Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Das übergeordnete Ziel, diese Chromatin-Immunpräzipitationsansätze auf differenzierende embryonale Stammzellen oder embryonales Herzmuskelgewebe anzuwenden, besteht darin, die epigenetische Regulation der Herzentwicklung aufzuklären. Da die feine Abstimmung der Genexpression während der embryonalen Herzentwicklung durch epigenetische Komponenten gesteuert wird, eignet sich die Chromatin-Immunpräzipitation als geeignete Methode, um diesen Prozess zu verstehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir gezielt einen Locus ansprechen und die epigenetischen Markierungen untersuchen können, die auf diesem spezifischen DNA-Abschnitt sitzen. Diese Methode kann Einblicke in die epigenetische Regulation der Herzentwicklung liefern. Sie kann außerdem auf andere Organe oder beliebige Zelltypen angewendet werden.

Dies ist Imen. Sie ist Doktorandin im Labor und wird heute das Experiment durchführen. Dieses Verfahren nutzt embryonale Stamm- oder ES-Zellen.

Aus ES-Zellen erzeugte Embryoidkörper und aus E9,5-Maus-Embryonen isoliertes embryonales Herzmuskelgewebe. Fixieren Sie die Zellen und Gewebe. Verwenden Sie 1 % Formaldehyd in PBS für die Zellen und PB2-Permeabilisierungspuffer für das embryonale Gewebe.

Stellen Sie die Röhrchen auf einen Rotationswellen-Shaker und schütteln Sie sie 10 Minuten lang genau bei 60 U/min bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Vernetzungsreaktion, indem Sie Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 Millimolar hinzufügen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Rotationswellen-Shaker bei einer Geschwindigkeit von 60 U/min. Um dieses Verfahren zu beginnen, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS.

Und die embryonalen Gewebe in ein Milliliter PB2. Zentrifugieren Sie bei 1000 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie den jeweiligen Puffer für eine zweite Wäsche hinzu.

Fügen Sie Proteaseinhibitoren den Puffern PB1 und PB2 auf Eis hinzu. Geben Sie ein Milliliter Puffer PB1, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zum Zellpellet und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen zu resuspendieren. Resuspendieren Sie auf die gleiche Weise das embryonale Gewebe in einem Milliliter Puffer PB2, ergänzt mit Proteaseinhibitoren.

Anschließend die Zellen oder Gewebe mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel homogenisieren. Die Zellsuspension in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die homogenisierten Zellen und Gewebe bei vier Grad Celsius zehn Minuten lang inkubieren.

Zentrifugieren bei 3000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 300 µL des jeweiligen Sonikationspuffers, ergänzt um Proteaseinhibitoren. Überführen Sie die Zellsuspension in eine zertifizierte, RNase-, DNase- und pyrogenfreie Röhrchen, um jeglichen DNA-Abbau zu verhindern, und inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten auf Eis.

Um die Chromatin zu fragmentieren, beschallen Sie die Proben bei vier Grad Celsius unter Verwendung des geeigneten Beschallungsprogramms für jedes Material. Passen Sie die Dauer der Beschallung an, abhängig davon, ob die DNA für die PCR oder die Sequenzierung verwendet wird. Zentrifugieren Sie anschließend die beschallten Zelllysate 10 Minuten lang.

Überführen Sie das Überstand, der die in Lösung befindliche Chromatin darstellt, aus jeder Probe in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen und verwerfen Sie das Pellet. Entnehmen Sie ein 1,5-Mikroliter-Aliquot jeder Probe und verdünnen Sie es 1:10 mit Wasser. Bestimmen Sie die optische Dichte aller Proben in einem Nano-Spektrophotometer, um die Protein-konzentration zu ermitteln.

Vor der Chromatin-Immunpräzipitation Protein A-gekoppelte Kügelchen vorbereiten, indem sie gemäß dem Protokolltext gewaschen werden. In einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen den gegen modifizierte Histone oder Transkriptionsfaktoren gerichteten Antikörper, 20 µL der gewaschenen Protein A-gekoppelten Kügelchen und ein Milliliter Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zusammengeben. Die Proben auf einem Rotator bei 40 U/min mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.

Die Antikörper-Perlen-Komplexe dreimal mit je einem Milliliter Puffer C waschen, wie im Protokolltext beschrieben. Zwei Reagenzgläser vorbereiten, eines mit 150 Mikrogramm Chromatin und Antikörper-Perlen-Komplexen und das andere mit 150 Mikrogramm Chromatin und 20 Mikroliter gewaschenen Perlen. Je ein Milliliter Puffer C, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, zu jedem Reagenzglas hinzufügen und die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad mit 40 U/min inkubieren.

Wenn die Übernacht-Immunpräzipitation abgeschlossen ist, setzen Sie die Proben in den Magnetständer und sammeln Sie den Überstand, der das nicht gebundene Antikörper-Chromatin enthält. Eluieren Sie das an den Antikörper gebundene Protein, indem Sie 150 Mikroliter Puffer D1 zu den gewaschenen Materialien hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten bei 50 Grad Celsius in einem Heizblock.

