen. Befestigen Sie diese Nervenäste mit den feinstmöglichen Nadeln an der Platte.Durchbohren des Bindegewebes, aneinanderfügen der benachbarten Schnittenden, jedoch nicht der Nervenstücke selbst. Vervollständigen Sie die Gewebepräparation, indem Sie den größten Teil des umgebenden Bindegewebes von den Nervenästen entfernen, ohne die Nerven durch übermäßiges Ziehen oder Schneiden zu beschädigen. Um die mechanosensorischen Endigungen der Haarfollikel mit Vitalfarbstoffen oder Wirkstoffen zu behandeln, lösen Sie vorsichtig das schaumige fibrölastische Knorpelgewebe der subdermalen Fettgewebsschicht entlang von fünf Millimetern des Ohrsaumrandes.Daher ein quadratisches Fenster öffnen, wodurch die Dermis und die Basis der Haarfollikel freigelegt werden. Die Verwendung einer jungen Maus minimiert die Adhäsion zwischen den vorderen und hinteren Hautschichten sowie die Schwierigkeit, den darunterliegenden Knorpel zu entfernen. Beides erhöht die Wahrscheinlichkeit, eine erfolgreiche Färbung zu erzielen.Platzieren Sie die Probe, indem Sie sie in die silikonbeschichtete Basis einer Ableitungskammer überführen. Befestigen Sie das Ohr mit feinen Insektennadeln am Rand, wobei die sauberen Nerven an der Ohrbasis in der Nähe von zwei Saugelektroden liegen. Eine dient zur Ableitung, die andere, eine indifferente Elektrode, liefert das neutrale Signal für einen Differenzverstärker.Passen Sie für die Ableitelektrode die Öffnung und den Innendurchmesser der Öffnung sorgfältig an die Dicke des für die Ableitung ausgewählten Nervs an. Sobald dies erfolgt ist, bleibt dies normalerweise für eine Versuchsreihe konstant. Eine geeignete Nervenlänge muss fest im Inneren sitzen.Um den Nerv in die Elektrode zu ziehen, verwenden Sie sanften Saugdruck aus einer 2-Milliliter-Spritze, die über eine Silikonleitung angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass die Nerven in der Ableitelektrode gerade liegen und nicht gefaltet oder doppelt gelegt sind, indem Sie den Nerv während des Absaugens vorsichtig mit einer feinen Insektennadel zurückziehen und erneut einführen. Saugen Sie nun etwas umgebendes Bindegewebe oder ein weiches, formbares Fettgewebe ein, um eine wasserdichte Abdichtung an der Öffnung der Elektrode zu erzielen.Die Herstellung eines ausgeglichenen Impedanzverhältnisses zwischen den Elektroden ist entscheidend für hochwertige, differenzielle Ableitungen. Entscheidend hierfür ist die Bildung einer hochwiderständigen, wasserdichten Abdichtung um den Nerven. Füllen Sie anschließend die indifferente Elektrode durch Absaugen mit Salzlösung, sofern sie nicht bereits durch kapillare Eigenfüllung gefüllt ist.Danach identische silberne Ableitungsdrähte in die innere Bohrung der Ableit- und indifferenten Elektroden einbringen. Am anderen Ende sollten die Drähte mit verschiedenen Adern eines zweipoligen Schirmkabels verbunden werden. Sicherstellen, dass der Draht in der Ableitelektrode mit der Salzlösung in Kontakt steht und nahe am Nerv liegt, ohne die Abdichtung zu stören.Bringen Sie den Draht in das Ende der indifferenten Elektrode ein. Anschließend platzieren Sie die Erdungselektrode, ein Silber-Silberchlorid-Pellet, in das Bad. Befestigen Sie diese Elektrode an der Abschirmung des Zweikernkabels, das mit der Ableitelektrode verbunden ist.Zeigen Sie die einzelnen Signale auf einem Oszilloskop an, um zu überprüfen, ob die elektrischen Rauschpegel der beiden Kanäle ähnlich sind. Spontane Aktionspotentiale in der Aufnahmeelektrode sind möglicherweise erst sichtbar, wenn die beiden Elektroden ausgeglichen sind. Um Unterschiede im Hintergrundrauschen zu korrigieren, erhöhen Sie die Impedanz eines Kanals, indem Sie adipöses Bindegewebe weiter in die Elektrode hineinsaugen.Sobald die Elektroden ausgeglichene Hintergrundwerte aufweisen, schalten Sie auf differentielle Ableitung um und suchen Sie nach spontanen Aktionspotentialen oder erzeugen Sie Aktionspotentiale, indem Sie mit einem feuerpolierten Glasstab über die Haare am Rand der Ohrmuschel streichen. Nehmen Sie anschließend ein Elektro-neurogramm über die Computer-Schnittstelle auf und leiten Sie das Neurogramm über ein Tonsystem, um die Aktionspotentiale knapp über dem Basisrauschen hörbar zu machen.Diese akustische Rückkopplungsschleife ist sehr nützlich beim Durchführen von Experimenten. Bestätigen Sie anschließend, dass die Innervation der Follikel in der Nähe des freigelegten Bereichs intakt ist, indem Sie die Haare manuell stimulieren. Falten Sie nun einen bis zwei Millimeter des Randes der Ohrehaut auf der Höhe des fettfreien Fensters um, um die darunterliegenden Haare freizulegen.Lassen Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte Lücke zwischen den gegenüberliegenden Hautschichten. Streichen Sie vorsichtig mit einem Glasstab über die entlang der gefalteten Kante hervorstehenden Haare, während Sie aufmerksam horchen. Berühren Sie die Haut nicht.