Name: Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation zur Untersuchung epigenetischer Regulation bei der Herzdifferenzierung von embryonalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen spezifischer DNA-Loci.

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Die Autoren danken den Förderorganisationen, dem IMI StemBANCC European Community Programm, der leducq Foundation (SHAPEHEART) und der Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-Protein-Quervernetzung <ol><li> Fix in 15 - ml - Röhrchen geerntet-ES - Zellen (2 × 10 6 Zellen für regelmäßige ChIP, 2 x 10 5 Zellen für Mikrochip), Embryoidkörpern (EVG) erzeugt aus ES - Zellen und embryonalen Herzgewebe seziert von E9.5 Mausembryonen (atrioventricular Kanal, Ausflusstraktes und Ventrikel) mit 1% Formaldehyd in PBS für Zellen oder in Permeabilisierung PB2 Puffer für embryonalem Gewebe. Die Röhrchen auf Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 rpm bei Raumtemperatur für genau 10 min. </li><li> Beenden Sie die Vernetzungsreaktion durch Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM Zugabe und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur auf dem Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 2. Zellyse und Chromatin Fragmentation <ol><li> Zweimal waschen vernetzte resuspendierten Zellen in 10 ml PBS 1x oder embryonale in 1 ml PB2 resuspendiert Gewebe. Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen. &lt;/ Li&gt; <li> Hinzufügen , Proteaseinhibitoren PB1 oder PB2 zu puffern (2 ug / ml Leupeptin, 1 &amp; mgr; g / ml Aprotinin und 0,1 mM PMSF) (Tabelle 1). Zellpellet oder embryonalem Gewebe aus Schritt 2.1 in 1 ml Puffer PB1 bzw. PB2. Pipettieren auf und ab und die Zellen oder Gewebe resuspendieren. Verwenden, um eine 1 ml Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel Zellen oder Gewebe zu homogenisieren. Inkubieren bei 4 ° C (auf ein Rad) für 10 min. </li><li> Spin down bei 3000 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 300 ul jeweiligen SB - Puffer (Tabelle 1) in ein sauberes Röhrchen mit Protease - Inhibitoren ergänzt (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) jede DNA - Abbau zu verhindern. Inkubieren für 15 bis 30 Minuten auf Eis. </li><li> Beschallen die Proben bei 4 ° C , um das Chromatin mit einem Beschallungsgerät gemäß Programmen in Tabelle 2 für jedes Material aufgeführt abzuscheren. Stellen Sie Beschallungsdauer in Abhängigkeit von der nächsten Anwendung (&lt;em&gt; dh PCR oder Sequenzierung). Geschoren DNA Größe sollte für die PCR und 300 bp für die Sequenzierung etwa 500 bp. </li><li> Zentrifuge beschallt für 10 min Zelllysat bei 6.000 × g bei 4 ° C, den Überstand (chromatin) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen und das Pellet verworfen. </li><li> Man verdünnt das Chromatin in Lösung (Überstand Puffer B) für 10-mal mit Wasser und zu beurteilen, um die optische Dichte unter Verwendung von 1,5 &amp; mgr; l in einem Nano-Spektralphotometer. Besorgen Sie sich die Konzentration von Proteinen in ug / ul der folgenden Formel berechnet: 1,55 x OD 280 bis 0,76 x OD 260. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Puffer </td><td> Nutzung </td><td colspan="4"> Zusammensetzung </td><td> Materialien </td></tr><tr><td rowspan="2"> EIN </td><td rowspan="2"> Permeabilisierungs </td><td colspan="4"> PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 </td><td> Alle </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl 2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100 </td><td> Embryonale Gewebe </td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3"> Lysis / Beschallen </td><td colspan="4"> SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% Desoxycholat; 0,1% SDS </td><td> EBs </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% Laurylsarcosin </td><td> Embryonale Gewebe </td></tr><tr><td> C </td><td> ChIP-Puffer </td><td colspan="4"> 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. </td><td> Alle </td></tr><tr><td> D </td><td> DNA / Protein-Elution </td><td colspan="4"> D1: 1% SDS; 100mM NaHCO3 D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA-Bindungs ​​Perlen Vorbereitung </td><td colspan="4"> E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. ChIP - Puffer. