Name: Gentransfer in das Huhn Hörorgan von In Ovo Micro-Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Lernen Sie die modifizierte in ovo Mikroelektroporation zur Untersuchung auditorischer Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühnerhörorgan ab dem vierten Embryonaltag. Diese Methode ermöglicht gezielte genetische Manipulationen.

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Wir danken Dr. Doris K. Wu für Expressionsplasmide und in - situ - Sonden, die Johns Hopkins University Center für Sinnesbiologie Bildgebung Anlage und das Zentrum für Hören und Gleichgewicht. Diese Arbeit wurde von NIDCD Grants T32 DC000023 zu LE unterstützt

Die Eier und unhatched Embryonen werden gepflegt und ethisch und menschlich behandelt. Alle Protokolle für unhatched Embryo Verwendung durch das Animal Care und Use Committee an der Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland genehmigt. 1. Eier und Herstellung von Expressionskonstrukten <ol><li> Eier: <ol><li> Inkubieren 3-4 Dutzend befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) bei 37 ° C flach auf der Seite liegen. <ol><li> Nach 24 Stunden Inkubation ziehen 3 ccm Eiweiss mit einer Spritze aus dem runden hinteren Ende des Eis und das Loch mit durchsichtigem Klebeband abzudichten. Dies schafft eine Luftkammer zwischen dem Embryo und der Eierschale, so dass für einen leichten Zugang zu dem Embryo , ohne den Embryo an der Schale haftet , wenn für den Zugriff auf die Oberseite des Eies 19 das Fenster zu schneiden. </li><li> Bei 117 h Inkubationszeit, inszenieren die Embryonen nach Hamburger und Hamilton 20 Entwicklungsstadienbei E4 (HH24-25) (siehe Figur 1D). </li></ol></li></ol></li><li> Expressionskonstrukten: <ol><li> Bereiten Sie die Plasmid-DNA unter Verwendung von Reagenzien und das Protokoll vom Hersteller eines handelsüblichen Vorbereitung Kit zur Verfügung gestellt. Im letzten Schritt der Herstellung, eluieren die DNA in 500 ul TE (Tris-EDTA) -Puffer in dem Kit in ein 1,5-ml-Röhrchen bereitgestellt. </li><li> Ethanol ausfällen die DNA sie zu konzentrieren durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat und 1 ml 100% Ethanol zu dem Rohr. Das Röhrchen wird bei -20 ° CO / N. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 14.000 rpm bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und an der Luft trocknen das Pellet für 10 min bei RT. Auflösen des Pellets in 15 ul TE-Puffer, die eine Konzentration von ~ 4 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l ergeben sollte. HINWEIS: Die Expressionskontroll verwendeten Konstrukte sind hier Pmes-IRES-GFP 10, die von einem Huhn β-Aktin - Promotor oder pCI-H2B-IRES-RFP angetrieben wird <sbis&gt; 10, die durch den CMV - Promotor angetrieben wird. </li></ol></li></ol> 2. Huhn In Ovo Micro-Elektroporation und in - ovo - Zellproliferationstest <ol><li> In Ovo Mikroinjektion von Expression Baukonstruktion und Micro-Elektroporation: <ol><li> Ziehen die Glaskapillaren in feinen Nadeln mit einer Mikropipettenzieher mit den folgenden optimierten Parameter für eine 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Heizdraht: Druck = 500, Wärme = 600 ° C, ziehen = 64, Geschwindigkeit = 105, und Zeit = 150 ms (siehe Tabelle 1). </li><li> Die links- und rechtsgeben Mikromanipulator Stufen flankieren das Mikroskop (siehe Abbildung 1A) ein. Der Rechtshänder Mikromanipulator hält die Glaskapillare Nadel und der Linkshänder Mikromanipulator hält die Elektroden (1A). </li><li> Bereiten Sie die fein gezogen Glaskapillare Nadel für Mikroinjektion durch Schneidendie Spitze der Nadel mit einer Zange während der Arbeit unter dem Mikroskop. </li><li> Füllen Sie die Nadel manuell von Hand mit dem Mikromanipulator mit 2,5 ul von Plasmid-DNA mit 0,1% Fast Green getönt, während sie unter dem Mikroskop zu arbeiten. </li><li> Legen Sie das Ei auf der Seite liegend in einer Form / Ei Haltevorrichtung (siehe 1A). Schneiden Sie ein rundes Fenster auf dem Ei mit einer Schere 19 (1A). </li><li> Während unter dem Mikroskop arbeiten, öffnen vorsichtig die beiden Membranen den Embryo überlagert mit einer Pinzette. </li><li> Während unter dem Mikroskop arbeiten, liefern mit dem Mikromanipulator und durch Mikro-Elektroporation ca. ~ 0,5 ul von Plasmid-DNA an die richtigen Ohrbläschen Lumen durch Mikroinjektion in die rechte Hand. <ol><li> Dazu Mikro injizieren die richtigen