Überprüfen Sie gegebenenfalls das Ausgangssignal am Oszilloskop. Um kontrollierte Aufzeichnungen von stimulusinduzierten Aktionspotentialen durchzuführen, verwenden Sie eine mechanische Sonde aus feingeschliffenem, zehn Zentimeter langem Borosilikat-Mikroelektroden-Glas, die an einen keramischen piezoelektrischen Aktuator angebracht ist. Positionieren Sie die Sonde so, dass sie parallel zur Hautfalte bewegt wird und die Haare, nicht die Haut, berührt.Platzieren Sie ihn etwa einen halben bis einen Millimeter über der Hautoberfläche. Überprüfen Sie dann manuell die Stimulation, indem Sie auf den Audiomitschnitt lauschen, wenn sich die Sonde bewegt. Richten Sie nun die Software ein, um die mechanische Stimulation eines kleinen Haarbereichs durchzuführen.Beispielsweise drei Sekunden dauernde Simulationen mit fünf Hertz Sinusschwingungen alle zehn Sekunden durchführen. Dies erfordert eine Probenauslenkung zwischen 200 und 2.000 Mikrometern. Anschließend mit wiederholter automatisierter Stimulation fortfahren, um die Konsistenz der aufgezeichneten Antworten in den Nerven zu überprüfen.Wiederholbare Ergebnisse sollten erzielbar sein. Wenn die Ergebnisse konsistent sind, verringern Sie die Wiederholungsrate auf alle 30 Sekunden. Weitere Anweisungen finden sich im schriftlichen Protokoll.Um die Eigenschaften der mechanosensorischen Kanäle zu untersuchen und die mechanosensorischen Endigungen um die Haarfollikel herum zu markieren, zehn Mikromolar FM1-43 zur Lösung hinzufügen und 60 Minuten einwirken lassen, während die Haare weiterhin mit der oszillierenden Sonde stimuliert werden. Dieser Farbstoff blockiert kanadidate Transduktionskanäle sowie sensorische Neuronen in Kultur und in Haarzellen der Cochlea.Doch blockiert es die Aktivität in reifen Haarfollikel-Afferenzen in situ nicht. Die Markierung der Endigungen zeigt, dass der Farbstoff Zugang zu den Terminalen erhält, die während der gesamten Farbstoffexposition weiterhin auf mechanische Reize reagieren. Mit dem beschriebenen Protokoll aufgezeichnete Elektro-Neurogramme zeigten typischerweise eine fortlaufende Aktionspotentialaktivität, selbst in Abwesenheit manueller Stimulation, einschließlich Aktionspotentiale der größten Amplitude.Die spontane Aktivität betrug etwa 10–20 Spikes pro Sekunde und zeigte keine Struktur oder Anzeichen von Tonus. Die Autokorrelation der Intervalle zwischen den Stimulationsphasen war stets recht flach. Während einer mechanischen Stimulation der Haarzellen bei fünf Hertz und 500 Mikrometer stieg die Gesamtausgabe typischerweise auf etwa 50 Spikes pro Sekunde an.Die Erstellung von Zyklen-Histogrammen zeigte eine starke Synchronisierung der Antworten mit vier bis zehn Spikes pro sinusförmigem Zyklus. Dies war durchaus wiederholbar; natürlich hing die Phase der Wellenform, an der die Antworten gekoppelt waren, davon ab, an welcher Stelle der vibrierende Probierer die Haarwurzel berührte und in welche Richtung sich die Bewegung an dieser Stelle vollzog. Anschließend wurde die Pharmakologie der kanalischen spindelförmigen Nervenendigungen in Haarfollikeln untersucht.Die Kanäle reagierten weiterhin, selbst wenn sie FM1-43 ausgesetzt waren, das einige mechanosensorische Kanäle blockieren kann, wie zum Beispiel jene in sensorischen Neuronen in Kultur oder Cochlea-Haarzellen ex vivo. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann der gesamte Vorgang bis zum Beginn der Ableitung von Elektro-Neurogrammen in 60 bis 90 Minuten durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, einen elektrischen Kontakt mit hohem Widerstand an den Elektroden zu erzielen, und falls die Visualisierung der Follikel kombiniert wird, sollten kleine Mäuse verwendet werden, um die Penetration des Farbstoffs und die optische Klarheit zu verbessern.Wir haben die Idee für diese Methode von einer ursprünglich von einem engen Kollegen und nun pensionierten Professor, Clarke Slater, sowie dessen Masterstudent Nakul Kain entwickelten Methode übernommen, nachdem wir ihnen von der möglichen Rolle synaptischer Vesikel bei der Mechanosensorik im Muskelspindelorgan und dem Bedarf an einer besseren Visualisierungsmethode mittels FM1-43 berichtet hatten. Die Durchführung dieses Verfahrens in Kombination mit Methoden wie der Pharmakologie und der Vitalfarbenmarkierung ermöglicht es, Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Mechanotransduktionskanäle und differenzierten Endigungen in situ vorliegen und ob mechanische Reize die Aufnahme und Freisetzung von Farbstoff durch Regulierung des Recyclings synaptischer Vesikel beeinflussen können. Vergessen Sie nicht, dass FM1-43 hinsichtlich seiner Toxizität nicht evaluiert wurde und als gefährlich behandelt werden sollte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Whole-Cell-Patch-Clamp Messungen von auditiven Nervenfaser Dendriten an der inneren Haarzelle ribbon Synapsen im Säuger-Cochlea.

