Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Das übergeordnete Ziel dieses einfachen, zellbasierten Bioassays ist es, die Aktivität von Mitgliedern der Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren von Liginen zu detektieren, zu quantifizieren und zu überwachen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in der Gefäßbiologie, Virologie, Krebs und Augenheilkunde beantworten, wo die Ligine der VEG-FR-Familie Schlüsselprozesse bei diesen Erkrankungen ausstrahlen. Der Hauptvorteil dieses Assays besteht darin, dass er die Bewertung von Liginen der VEG-FM-Familie im Hinblick auf ihre Fähigkeit ermöglicht, ihre verschiedenen Rezeptoren zu binden und zu vernetzen, ohne dass spezialisierte Epithelzellen erforderlich sind.

Die IL3-sezernierende Zelllinie WEHI-3D wird durch Pipettieren von fünf mal zehn bis sechsten Zellen im logarithmischen Gesicht des Wachstums in vier bis zehn T175-Fläschchen mit 50 Millimetern frischem Kulturmedium kultiviert. Inkubieren Sie sieben Tage lang oder bis die Zellen ihre logarithmische Wachstumsphase um etwa 24 bis 48 Stunden überschritten haben. Die Flüssigkeit und die Zellen aus den Kolben dekantieren.

Und drehen Sie sich 15 Minuten lang mit 1.000 g, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie dann die oberen 90 % des Supernaytents und filtern Sie es durch eine 0,22-Mikron-Filtereinheit. Aliquotieren Sie das konditionierte Medium in ein Milliliter-Aliquote für die Assay-Vorbereitung.

50 Milliliter Aliquots für die Herstellung von Kulturmedium zur Passage zu einem faktorabhängigen Zelllinien und 200 Milliliter Volumen für die Langzeitlagerung bei 20 Grad Celsius. Lagern Sie die kleineren Volumina bei 20 Grad Celsius. Kulturkontrolle BAF3-Zellen in Kulturmedien mit 10 % WEHI-3D-konditioniertem Medium.

und VegFR2-EPoR-BAF3-Zellen im selben Medium plus einem Milligramm pro Milliliter G418. Passagezellen mit einer bis 15 Verdünnungen aus Zellen, die in der logarithmischen Phase wachsen. Ernte von BAF3- oder VegFR2VPoR-BAF3-Zellen für Kulturen in der mittleren logaritären Phase.

Durch vorsichtiges Pipettieren zur Entnahme der Zellen vom Boden des Kolbens wird die Zentrifuge fünf Minuten lang bei 750 g zentrifugiert, um Zellpellets zu gewinnen. Das Pellet in 10 Millilitern Maus-Tonizität, phosphatgepufferter Kochsalzlösung erneut suspendieren und erneut fünf Minuten lang bei 750 g zentrifugieren. Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male, um IL3-haltiges Medium zu entfernen.

Waschen Sie die Zellen einmal mit einem Medium ohne DEHI-3D-konditioniertes Medium. Es ist wichtig, das IL3-haltige Kulturmedium wegzuspülen, um sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren zurückbleiben, die zu einem falsch positiven Ergebnis oder einer hohen Hintergrundaktivität führen könnten. Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Supernaytens resuspendieren die Zellen in demselben freien IL3-Medium in einer Konzentration von 7,4 mal 10 bis zur vierten Zelle pro Milliliter.

Mischen Sie schließlich gleiche Volumina Trypanblau in PBS mit einer Zellpopulation und laden Sie es in ein Hämazytometer. Zählen Sie mindestens 100 Zellen. Zellen, die den Farbstoff aufnehmen, gelten als tot oder sterbend.

Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die für den Assay verwendeten Zellen eine hohe Lebensfähigkeit aufweisen, um sicherzustellen, dass sie in der Lage sind, auf ihre Assay-Bedingungen zu reagieren. Verwenden Sie eine gut kalibrierte automatisierte P20-Pipette und autoklavierte Spitzen, um 1.000 Zellen in 13,5 Mikrolitern IL-defizientem Medium in die Wells einer 72-Well-Platte zu geben. Achten Sie darauf, die Zellsuspension während der Aliquotierung zu mischen, um sicherzustellen, dass die Zellablagerung durch die Schwerkraft die Zellkonzentration nicht verzerrt.