Ohrbläschen Lumen mit der DNA mit der rechten Mikromanipulator (1B-D) , während zur gleichen Zeit die linke Hand Holdin mitga forcep den Kopf des Embryos zu stabilisieren, weil der Kopf des Embryos in der Stufe E4 eintaucht. Nicht Mikro injizieren vorbei an den Ohrbläschen Lumen, da dies das Ohrbläschen schädigen. </li><li> Unmittelbar nach der Mikroinjektion, während sie unter dem Mikroskop arbeiten, verwenden Sie die linke Mikromanipulator die positive (Anode) 2 mm Platinelektrode anterior-ventralen nach rechts Ohrbläschen und der negativen 2 mm Elektrode (Kathode) parallel zu platzieren 1 mm auseinander (Abbildung 1 C sehen). Geben Sie 4 Impulse bei 12 V mit 100 ms Dauer und 200 ms Abstand. Das linke Ohrbläschen dient als interne unbehandelten Kontrolle. HINWEIS: Reinigen Sie die Elektroden zwischen electroporations mit einem Wattetupfer getaucht in 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li> In Ovo - Zellproliferationstest: <ol><li> Unmittelbar nach der Elektroporation werden 50 ul 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS, indem manuell die 50 ul EdU Lösung auf die gesamte droppingEmbryo in ovo mit einer Pipette. Verschließen Sie die Eier mit einem Band und zurück in den Inkubator für 18-96 Std. </li><li> Sie das Band vorsichtig entfernen und nach 18 innerhalb der Ohrbläschen , die Embryonen für Fluoreszenz GFP oder RFP Signal überprüfen - 24 Stunden ein Standard - Fluoreszenzmikroskop (siehe Abbildung 1 EE &#39;) verwendet wird . Wenn Fluoreszenzsignal vorhanden ist, ernten an dieser Stelle die Embryonen für Analysen oder mit Klebeband wieder verschließen und senden Sie es für die Ernte in den Inkubator und Analysen in späteren Phasen (Abbildung 1 FP &#39;&#39; zu sehen). HINWEIS: Die Expression von GFP - Signal mit dem PME-IRES-GFP - Konstrukt ist offensichtlich , 6 - 7 Stunden nach der Elektroporation 10. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Ernten und Gewebeverarbeitung für die RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie <ol><li> Ernten Sie die Embryonen mit einer Pinzette. Spülen Sie den Embryo in kaltem 1x PBS. Entfernen Sie die Köpfe der Embryonen, durch Schneiden der Kopf durch den Halsmit einer Pinzette und legen die Köpfe in 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C. Stechen Sie das Gehirn eine forcep mit Durchdringung der 4% Paraformaldehyd im Inneren des Kopfes zu ermöglichen. </li><li> Entwässern die Köpfe in 30% Saccharose (in 1x PBS) O / N bei 4 ° C. </li><li> Montieren Sie die Köpfe in Kryoprotektivum durch schnelles Einfrieren in einem Brei aus Trockeneis und Methylbutan (2-Methyl). Alternativ frieren schneller die Köpfe in kryoprotektiver Medium mit flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die montierten Köpfe bei -80 ° C. </li><li> Kryoschnittes die Köpfe in 12 &amp; mgr; m dicke Gewebeschnitte und sammeln Sie alle Innenohr haltigen Gewebeschnitte auf superfrosted Mikroskop Objektträger aus Glas. </li><li> Führen Sie Standard - RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie , wie zuvor beschrieben 4,21 und analysieren für EdU Zellproliferation nach dem Protokoll vom Hersteller des Kits zur Verfügung gestellt. HINWEIS: Haarzellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-α-MyosinVIIa (MYO7A) ein identifiziert werden könnentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) und fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper (1: 250, Ziege anti-Kaninchen AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> 4. Bildaufnahme- und Bildverarbeitungs <ol><li> Nehmen Sie Bilder mit digitalen Bildgeräte. Bild Immunhistochemie Ergebnisse mit einem Standard - Fluoreszenzmikroskop und die Ergebnisse der in situ ein Standardweitfeldmikroskop ( im Bereich von 5x bis 40x in Vergrßerung) gemessen. </li><li> Verarbeiten Sie die Bilder mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Verfahren der in - ovo - Mikro Elektroporation wird für den Gentransfer in die Entwicklungs Hörorgan optimiert. Es ist kompatibel mit Plasmid-DNA basierenden Expressionsvektoren typischerweise verwendet, um die Genfunktion / Ausdruck zu manipulieren. Der Zeitpunkt der Elektroporation bei E4 ist für Untersuchungen optimal, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Die wichtigsten Schritte sind die DNA in das Ohrbläschen Lumen Mikrospritz ohne mit der Nadel geht zu tief und ...