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stoff </td><td> Ultraschall - Behandlung Programm </td></tr><tr><td> Embryonische Stammzellen </td><td> 15 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF </td></tr><tr><td> Embryoidkörpern </td><td> 30 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF </td></tr><tr><td> embryonalem Gewebe </td><td> 21 Zyklen von 30 sec und 30 sec OFF </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ultraschall - Behandlung Programme. 3. Immunpräzipitation undWäscht <ol><li> 3 x waschen Protein A-konjugierten Perlen mit Puffer C. Nehmen Sie 100 ul Kügelchen in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen und 1 ml Puffer C (Tabelle 1). Das Rohr wird dann auf einen Magneten übertragen; mindestens 1 Minute warten und den Überstand aspirieren. Zweimal wiederholen den Waschschritt. </li><li> Inkubieren Antikörper , der gegen modifizierte Histone oder Transkriptionsfaktors (Konzentrationen in Tabelle 3) mit 20 &amp; mgr; l gewaschener Protein - A - konjugierten Perlen und 1 ml Puffer C mit Protease - Inhibitoren in ein sauberes 1,5 - ml - Röhrchen ergänzt. Stellen Sie die Proben auf einem Rotator bei 40 Upm für mindestens 2 h bei 4 ° C. </li><li> Wash-Antikörper-Kügelchen-Komplexen 3-mal mit 1 ml Puffer C (manipulation in 3.1 beschrieben). </li><li> Bereiten Sie zwei Röhren, ein Gehalt von 150 ug Chromatin und Antikörper-Perlen-Komplexe und das andere Röhrchen mit 150 ug des Chromatins und 20 ul gewaschenen Perlen; 1 ml Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren zu jedem Röhrchenund inkubiere die Proben auf einem rotierenden Rad bei 40 rpm über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Die Konzentration des Chromatins mindestens 300 &amp; mgr; g sein müssen, ein Transkriptionsfaktor oder für sequentielle ChIP immunpräzipitieren. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Standard </td><td> Konzentration (ng / ul) </td><td> Volumen (ul) </td><td> Die Gesamt - DNA - Konzentration (ng) </td></tr><tr><td> EIN </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 2,50 </td><td> 1 </td><td> 2,50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1,25 </td><td> 1 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0,625 </td><td> 1 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0,3125 </td><td> 1 </td><td> 00,3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0,156 </td><td> 1 </td><td> 0,156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Standards Konzentrationen. 4. DNA-Elution, Querlenker-Reversal und Proteinase K Digestion <ol><li> Stellen Sie die Proben in der magnetischen Rack. Gewinnen Sie den Überstand ungebundenen Antikörper Chromatin enthält. HINWEIS: Die Proben können rasch in diesem Schritt und gelagert bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Chromatin kann in anderen Immunpräzipitationstests mit anderen Antikörpern verwendet werden. Waschen jeder Probe 3 mal mit 1 ml Puffer C (manipulation zuvor beschrieben). </li><li> Eluieren des Antikörper-gebundenen Proteins durch Zugabe von 150 ul Puffer D1 oder D2 , falls sequentieller ChIP (Tabelle 1) gewaschen ChIP Materialien und Inkubation für 20 min die Proben bei 50 ° C in einem Heizblock durchgeführt werden muss. </li><li> Entfernen Sie Rohre ausder Heizblock und setzen Proben in der Magnetträger, erholen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) und die Perlen zu verwerfen. </li><li> Verwenden Überstand für eine sequentielle ChIP Zugabe von 1 bis 3 ug des zweiten Antikörpers in 2 Volumina Puffer C oder Rückwärtsvernetzungs durch Zugabe von 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM zu erhalten. </li><li> Vorbereiten eines Eingangsabtastwert von Chromatin in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei) die gleiche Menge an Chromatin wie die der IP-Probe (150 ug) in einem Endvolumen von 150 &amp; mgr; l Wasser unter Berücksichtigung (RNase DNase freies Wasser). Hinzufügen 5M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 200 mM. Inkubieren Proben über Nacht bei 65 ° C. </li><li> Am nächsten Tag entfernen Proben aus dem Heizblock, fügen 250 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 mM und Proteinase K zu erhalten, um eine Endkonzentration von 250 ug / ml in dem Chip-Material zu erhalten und für 2 Stunden in die auf 55 ° C verdauen Heizblock. </li></ol><ol><li> Herstellung von Perlen <ol><li> Starten Sie die Perlen bei Raumtemperatur zu bringen, für mindestens 30 Minuten, Wirbel die Kügelchen sehr gründlich. Perlen sesshaft, so schnell arbeiten beim Pipettieren. 