Verwenden Sie eine gut kalibrierte P2-Pipette, um 1,5 Mikroliter freies IL3-Medium in dreifacher Ausfertigung in die Kontrollvertiefungen zu geben. Kompliziertheit zum Mischen. Geben Sie auf die gleiche Weise das 10%ige WEHI-3D-konditionierte Medium und die 100 Nanogramm pro Milliliter VegFA no IL3-Kontrolle in die gewünschten Vertiefungen.

Zum Schluss geben Sie 1,5 Mikroliter der Testproben in dreifacher Ausfertigung hinzu. Füllen Sie alle unbenutzten Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit sterilem Wasser, PBS oder Medium. Legen Sie wassergetränktes Seidenpapier in einen gasdurchlässigen Behälter, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen, die den Gasaustausch ermöglicht.

Inkubieren Sie die Assay-Platten in den Kammern 16 Stunden lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10 % Kohlendioxid. Nach 16 Stunden Inkubation analysieren Sie die Platten mit einem Standard-Inversphasenmikroskop bei 40- bis 100-facher Vergrößerung. Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, zwischen positiven und negativen Proben zu unterscheiden.

Vertiefungen ohne Unterstützung von Wachstumsfaktoren oder mit Medium allein weisen eine reduzierte Anzahl von runden Zellen sowie toten oder absterbenden Zellen und Zelltrümmern auf. Während Zellen, die mit Medium inkubiert werden, das IL3 oder Ligin für VegFR2 enthält, groß und durchscheinend sind und es keine oder nur minimale Hinweise auf Granularität im Zellzytoplasma oder in Zelltrümmern in der Kultur gibt. Geben Sie 10.000 gewaschene Zellen in 135 Mikrolitern IL3-defizientem Medium in die Vertiefungen einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen.

Verwenden Sie eine kalibrierte P20-Pipette, um 15 Mikroliter der Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen zu geben. Inkubieren Sie die Mischung aus Zellen, Wachstumsfaktoren und/oder Inhibitoren wie zuvor für 48 Stunden. Nach Abschluss der Inkubationszeit ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen in den Vertiefungen unter Verwendung der im schriftlichen Teil des Protokolls beschriebenen Methoden zu bewerten.

Hier sind die Ergebnisse eines Assays dargestellt, in dem der VEGF-R2 EPoR BAF3 Bioassay verwendet wird, um die Aktivität der drei liegenden humanen Ligine mit Spezifität für VEGF-R2 zu quantifizieren. VEGF-A165, VEGF-C und VEGF-D. Die Aktivität wurde in Gegenwart von Bevacizumab, einem inhibitorischen monoklonalen Antikörper gegen VEGF-A165, oder in Gegenwart von Trastuzumab, einem nicht-neutralisierenden Antikörper, quantifiziert.

Die Daten wurden im Vergleich zum Ansprechen auf VEGF-A165 allein normalisiert. Wie erwartet blockierte Bevacizumab die Wirkung von VEGF-A165 im Assay, hatte aber keinen Einfluss auf die Aktivität von VEGF-C und VEGF-D. Zellen, die IL3 ausgesetzt waren, waren sehr lebensfähig.

Diejenigen, die keinem zusätzlichen Wachstumsfaktor ausgesetzt sind, weisen eine schlechte Lebensfähigkeit auf. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, zu bedenken, dass es sich um eine Reihe von Bekämpfungsmitteln in konditionierten Medien handelt, die vor dem Assay erzeugt werden müssen. Diese Technik ebnete den Weg für das Wiederaufleben der Gefäßbiologie, Virologie, Krebs und Opthomologie, um die Rolle von VEG-FM in Liginen zu erforschen.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bioassay-Zellen vorbereitet, den Bioassay durchführt und die quantitativen oder semiquantitativen Analysen der VEG-FM-Liginaktivität durchführt.