Trotz der Unterschiede in der Morphologie und Zell Strukturierung zwischen Säugetieren und Vogel auditorischen Sinnesorgan, die molekularen Faktoren und Wege verantwortlich für die sensorische HC Entwicklung sind gedacht , um evolutionär 1-3 konserviert werden. Die basilar Papille, die den Gehör HCs und der sie umgebenden SCs beherbergt, entwickelt als Aussackung des Innenohrs otocyst. Früh auf einem Pool von HC und SC Vorläufern ist innerhalb der Ohrplakode / otic Tasse neuralen sensorische zuständigen Domain (NSD) angegeben. Fate-Mapping - Daten belegen , dass die neuronale und sensorischen Linien verbunden sind und von der NSD entstehen in der antero-ventralen Bereich des otic Tasse befindet oder otocyst bei Mäusen und Huhn 4,5. Zunächst delaminieren Neuroblasten aus der NSD Vorrücken in den Neuronen des auditorischen-vestibulären Ganglion zu geben, die schließlich in Hör- und Gleichgewichts Ganglien gespalten. Diese Neuronen innervieren die sensorischen HCs des Innenohrs und Kerne im Hirnstamm. Die Zellen thbei der NSD bleiben werden gedacht, Anlass zu verschiedenen Sinnes Patches zu geben, einschließlich Gehörsinnesorgan, der mechano-Umwandlungs-sensorischen HCs und ihre zugehörigen SCs aus. In den beiden Küken und Maus, Hörorgan sensorischen Vorläuferzellzyklus verlassen und HC Differenzierung treten bei Steigungen entgegenwirkt. In Küken beginnt auditorischen Vorläuferzellzyklus - Ausgang um ~ E5 und schreitet von der Basis bis zur Spitze, und vom Zentrum zur Peripherie 6. Einen Tag später HC Differenzierung beginnt im Scheitel und schreitet zu der Basis 7. Das Studium der Entwicklung des Innenohres in Huhn bietet viele technische Vorteile als Funktionsmechanismen können mit relativer Leichtigkeit in ovo im Gegensatz zu manipulieren Embryonen in utero in anderen Modellsystemen untersucht werden, die komplexe Operationen erfordert. Das hier beschriebene Verfahren nutzt in ovo Mikro Elektroporation Gene von Interesse in der vermutlichen Basila Zielr Papille Bereich anterior-ventral in dem Ohrbläschen speziell bei E4. Elektroporation in ovo ist eine Technik , die gut etabliert ist und häufig verwendet 8-14. Das Prinzip der Elektroporation Technik basiert auf der Tatsache , dass Nukleotiden (zB Plasmid - DNA, synthetische DNA oder RNA - Oligonucleotide) sind negativ geladen. Die DNA wird in das interessierende Gewebe injiziert. Wenn ein elektrischer Strom über das Gewebe gelegt wird, öffnet sich der Strom transiente Poren in den Zellwänden und ermöglicht die Aufnahme der DNA, da die negativ geladenen DNA der positiven Elektrode fließt in Richtung (Anode). Für gain-of-function Experimente werden Gene von Interesse in Expressionsplasmide gewöhnlich subkloniert, die geeigneten Expressionskassetten für das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthalten. Für loss-of-function Experimente plasmid-basierten dominant negative Repressor-Konstrukten oder RNAi oder Morpholino Konstrukte commonly verwendet 15,16. Zur Hemmung microRNA (miRNA) Funktion miRNAs Schwamm Konstrukte, die typischerweise Plasmid basiert, 17 verwendet werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die Proliferation und Differenzierung in Hörorgans steuern, wie die in ovo Mikro Elektroporationsverfahren kann leicht durch Zugabe von mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden EdU auf den gesamten Embryo. Die Elektroporation und die Zugabe von EdU bei E4 in der Ohrbläschen durchgeführt, die einen Tag vor dem Beginn der Zellzyklus-Ausgang in dem Hörorgan ist. Die Analyse des Hörorgan ist in der Regel durchgeführt, 18-96 Stunden nach der Elektroporation bei E5 (Beginn der sensorischen Vorläuferzellzyklus-Ausgang), E6 (Beginn der HC Differenzierung) und E7 (bei HC Differenzierung); und später bis ~ E9 (Ende HC Differenzierung). Dieses Elektroporation Verfahren des Gentransfers ist vergänglich etwa ~ 4 Tage dauert, because die Gene von Interesse nicht integrieren in das Genom, aber das Verfahren ist anwendbar für die Verwendung mit geeigneten Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren, die die Fähigkeit tun haben , in das Genom, beispielsweise Tol2 vermittelten Gentransfer 11 zu integrieren. Mit dieser Methode robust GFP oder RFP Ausdruck dauert ~ 4 Tage in der Cochlea, nach welchem ​​Punkt die Signale verblassen, noch bieten eine reichliche Zeitfenster die komplizierte Entwicklung des Hörorgan zu studieren. Diese in - ovo - Gentransferverfahren ist neu und ermöglicht, speziell auf die vermutliche Hörorgan bei E4 Ziel, die für die Untersuchungen optimal ist, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Es ist eine gute Ergänzung zu alternative Verfahren, die bei viel jüngeren Entwicklungsstadien 11,12 oder im Vergleich zur Verwendung von in vitro basilar Papillen Explantatkulturen 18 elektroporieren.