1 ml der Perlen in sauberes 1,5-ml-Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei). </li><li> Auf Magnet, warten Sie 2 - 3 min für die Lösung zu klären, Überstand verwerfen. Entfernen von Magneten, 1 ml 0,5 M EDTA und mischen durch kurzes Vortexen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.1.2 zweimal und Überstand verwerfen am Ende. </li><li> Entfernen von Magneten, 1 ml Puffer E und resuspendieren langsam die Perlen. Übertragen Sie die ganze Mischung (Perlen in Puffer E) in 50 ml Puffer E. Platz auf einem Schüttler und lassen Sie es für 1 Stunde bei Raumtemperatur langsam mischen. </li><li> Test-DNA-bindenden Perlen nach dem Reinigungsprotokoll unter Verwendung von 3 beschriebenen experimentellen Bedingungen: 50 ul Perlen / 50 ul DNA (1 Volumen / 1 Volumen) wurden 100 ul Perlen/ 50 &amp; mgr; l DNA (2 Bände / 1 Volumen) und 125 &amp; mgr; l Perlen / 50 ul DNA (2,5 Volumen / 1 Volumen). Lassen migrieren gereinigter DNA auf einem 1,5% Agarosegel der Größe der Bruchstücke (1A) zu überprüfen. </li></ol></li><li> DNA Purification <ol><li> In 425 ul (2,5 Volumen) von DNA-bindenden magnetischen Kügelchen zu jeder DNA-Probe (etwa 170 ul). Resuspendieren langsam durch Pipettieren auf und ab (ca. 10 mal) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Setzen Sie auf Magnet für 5 Minuten, dann Überstand aspirieren und verwerfen (auf Magnet). </li><li> In 600 ul frisch aus 80% Ethanol auf das Rohr auf dem Magneten, mindestens 1 Minute warten, absaugen Überstand und zu verwerfen und dann den vorherigen Schritt wiederholen noch einmal. </li><li> Geben Sie eine schnelle Runde, für 5 Sekunden (Mikrofuge), legen Sie den Schlauch auf dem Magneten und entfernt die letzten Tropfen Ethanol. Trocknen lassen für 1 min bei RT </li><li> Eluieren der DNA durch Zugabe von 20 &amp; mgr; l DNase RNase freies Wasser. Entfernen von Magnet und die Probe vortexen. </li><li> Inkubieren für 3 Minuten bei Raumtemperatur und dann legen Proben auf Magneten. Absaugen eluierte DNA in ein neues Röhrchen (zertifiziert RNase-, DNase- und pyrogenfrei). </li><li> Führen Sie die DNA aus dem Eingangsfraktion auf einem 1,5% Agarosegel der Größe von DNA - Fragmenten (1B) zu überprüfen. </li></ol></li></ol> 6. DNA-Quantifizierung mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektionsinstrument <ol><li> Serienmäßig in der DNA - Wasser 1 ug (1 kb Leiter) verdünnen insgesamt 7 Verdünnungen zu geben , sowie eine nicht-DNA - Punkt (Verdünnungen in der Tabelle gesammelt 3). </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von PCR-Green I-Farbstoff, ausreichend für alle Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH): verdünnen Sie die Grüne Farbstoff in 1x TE-Puffer 10.000fach. </li><li> 1 ul jeder DNA-Proben (gereinigte DNA und Standardverdünnungen AH) bis 10 &amp; mgr; l 1x grünen Farbstoff-Mix in Kapillaren Küvetten in einem Fluorimeter bei 488 nm Wellenlänge gelesen werden. Für die nicht-DNA-Test, verwenden Sie 1 ul des 1x TE-Puffer. </li><li> Baueneine Kalibrierungskurve eine Grafik-Software und die relativen Konzentrationen auf den Bereich von DNA-Proben in ng / &amp; mgr; l bestimmen. Die DNA wird dann bereit für PCR oder Sequenzierung Bibliotheken zu machen. </li></ol> 7. PCR <ol><li> Die Auswahl der Primer <ol><li> Design-Primer von Interesse, die genomischen Regionen von Interesse abzufragen. Design-Primer Enhancer-Regionen von Genen unter Verwendung des UCSC Genom-Browser zu verstärken. Enhancers werden voraussichtlich auch H3K4me1 oder p300 ChIP-seq 9 Daten in GEO Datensatz. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Run-PCR-Reaktionen für 45 Zyklen (8 sec 95 ° C, 8 sec 60 ° C, 8 sec 72 ° C) unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Thermocycler in 25 ul grünen Farbstoff-Mix, 2 ng DNA und 0,5 &amp; mgr; l Primer-Gemisch (20 uM Stammlösung) 10. </li></ol></li><li> Die Analyse der Anreicherung <ol><li> Berechnen Absolute Anreicherungs vorausgesetzt, wurden 11 höchstens 1% der Nukleosomen immunpräzipitiert. </li><li> consider die genomische als angereichert, wenn 10 ng IP Proben eine größere Anreicherung zeigen, wenn auf 0,1 ng Input-DNA verglichen. </li><li> Express-Ergebnisse als fache Erhöhung