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

Dieses Video zeigt die kombinierte Aufzeichnung von mechanisch stimulierter afferenter Ausgabe und Nervenendmarkierung in den Haarfollikeln einer Ohrmuschel einer Maus. Es beschreibt die Schritte bei der mechanischen Stimulation der Nervenendigungen der Haarfollikel vor und nach der Exposition gegenüber einem fluoreszierenden Membranfarbstoff, die elektrophysiologische Aufzeichnung der erzeugten Aktionspotentiale und die Visualisierung der Markierung der Nervenenden in den Haarfollikeln.

Kombinierte Aufzeichnung der mechanisch stimulierten afferenten Ausgabe und der Markierung der Nervenenden in Haarfollikeln von Mäusen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und zur Aufzeichnung postsynaptischer Ströme in medialen olivocochlären Neuronen in Keilschnitten des Mausgehirns.

Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und postsynaptische Stromaufzeichnungen in einer Keilscheibe des Maus-Gehirns

Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen.

Ein In-vitro- Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Hier beschreiben wir ein neuartiges Präparat zur Abbildung lebender lanzettlicher sensorischer Enden von Palisadenenden, die Mausohren, Haut, Haarfollikel während des Färbens und Entfärbens mit Styrylpyridiniumfarbstoffen innervieren.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Wir entwickelten eine Technik, die gleichzeitig Electrocorticography und lokales Feld Potentiale in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten aufzeichnet. Diese Technik hilft, eine direkte Verbindung von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene aufzubauen, die erleichtert die Untersuchung der nozizeptiven Informationsverarbeitung im Gehirn.

Gleichzeitige Aufnahmen von kortikalen lokales Feld Potentialen und Electrocorticograms in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Diese Studie präsentiert einen in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebungsansatz zur Visualisierung der Strukturen von Axonterminals mit niedriger Schwelle von Mechanorezeptoren (LTMR) in der Vorderpfotenhaut von Mäusen. Durch wiederholte, hochauflösende Bildgebung einzelner Axone bietet diese Methode eine neue Grundlage, um die Struktur und Funktion des kutanen Sinneskreises während der Entwicklung und bei Erwachsenen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung der Morphologie des berührungssensorischen Axons in der Maushaut

Lernen Sie eine Methode zur kombinierten Aufnahme mechanisch stimulierten Afferenten-Outputs und Markierung von Nervenendigungen in Maus-Haarfollikeln. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Mechanosensation in situ.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings (Video) | JoVE Journal

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

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