Nach 20 Minuten entfernen Sie die Proben vom Heizblock und stellen Sie sie auf den magnetischen Ständer. Sammeln Sie den Überstand in einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie die Kügelchen. Um die Vernetzung umzukehren, geben Sie fünfmolares Natriumchlorid zum Überstand, um eine Endkonzentration von 200 Millimolar zu erhalten.

Bereiten Sie eine Eingabeprobe von Chromatin in einem sauberen 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Verwenden Sie die gleiche Menge Chromatin wie bei der Immunpräzipitationsprobe in einem Endvolumen von 150 Mikrolitern RNase- und DNase-freiem Wasser und fünf Molar Natriumchlorid, um eine Endkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Am folgenden Tag die Proben vom Heizblock nehmen. EDTA zu einer Endkonzentration von 12,5 Millimolar und Proteinase K zu einer Endkonzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen und zwei Stunden bei 55 Grad Celsius verdauen lassen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Kügelchen.

Bringen Sie die Kügelchen zunächst mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur. Vortexen Sie die Kügelchen anschließend sehr gründlich und pipettieren Sie schnell ein Milliliter der Kügelchen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen zwei bis drei Minuten lang auf den Magneten, bis die Lösung klar wird, und entfernen Sie den Überstand.

Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Geben Sie ein Milliliter 0,5-molare EDTA-Lösung hinzu und mischen Sie kurz durch Vortexen. Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise zweimal und entsorgen Sie die Überstände nach dem letzten Waschschritt.

Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten. Geben Sie ein Milliliter Puffer E hinzu und resuspendieren Sie die Kügelchen langsam. Überführen Sie die gesamte Mischung in 50 Milliliter Puffer E. Stellen Sie es auf einen Schüttler und lassen Sie es eine Stunde lang langsam bei Raumtemperatur mischen.

Testen Sie anschließend die DNA-Bindungskügelchen unter Verwendung einer 1-KB-DNA-Leiter und drei unterschiedlichen Volumenverhältnissen von Kügelchen zu DNA. Es zeigte sich, dass das Verhältnis 2,5:1 am besten für die DNA-Bindung geeignet ist. Um die Kügelchen für die DNA-Reinigung zu verwenden, geben Sie 425 µL oder 2,5 Volumina der Kügelchen zu jeder DNA-Probe hinzu und resuspendieren Sie diese langsam, indem Sie etwa 10 Mal auf- und abpipettieren.

Ansatz bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Fünf Minuten auf dem Magneten platzieren. Anschließend vorsichtig die Überstände abpipettieren und verwerfen.

Zweimal mit frisch hergestelltem 80 % Ethanol waschen, indem 600 Mikroliter zu jedem Röhrchen gegeben werden. Eine Minute warten, dann die Überstände absaugen und verwerfen. Die Röhrchen kurz anschleudern.

Stellen Sie die Röhrchen auf den Magneten. Entfernen Sie die letzten Tropfen Ethanol und lassen Sie sie eine Minute bei Raumtemperatur trocknen. Nehmen Sie die Probe vom Magneten und eluieren Sie die DNA, indem Sie 20 Mikroliter DNase- und RNase-freies Wasser hinzufügen. Vortexen Sie die Probe.

Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte die Größen der DNA-Fragmente nach reverser Vernetzung der gesamten sonifizierten DNA, die aus embryonalen Stammzellen der Maus, Embryoidkörpern und embryonalem Herzmuskelgewebe extrahiert wurde. Ein Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment wurde durchgeführt, um die epigenetische Regulation von Genen des epithelial-mesenchymalen Übergangs in Wildtyp- oder genetisch mutierten Zellen zu untersuchen, während sich die ES-Zellen in mesodermale Zelllinien differenzieren. Die Bindung modifizierter Histone wurde mittels PCR der Promotoren oder Enhancer der Gene für E-Cadherin und Twist überwacht.

Die sequenzielle Chromatin-Immunpräzipitation wurde an Chromatin durchgeführt, das aus vier menschlichen ES-Zelllinien extrahiert wurde, unter Verwendung von Antikörpern gegen ein aktivierendes Chromatin-Markierungsmolekül, gefolgt von Antikörpern gegen eine reprimierte Markierung. Diese Markierungen werden modifiziert, wenn die Zellen durch Morphogene herausgefordert werden, variieren jedoch je nach der jeweiligen menschlichen ES-Zelllinie, wahrscheinlich aufgrund der ursprünglichen Blastozysten, aus denen sie stammen.

Die chromatinimmunpräzipitative Analyse kann ebenfalls auf Chromatin angewendet werden, das aus spezifischen embryonalen Herzbereichen isoliert wurde. Diese Abbildung zeigt genomische Regionen der Herzgene Nkx2.5 und TBx5, die angereichert sind für die modifizierte Histonenform, sowie eine genomische Region des Schrittmacher-spezifischen Gens Shox2, die weder angereichert noch im Ventrikel exprimiert ist. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, vor Beginn des IP-Protokolls die Ultraschall-Effizienz zu überprüfen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Eth-ek-se-ek durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den Zustand der Chromatinstruktur hinsichtlich Offenheit oder Geschlossenheit zu untersuchen oder den Nukleosomenabstand zu überwachen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, epigenetische Regulationen bei Zellschicksalentscheidungen in jeder Zellart oder embryonalen Organ entdecken zu können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Chromatin-Immunpräzipitationsassays durchgeführt werden können.