der Anreicherung über eine nicht angereicherten Bereich nach der Normalisierung mit dem Eingang und Einstellung mit einem unspezifischen Kontrollprobe. </li><li> Betrachten wir die Eingangs DNA von 100 (Verdünnungsfaktor oder DF) verdünnt werden. </li><li> Normalisieren der Eingang mit der folgenden Gleichung 2 -ΔCt x 100%, wobei -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF]. </li><li> Passen Sie Steuerung mit Hilfe der folgenden Gleichung (ACt [IP] -ΔCt [NS]), wobei NS die unspezifische Probe (keine Antikörper IP oder IgG IP). </li><li> Berechne den fache Anreicherung der Probe als 2 -ΔΔCt. Eine Datei mit allen Schritten von Berechnungen mit den Formeln in denen nur jede PCR Probe eingegeben werden kann, wird die Analyse der Ergebnisse zu erleichtern. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+and+remodellers%3A+regulators+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li>
<li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li>
<li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li>
<li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749(2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li>
<li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li>
<li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen. ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet. Dies h...

<html> Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder 1 entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen Regulationsregionen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die Modifikationen wie Acetylierung unterworfen sind, Methylierung, Ubiquitinierung und / oder Phosphorylierung. Histonmodifikation führt zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen - Transkription in Abhängigkeit von dem Lysin - Rest von Histon 2 modifiziert. jove_content &quot;&gt; Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde Jahre angelegt 3 vor und ist derzeit das am weitesten verbreitete Technologie, um Ziele von entweder modifizierten Histone oder Transkriptionsfaktoren zu identifizieren , 4. Nach Immunpräzipitation von Histonen oder Transkriptionsfaktoren können gebundene DNA sein entweder amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder sequenziert. ChIP ist technisch herausfordernder Gelretardationsassays 5 überwinden. jedoch ChIP keine direkte bedeutet die Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA, ein Vorteil Gelretardation Assays. auf der anderen Seite, ChIP kombiniert, um die DNA-Sequenzierung hat eine neue genomweite Perspektive auf die Genregulation geöffnet. ES - Zellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh., Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur die frühen Schritte der Herzentwicklung 6 und bieten im Prinzip genügend Material für ChIP. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine menschliche Zellmodell von cardiogenesis obwohl ihr kardiogenen Potential hängt von ihrer epigenetischen Signatur 7. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonale Mausgeweben für spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich zu untersuchen. Jedoch wird das Genom in einer zeit- und zelltypspezifisch 8 transkribiert. Epigenetische Regulation der Gen-Transkription hat in lokalisierten Regionen untersucht werden. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, gefolgt sequentielle ChIP durch PCR oder Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Zellfixierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Cross-Link Stop</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Proteasen Inhibitor</td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisulfat</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Proteasen Inhibitor</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Proteasen Inhibitor</td></tr><tr><td>Protein A magnetische Kügelchen</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Immunpräzipitation</td></tr><tr><td>SPRI magnetische Beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>Proteinverdauung&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR Standard&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Kalibrierbereich&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber green</td><td>Molecular