<table><tbody><tr><td>Steril 1x PBS pH 7,4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Pulver</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Pulver</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banane auf Micrograbber Kabelsatz</td><td>BTX Harvard Gerät</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Rechtshänder & Mikromanipulatoren für Linkshänder</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R & M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Zwei 12-mm-Tische mit magnetischen Haltevorrichtungen und vertikalen 7-Zoll-Pfosten</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metall Stahl Grundplatte 12x24 Zoll</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Schere für Eier 12 cm lang, gebogen, 12 mm extrafeine Klingen; Federschere</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette Abzieher zum Ziehen von Nadeln</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2,5x2,5 mm Box Platin Heizfilament</td><td>Sutter Instrument Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarröhrchen/-nadeln/ohne Fasern/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glasspritze 100 &mu; l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Modell 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl (schwer) für Hamilton Glasspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch zum Verbinden der Glasspritze und der Glaskappennadeln / Ungiftig</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Einwegspritzen</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Einwegnadeln 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Ein Paar 2 mm Platinelektroden</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Ein Paar Dumont Feinzange Nummer 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unsichtbares Klebeband mit mattem Finish zum Versiegeln von Eiern</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Filterspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gentransfer in das huhn hörorgan von<em&gt; in ovo</em&gt; micro-elektroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Hühnerembryonen sind ideale Modellsysteme zur Untersuchung embryonaler Entwicklung als Manipulationen der Genfunktion kann mit relativer Leichtigkeit in ovo ausgeführt werden. Das Innenohr Gehörsinnesorgan ist für unsere Fähigkeit, kritisch zu hören. Es beherbergt eine hochspezialisierte Sinnesepithel, die von mechano-Umwandlungs-Haarzellen (HC-) und der umgebenden Glia artigen Stützzellen (SCs) besteht. Trotz struktureller Unterschiede in den Gehörorgane, sind die molekularen Mechanismen , die Entwicklung des Hörorgans Regulieren evolutionär konservierten zwischen Säugetieren und Aves In ovo Elektroporation frühen Stadien bei E1 weitgehend begrenzt ist -. E3. Aufgrund der relativ späte Entwicklung des Hörorgan bei E5, Manipulationen des Hörorgan durch in ovo Elektroporation Vergangenheit E3 sind aufgrund der fortgeschrittenen Entwicklung des Hühnerembryo schwer in späteren Phasen. Die hier vorgestellte Methode ist eine vorübergehende Gentransferverfahren für Gene von Interesse Targeting anStufe E4 - E4.5 im Hühner auditorischen Sinnesorgan über in - ovo - Mikro-Elektroporation zu entwickeln. Dieses Verfahren ist anwendbar für Verstärkungs- und loss-of-Funktionen mit herkömmlichen Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren und kann durch Zugabe von EDU (5-ethinyl-2&#39;-desoxyuridin) zu den gesamten Embryo in der mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden Zeitpunkt der Elektroporation. Die Verwendung von grün oder rot fluoreszierende Protein (GFP bzw. RFP) Expressionsplasmide ermöglicht dem Experimentator, um schnell festzustellen, ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Bei diesem Verfahren wird Papier, repräsentative Beispiele für GFP elektroporiert Proben veranschaulicht; 96 Stunden nach der Elektroporation und des Hörorgans zur pro-sensorischen Bereich der GFP - Targeting wurde von RNA in situ - Hybridisierung bestätigt - Embryonen wurden 18 geerntet. Das Verfahren Papier stellt auch ein optimiertes Protokoll für die Verwendung des EdU Thymidinanalogon Zelle prolif zu analysierenration; ein Beispiel für eine EdU basierte Zellproliferationsassays, die Immunmarkierung kombiniert und klicken Sie auf EdU Chemie vorgesehen.

