Fluoreszenz Zeitraffer-Bildgebung des kompletten

Das übergeordnete Ziel dieses fluoreszenzbasierten Zeitraffermikroskopieprotokolls besteht darin, eine Methode zur Untersuchung biologischer Zellprozesse bereitzustellen, die der Entwicklung und zellulären Differenzierung des sporulierenden fadenförmigen Bakteriums Streptomyces venezuelae zugrunde liegen. Die beschriebene Methode bietet eine hervorragende Plattform zur Untersuchung zellbiologischer Prozesse, die für den Lebenszyklus von Streptomyces zentral sind, einschließlich dynamischer Proteinlokalisation, polarisierten Wachstums und Sporulationsseptierung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Streptomyces venezuelae in Flüssigkeit sporiert, wodurch wir die Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung kultivieren und den gesamten Lebenszyklus mikroskopisch verfolgen können.

Diese Methode zeigt das enorme Potenzial von Streptomyces venezuelae als neues Entwicklungssystem für das Genus, da sie die Live-Zell-Bildgebung der Differenzierung eines mehrkernigen Myzels in Sporenketten ermöglicht. Beginnen Sie damit, 30 Milliliter ergänztes Wachstumsmedium mit 10 Mikrolitern Sporen des zu bildgebenden S. venezuelae-Stamms zu impfen. Um ein gleichmäßiges Wachstum und eine konsistente Sporulation der Zellen zu gewährleisten, verwenden Sie einen Schüttelkolben mit Baffeln oder einen Kolben, der eine Feder enthält, um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen.

Kultivieren Sie die Zellen 35 bis 40 Stunden bei 30 Grad Celsius und 250 U/min. Wenn fertig, sollten Myzelfragmente und Sporen mittels Phasenkontrastmikroskopie in flüssiger Präparation sichtbar sein. Zentrifugieren Sie ein Milliliter der Kultur in einer Tischzentrifuge bei 400 × g für eine Minute, um das Mycel und die größeren Zellfragmente zu pelletieren.

Überführen Sie anschließend etwa 300 Mikroliter des Überstandes, der eine Sporensuspension enthält, in ein neues 1,5-Millimeter-Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Bewahren Sie das verbleibende Kulturmedium für einen späteren Schritt auf. Verdünnen Sie danach die Sporen im Verhältnis 1 zu 20 in ergänztem Wachstumsmedium und lagern Sie die verdünnten Sporen auf Eis, bis sie benötigt werden.

Geben Sie das verbleibende Kulturmedium in einen 50-Milliliter-Becher und ziehen Sie anschließend 10 Milliliter mit einer Spritze auf. Sterilisieren Sie das verbleibende Kulturmedium durch Filtration mit einem sterilen 22-Mikrometer-Spritzenfilter, um ein verbrauchtes, ergänztes Wachstumsmedium zu erhalten, das frei von Sporen und Myzelfragmenten ist. Bewahren Sie das filtrierte, verbrauchte, ergänzte Wachstumsmedium einige Tage bei vier Grad Celsius auf, falls zusätzliche Experimente unter ähnlichen Wachstumsbedingungen durchgeführt werden sollen.

Jede mikrofluidische Platte kann für bis zu vier unabhängige Experimente verwendet werden. Um eine Kontamination der ungenutzten Durchflusskammern zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Sie sterile Lösungen und Arbeitsbedingungen verwenden, wenn Sie das Experiment vorbereiten. Beginnen Sie damit, die Versandlösung von der mikrofluidischen Platte zu entfernen.

Spülen Sie die Vertiefungen anschließend mit steriler, supplementierter Nährlösung aus. Nach dem Spülen geben Sie 300 Mikroliter der supplementierten Nährlösung in den Zulauf der Vertiefung eins und 300 Mikroliter der verbrauchten supplementierten Nährlösung in die Vertiefungen zwei bis sechs. Danach pipettieren Sie 40 Mikroliter der verdünnten Sporen in Vertiefung acht der Reihe A und verschließen das Manifold gemäß den Herstelleranweisungen an der Platte.

Starten Sie die Steuerungssoftware des Mikrofluidiksystems, und wählen Sie den geeigneten Plattentyp aus. Richten Sie ein Flussprogramm ein, um für jeweils zwei Minuten pro Brunnen Medium aus den Zulaufbrunnen eins bis fünf bei sechs psi fließen zu lassen, um den Flusskanal und die Kulturkammer zu spülen. Anschließend soll für sechs Stunden ergänztes Wachstumsmedium bei sechs psi in Zulaufbrunnen eins fließen.

Dies ermöglicht Keimung und vegetatives Wachstum. Schalten Sie das Programm nach sechs Stunden auf das verbrauchte, ergänzte Wachstumsmedium um und lassen Sie es für den Rest des Experiments mit sechs psi in die Vertiefungen zwei bis fünf fließen. Heizen Sie die Umweltkammer im Voraus auf 30 Grad Celsius vor.

Schalten Sie dann das Mikroskop und die Mikroskop-Steuerungssoftware ein. Bringen Sie ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur für die Öl-Immersion an und überprüfen Sie, ob die geeigneten Filter und die schematischen Spiegel für die Aufnahme von Differenzinterferenz-Kontrastbildern sowie die Bilder der gelben fluoreszierenden und der roten fluoreszierenden Proteinfusionen korrekt positioniert sind. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und auf die Unterseite des Abbildungsfensters auf der Mikrofluidikplatte.