Probes</td><td>S-11484</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>TE-Puffer&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Lebenstechnologien</td><td>14190-094</td><td>Waschen</td></tr><tr><td>DNase RNase freies Wasser</td><td>Lebenstechnologien</td><td>10977-035</td><td>Verdünnung</td></tr><tr><td>Axygen Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifikt</td></tr><tr><td><stark>Antikörper&nbsp; </td><td>Unternehmen</td><td>><Reference<</td><td>strong>ChIP-Konzentration</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &micro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &micro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &micro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 & Mikro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &micro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Gewebe</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &micro; g für Regler und EBs, 1 & Mikro; g für Taschentücher</td></tr></tbody></table>

epigenetische regulation der herz differenzierung von embryonalen stammzellen und gewebe

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

1A stellt zunächst die Herstellung von DNA-bindenden Perlen und Qualitätskontrolle unter Verwendung von DNA in verschiedenen Größen (1 kb Leiter). 0ne, 2 und 2,5 Volumina (1 bis 3) der Kügelchen wurde zu einem Volumen der Probe hinzugefügt hohem und niedrigem Molekulargröße DNA-Fragmente zu reinigen. Figuren 1 B, C, D sind typische Beispiele für DNA - Gelen von Voll beschallter DNA extrahiert ...

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Das übergeordnete Ziel, diese Chromatin-Immunpräzipitationsansätze auf differenzierende embryonale Stammzellen oder embryonales Herzmuskelgewebe anzuwenden, besteht darin, die epigenetische Regulation der Herzentwicklung aufzuklären. Da die feine Abstimmung der Genexpression während der embryonalen Herzentwicklung durch epigenetische Komponenten gesteuert wird, eignet sich die Chromatin-Immunpräzipitation als geeignete Methode, um diesen Prozess zu verstehen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir gezielt einen Locus ansprechen und die epigenetischen Markierungen untersuchen können, die auf diesem spezifischen DNA-Abschnitt sitzen. Diese Methode kann Einblicke in die epigenetische Regulation der Herzentwicklung liefern. Sie kann außerdem auf andere Organe oder beliebige Zelltypen angewendet werden.Dies ist Imen. Sie ist Doktorandin im Labor und wird heute das Experiment durchführen. Dieses Verfahren nutzt embryonale Stamm- oder ES-Zellen.Aus ES-Zellen erzeugte Embryoidkörper und aus E9,5-Maus-Embryonen isoliertes embryonales Herzmuskelgewebe. Fixieren Sie die Zellen und Gewebe. Verwenden Sie 1 % Formaldehyd in PBS für die Zellen und PB2-Permeabilisierungspuffer für das embryonale Gewebe.Stellen Sie die Röhrchen auf einen Rotationswellen-Shaker und schütteln Sie sie 10 Minuten lang genau bei 60 U/min bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Vernetzungsreaktion, indem Sie Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 Millimolar hinzufügen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Rotationswellen-Shaker bei einer Geschwindigkeit von 60 U/min. Um dieses Verfahren zu beginnen, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS.Und die embryonalen Gewebe in ein Milliliter PB2. Zentrifugieren Sie bei 1000 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie den jeweiligen Puffer für eine zweite Wäsche hinzu.Fügen Sie Proteaseinhibitoren den Puffern PB1 und PB2 auf Eis hinzu. Geben Sie ein Milliliter Puffer PB1, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zum Zellpellet und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen zu resuspendieren. Resuspendieren Sie auf die gleiche Weise das embryonale Gewebe in einem Milliliter Puffer PB2, ergänzt mit Proteaseinhibitoren.Anschließend die Zellen oder Gewebe mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel homogenisieren. Die Zellsuspension in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die homogenisierten Zellen und Gewebe bei vier Grad Celsius zehn Minuten lang inkubieren.Zentrifugieren bei 3000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 300 µL des jeweiligen Sonikationspuffers, ergänzt um Proteaseinhibitoren. Überführen Sie die Zellsuspension in eine zertifizierte, RNase-, DNase- und pyrogenfreie Röhrchen, um jeglichen DNA-Abbau zu verhindern, und inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten auf Eis.Um die Chromatin zu fragmentieren, beschallen Sie die Proben bei vier Grad Celsius unter Verwendung des geeigneten Beschallungsprogramms für jedes Material. Passen Sie die Dauer der Beschallung an, abhängig davon, ob die DNA für die PCR oder die Sequenzierung verwendet wird. Zentrifugieren Sie anschließend die beschallten Zelllysate 10 Minuten lang.