Bei diesem Verfahren wird DNA Papier Plasmid des grün fluoreszierenden Proteins aus (GFP) Expressionskassetten wurde in die Entwicklung von Hühner basilar Papille gezielte (BP) mit optimierten Parametern von 12 V und 4 Impulsen mit 100 msec Impulsdauer und Intervalle von 200 ms, ein Nachgeben ~ 50% Embryo-Überlebensrate und Effizienz von Plasmid-DNA in die BP-Targeting. Fluorescent Imaging von nativen GFP - Expression Embryonen in Entwicklungs zeigte diese Methode der Elektroporation ric...

Das Hörorgan vermittelt das Hören. Hier stellen wir eine modifizierte In-Ovo-Mikroelektroporationsmethode vor, die für die Untersuchung der Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühner-Hörorgan optimiert ist.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, genetische Veränderungen im sich entwickelnden auditorischen Organ des Huhns ab dem vierten embryonalen Tag durchzuführen. Dies ist von Bedeutung, da die Arbeit mit dem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium des Hühnerembryos schwierig ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie im Ei gezielt das sich entwickelnde auditorische Organ mit vergleichsweise geringem Aufwand anspricht, im Gegensatz zu anderen Methoden, die komplexe Operationen in utero erfordern.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der auditorischen Sinnesentwicklung zu beantworten, beispielsweise, wie räumliche und zeitliche Muster der Proliferation sensorischer Vorläuferzellen und deren Differenzierung koordiniert werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, befestigen Sie die Glas-Kapillarnadel mithilfe des Schlauchs, der mit der Glas-Spritze verbunden ist und am rechten Mikromanipulator angebracht wird, und platzieren Sie die Elektroden am linken Mikromanipulator.Unter dem Mikroskop die Nadelspitze mit einer Pinzette abschneiden. Anschließend 2,5 Mikroliter Plasmadna, angefärbt mit 0,1 % Fast Green, in eine Petrischale geben. Die Nadel mithilfe des Kolbens der am rechten Mikromanipulator befestigten Spritze mit Plasmadna füllen.Legen Sie ein Ei seitlich in eine Haltevorrichtung. Schneiden Sie dann mit einer Schere eine runde Öffnung auf der Oberseite des Eis. Danach stellen Sie das Ei in der Haltevorrichtung unter das Mikroskop.Öffnen Sie vorsichtig mit einer Pinzette die beiden das Embryo überlagernden Membranen, um die rechte Ohrbläschenanlage freizulegen. Stabilisieren Sie dabei mit der linken Hand den Kopf des Embryos mit der Pinzette und geben Sie mit dem Mikromanipulator der rechten Hand etwa 0,5 Mikroliter Plasmadna ab. Achten Sie darauf, nicht hinter das Lumen der Ohrbläschenanlage zu injizieren, da dies die Ohrbläschenanlage beschädigen würde.Das Mikroinjizieren von DNA in das Lumen der Ohrbläschen, ohne diese zu beschädigen, ist entscheidend und erfordert die Verwendung beider Hände. Unmittelbar nach der Mikroinjektion verwenden Sie den mit der linken Hand bedienten Mikromanipulator, um das zwei Millimeter umfassende Platinelektrodenset mit positiver und negativer Elektrode ventral vor dem rechten Ohrbläschen zu positionieren, und geben Sie vier Impulse bei 12 Volt durch Bedienung des Elektroporators ab. Die genaue Platzierung der Elektroden im ventralen vorderen Bereich des vermuteten Gehörorgans ist wichtig und gewährleistet, dass das sich entwickelnde Gehörorgan gezielt angesprochen wird.Unmittelbar nach der Elektroporation 50 Mikroliter EdU auf das gesamte Embryo in ovo geben. Danach das Ei mit Klebeband verschließen. Alle manipulierten und verschlossenen Eier für 18 bis 96 Stunden in den Inkubator zurückbringen.Nach 18 bis 24 Stunden vorsichtig das Klebeband entfernen. Die Embryonen mittels eines Standard-Fluoreszenzmikroskops auf fluoreszierendes GFP- oder RFP-Signal innerhalb des Ohrbläschen prüfen. Falls ein fluoreszierendes Signal vorhanden ist, die Embryonen für Analysen entnehmen oder erneut mit Klebeband