Montieren Sie das versiegelte mikrofluidische Gerät vorsichtig auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops und befestigen Sie es dort sicher. Verwenden Sie die eingebetteten Positions­markierungen, um das Abbildungsfenster der mikrofluidischen Kulturkammer scharfzustellen. Fokussieren Sie zunächst den äußersten linken Bereich der ersten Durchflusskammer, die mit A gekennzeichnet ist, und bewegen Sie anschließend den Objekttisch zur Fallen­größe fünf, die einer Fallenhöhe von 7 Mikrometern entspricht.

Stellen Sie in der Mikrofluidik-Software das System so ein, dass Zellen 15 Sekunden lang bei vier psi aus dem Einlassbrunnen acht geladen werden. Nach Durchlauf des Prozesses überprüfen Sie die Zelldichte in der Kulturkammer, indem Sie den Objekttisch über das Abbildungsfenster bewegen. Falls keine Sporen eingefangen wurden, wiederholen Sie den Ladeschritt oder erhöhen alternativ den Ladedruck und/oder die Ladezeit, bis die gewünschte Zelldichte von ein bis zehn Sporen pro Abbildungsfenster erreicht ist.

Vermeiden Sie eine Überlastung der Kulturkammer. Starten Sie anschließend das zuvor vorbereitete Durchflussprogramm in der Steuersoftware und lassen Sie die mikrofluidische Platte vor Beginn der Bildaufnahme eine Stunde lang auf dem Mikroskoptisch temperieren. Richten Sie in der Mikroskop-Steuersoftware eine mehrdimensionale Aufnahme ein, um über einen bestimmten Zeitraum an mehreren Positionen des Objekttisches jeweils mehrere Bilder aufzunehmen, indem Sie zunächst ein Verzeichnis für die automatische Speicherung der Bilddateien festlegen.

Als Nächstes wechseln Sie zu den Beleuchtungseinstellungen und geben Sie die vorab festgelegten optimalen Beleuchtungseinstellungen für jeden spezifischen Konstrukt ein. Richten Sie anschließend eine Zeitreihe ein, um alle 40 Minuten über einen Zeitraum von 24 Stunden Bilder aufzunehmen. Um die Positionen des Objekttisches zu bestimmen und die Autofokus-Funktion einzustellen, scannen Sie die Kulturkammer und speichern Sie die Tischpositionen für jede gewünschte Bildaufnahmeposition.

Stellen Sie sicher, dass die Einzelpositionen des Objekttisches ausreichend weit voneinander entfernt liegen, um eine Foto-Bleiche und photochemische Toxizität zu minimieren. Sobald die Z-Koordinaten der ausgewählten Objektivpositionen überprüft sind, aktivieren Sie die hardwarebasierte Autofokusfunktion. Starten Sie anschließend das Zeitrafferversuch im Mikroskop-Steuerungssoftware.

Beenden Sie die Bildaufnahme nach 24 bis 30 Stunden oder sobald die Hyphen im interessierenden Bereich zu Sporen differenziert sind. Stoppen Sie anschließend das Durchflussprogramm in der Software und demontieren Sie das mikrofluidische Gerät. Bereiten Sie die verwendete mikrofluidische Platte für die kurzfristige Lagerung vor, indem Sie das restliche Medium aus den Zulaufbrunnen, dem Abfallbrunnen und dem Zellladebrunnen entfernen.

Füllen Sie anschließend die verwendeten Vertiefungen der Reihe A und die Vertiefungen der unbenutzten Reihen mit steriler PBS auf. Versiegeln Sie die Platte abschließend mit Parafilm, um Austrocknung zu verhindern, und lagern Sie die Platte bei vier Grad Celsius.

Die erfolgreiche Live-Cell-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus von S. venezuelae liefert eine kontinuierliche Zeitspanne, einschließlich der wichtigsten Entwicklungsstadien Keimung, vegetatives Wachstum und Sporulation. Während der Keimung oder des vegetativen Wachstums reichert sich DivIVA-mCherry ausschließlich an den wachsenden Hyphenspitzen an oder markiert neu entstehende Hyphenverzweigungsstellen. Im Gegensatz dazu bildet FtsZ-YPet im wachsenden Mycel einzeln ringförmige Strukturen in unregelmäßigen Abständen aus.

Diese Strukturen bilden das Gerüst für die Synthese nichtkonstruktiver vegetativer Querwände, die zur Ausbildung miteinander verbundener Hyphenkompartimente führt. In sporulierenden Hyphen ändert sich das Lokalisierungsmuster von FtsZ-YPet dramatisch. Zunächst bewegen sich helikale FtsZ-YPet-Filamente entlang der Hyphen, und dann, in einem plötzlichen, nahezu synchronen Ereignis, vereinigen sich diese Helices zu einer Leiter regelmäßig angeordneter FtsZ-YPet-Ringe.

Schließlich werden Sporulationssepten in den Differenzinterferenzkontrastbildern sichtbar und letztendlich werden die neuen Sporen freigesetzt. Diese Technik bietet ein robustes Protokoll für die Live-Cell-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus von Streptomyces. Das mikrofluidische System ist einfach zu bedienen.

Es bietet experimentelle Flexibilität und ermöglicht die Langzeitüberwachung der Entwicklung. Dieser experimentelle Aufbau bietet außerdem einen hervorragenden Ausgangspunkt, um spezifische Entwicklungsereignisse in Reaktion auf wechselnde Kulturbedingungen oder die Verwendung fluoreszierender Farbstoffe zur Überwachung der Mureinsynthese bzw. zur Visualisierung der Chromosomenorganisation zu untersuchen.