Überführen Sie das Überstand, der die in Lösung befindliche Chromatin darstellt, aus jeder Probe in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen und verwerfen Sie das Pellet. Entnehmen Sie ein 1,5-Mikroliter-Aliquot jeder Probe und verdünnen Sie es 1:10 mit Wasser. Bestimmen Sie die optische Dichte aller Proben in einem Nano-Spektrophotometer, um die Protein-konzentration zu ermitteln.Vor der Chromatin-Immunpräzipitation Protein A-gekoppelte Kügelchen vorbereiten, indem sie gemäß dem Protokolltext gewaschen werden. In einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen den gegen modifizierte Histone oder Transkriptionsfaktoren gerichteten Antikörper, 20 µL der gewaschenen Protein A-gekoppelten Kügelchen und ein Milliliter Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zusammengeben. Die Proben auf einem Rotator bei 40 U/min mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.Die Antikörper-Perlen-Komplexe dreimal mit je einem Milliliter Puffer C waschen, wie im Protokolltext beschrieben. Zwei Reagenzgläser vorbereiten, eines mit 150 Mikrogramm Chromatin und Antikörper-Perlen-Komplexen und das andere mit 150 Mikrogramm Chromatin und 20 Mikroliter gewaschenen Perlen. Je ein Milliliter Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zu jedem Reagenzglas hinzufügen und die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad mit 40 U/min inkubieren.Wenn die Übernacht-Immunpräzipitation abgeschlossen ist, setzen Sie die Proben in den Magnetständer und sammeln Sie den Überstand, der das nicht gebundene Antikörper-Chromatin enthält. Eluieren Sie das an den Antikörper gebundene Protein, indem Sie 150 Mikroliter Puffer D1 zu den gewaschenen Materialien hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten bei 50 Grad Celsius in einem Heizblock.Nach 20 Minuten entfernen Sie die Proben vom Heizblock und stellen Sie sie auf den magnetischen Ständer. Sammeln Sie den Überstand in einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie die Kügelchen. Um die Vernetzung umzukehren, geben Sie fünfmolares Natriumchlorid zum Überstand, um eine Endkonzentration von 200 Millimolar zu erhalten.Bereiten Sie eine Eingabeprobe von Chromatin in einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Verwenden Sie die gleiche Menge Chromatin wie bei der Immunpräzipitationsprobe in einem Endvolumen von 150 Mikrolitern RNase- und DNase-freiem Wasser und fünf Molar Natriumchlorid, um eine Endkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius.Am folgenden Tag die Proben vom Heizblock nehmen. EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 Millimolar und Proteinase K zu einer Endkonzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen und zwei Stunden bei 55 Grad Celsius verdauen lassen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Kügelchen.Bringen Sie die Kügelchen zunächst mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur. Vortexen Sie die Kügelchen anschließend sehr gründlich und pipettieren Sie schnell ein Milliliter der Kügelchen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen zwei bis drei Minuten lang auf den Magneten, bis die Lösung klar wird, und entfernen Sie den Überstand.Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Geben Sie ein Milliliter 0,5-molare EDTA-Lösung hinzu und mischen Sie kurz durch Vortexen. Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise zweimal und entsorgen Sie die Überstände nach dem letzten Waschschritt.Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Geben Sie ein Milliliter Puffer E hinzu und resuspendieren Sie die Kügelchen langsam. Überführen Sie die gesamte Mischung in 50 Milliliter Puffer E. Stellen Sie es auf einen Schüttler und lassen Sie es eine Stunde lang langsam bei Raumtemperatur mischen.Testen Sie anschließend die DNA-Bindungskügelchen unter Verwendung einer 1-KB-DNA-Leiter und drei unterschiedlichen Volumenverhältnissen von Kügelchen zu DNA. Es zeigte sich, dass das Verhältnis 2,5:1 am besten für die DNA-Bindung geeignet ist. Um die Kügelchen für die DNA-Reinigung zu verwenden, geben Sie 425 µL oder 2,5 Volumina der Kügelchen zu jeder DNA-Probe hinzu und resuspendieren Sie diese langsam, indem Sie etwa 10 Mal auf- und abpipettieren.Ansatz bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Fünf Minuten auf dem Magneten platzieren. Anschließend vorsichtig die Überstände abpipettieren und verwerfen.Zweimal mit frisch hergestelltem 80 % Ethanol waschen, indem 600 Mikroliter zu jedem Röhrchen gegeben werden. Eine Minute warten, dann die Überstände absaugen und verwerfen. Die Röhrchen kurz anschleudern.Stellen Sie die Röhrchen auf den Magneten. Entfernen Sie die letzten Tropfen Ethanol und lassen Sie sie eine Minute bei Raumtemperatur trocknen. Nehmen Sie die Probe vom Magneten und eluieren Sie die DNA, indem Sie 20 Mikroliter DNase- und RNase-freies Wasser hinzufügen. Vortexen Sie die Probe.Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte die Größen der DNA-Fragmente nach reverser Vernetzung der gesamten sonifizierten DNA, die aus embryonalen Stammzellen der Maus, Embryoidkörpern und embryonalem Herzmuskelgewebe extrahiert wurde. Ein Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment wurde durchgeführt, um die epigenetische Regulation von Genen des epithelial-mesenchymalen Übergangs in Wildtyp- oder genetisch mutierten Zellen zu untersuchen, während sich die ES-Zellen in mesodermale Zelllinien differenzieren. Die Bindung modifizierter Histone wurde mittels PCR der Promotoren oder Enhancer der Gene für E-Cadherin und Twist überwacht.Die sequenzielle Chromatin-Immunpräzipitation wurde an Chromatin durchgeführt, das aus vier menschlichen ES-Zelllinien extrahiert wurde, unter Verwendung von Antikörpern gegen ein aktivierendes Chromatin-Markierungsmolekül, gefolgt von Antikörpern gegen eine reprimierte Markierung. Diese Markierungen werden modifiziert, wenn die Zellen durch Morphogene herausgefordert werden, variieren jedoch je nach der jeweiligen menschlichen ES-Zelllinie, wahrscheinlich aufgrund der ursprünglichen Blastozysten, aus denen sie stammen.Die chromatinimmunpräzipitative Analyse kann ebenfalls auf Chromatin angewendet werden, das aus spezifischen embryonalen Herzbereichen isoliert wurde. Diese Abbildung zeigt genomische Regionen der Herzgene Nkx2.5 und TBx5, die angereichert sind für die modifizierte Histonenform, sowie eine genomische Region des Schrittmacher-spezifischen Gens Shox2, die weder angereichert noch im Ventrikel exprimiert ist. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, vor Beginn des IP-Protokolls die Ultraschall-Effizienz zu überprüfen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Eth-ek-se-ek durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den Zustand der Chromatinstruktur hinsichtlich Offenheit oder Geschlossenheit zu untersuchen oder den Nukleosomenabstand zu überwachen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, epigenetische Regulationen bei Zellschicksalentscheidungen in jeder Zellart oder embryonalen Organ entdecken zu können.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Chromatin-Immunpräzipitationsassays durchgeführt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

In diesem Protokoll wird die Ableitung von kardialen Vorläuferzellen sowohl aus maus als auch aus menschlichen embryonalen Stammzellen veranschaulicht. Eine wichtige Strategie in diesem Protokoll besteht darin, kardiale Vorläuferzellen mit Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzreportern anzureichern, die in die embryonalen Stammzelllinien eingebaut werden.

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen in vitro ermöglicht den Zugang zu großen Mengen an Herzgewebe in vitro für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen.  Dieses Protokoll verwendet den atrialisierenden Faktor Grem2, um sowohl die Anzahl der erhaltenen Kardiomyozyten zu erhöhen als auch Kardiomyozyten mit einem atrialen Phänotyp zu erzeugen.

Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation zur Untersuchung epigenetischer Regulation bei der Herzdifferenzierung von embryonalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen spezifischer DNA-Loci.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

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