versiegeln und für spätere Stadien zur Inkubation zurückbringen, um sie dann zu einem späteren Zeitpunkt zu entnehmen und zu analysieren.Die RNA-in-situ-Hybridisierung wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Elektroporation den auditorischen Bereich des sich entwickelnden Innenohrs erfolgreich erreicht hatte. Innerhalb des sich entwickelnden BP wurden sensorische Vorläuferzellen anhand ihrer Expression von Sox2 und Lunatic Fringe identifiziert. Diese Bilder zeigen, dass sensorische Vorläuferzellen im gesamten sich entwickelnden BP an der Basis und der Spitze erfolgreich gezielt wurden und 68 Stunden nach der Elektroporation GFP exprimierten.Außerdem wurde GFP außerhalb der sensorischen Domäne in nicht-sensorischen epithelialen Zellen und im auditorischen Ganglion, markiert durch Neurod1-Expression, exprimiert. Um das proliferative Verhalten sensorischer Vorläuferzellen zu bestimmen, wurde EdU, ein Thymidin-Analogon, zum Zeitpunkt der Elektroporation am Embryonaltag vier zugegeben, und vier Tage später wurde die EdU-Inkorporation im sich entwickelnden BP in Gewebeschnitten analysiert. Die Immunfärbung für das haarzellspezifische Protein Myosin7a diente der Identifizierung differenzierender Haarzellen im sich entwickelnden BP. Im apikalen Bereich des BP waren Myo7a-positive Haarzellen häufig EdU-positiv.Während im Basalbereich nur wenige Myo7a-positive Haarzellen EdU eingebaut hatten, was darauf hindeutet, dass sensorische Vorläuferzellen im Basalbereich zum Zeitpunkt der EdU-Zugabe am Embryonalstadium vier bereits weitgehend postmitotisch sind. Nach Beherrschung der Technik kann diese innerhalb von fünf bis acht Minuten pro Ei abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, frisch zubereitete und sterile Reagenzien zu verwenden, um das Überleben der Embryonen sicherzustellen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können die Methodenparameter modifiziert werden, um andere Phänomene im sich entwickelnden Innenohr zu untersuchen, wie beispielsweise die Entwicklung der vestibulären Organe und die Neurogenese im Innenohr. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet des Innenohrs die Möglichkeit, das vergleichsweise spät entwickelte auditorische Organ des Huhns gezielt ab dem vierten embryonalen Tag und danach zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Hühnerembryo sachgerecht handhabt, Mikroinjektionen und Elektroporationen durchführt sowie den in ovo-Zellproliferationsassay durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Küken in ovo Elektroporation ist eine Technik, die genetische Manipulation der Vogelembryo ermöglicht. Typische Anwendungen für diese Technik sind die funktionelle Analyse von Genen und vermeintlichen Enhancer-Elemente. Dieses Video zeigt Neuralrohr Elektroporation in HH 10 Hühnerembryonen. Injektionstechnik und ordnungsgemäße Eibehandlung werden diskutiert.

In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren...

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die...

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Verfahren zum Gentransfer in Hühnerembryos in späteren Stufen der Inkubation (älter als Hamburger und Hamilton Stufe (HH) 22) beschrieben. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile...

Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere<em&gt; Ex ovo</em&gt; Die Elektroporation

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt.  Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.

Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

Lernen Sie die modifizierte in ovo Mikroelektroporation zur Untersuchung auditorischer Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühnerhörorgan ab dem vierten Embryonaltag. Diese Methode ermöglicht gezielte genetische Manipulationen.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von

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