Name: Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese mikrofluidische Methode ermöglicht die Analyse von Genexpressionsmustern einzelner Zellen.

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Wir danken Dr. C. Geoffrey Burns für den Fischbestand. Die Autoren danken der UNC Flow Cytometry Core Facility, dem UNC-CGIBD AAC Core für die Ressourcen, die dieses Projekt ermöglichen, und der ZAC-Einrichtung für die Tierpflege. L.S. wird durch den NIH T32 Grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda) unterstützt. N.F. wird unterstützt durch das NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. Diese Studie wurde durch den NIH P30DK034987 Grant (an UNC Advanced Analytics Core), den American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 und den Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (an Dr. Qian) und den NIH R00 HL109079 Grant (an Dr. Liu) unterstützt.

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von lebenden, erwachsenen Zebrafischembryonen zu erzeugen. Die Embryonen werden für die Gewebesammlung geerntet. Es ist wichtig, die Genehmigung zuständigen Ethik Review Boards zu erhalten, dieses Experiment durchzuführen. 1. Besorgen Inszenierte Embry <ol><li> Am Tag vor dem Experiment, bereiten gesunde, erwachsene Zebrafisch für die Zucht. Setzen Sie ein Mann und eine Frau, die auf gegenüberliegenden Seiten eines klaren Teiler in einem Zuchtbecken. </li><li> Wiederholen 1.1 für so viele Zuchtbecken als notwendig für eine ausreichende Embryo Produktion für die nachgeschaltete Anwendung. Erhalten Embryonen von beiden Wildtyp-Fisch und transgene Fische, die fluoreszierende Proteine ​​in den Zelltyp von Interesse exprimieren. HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen für die Downstream-Anwendungen in den Schritten 2-8 benötigt wird, hängt von der relativen Häufigkeit der Zellen von Interesse zu dem Zeitpunkt, von Interesse. Obwohl dies nach Zelltyp variieren kann, produzieren 200 Embryonen 2000-5000 sortierten Zellen, wenn die cells von Interesse repräsentieren &lt;1,0% der gesamten Zellen bei 24 HPF (Stunden nach der Befruchtung). </li><li> Am nächsten Morgen, ändern Sie das Wasser in der Panade Tank von Fisch zu einem frischen Zuchtbecken und entfernen Sie die Trennlinie zu übertragen. Kippen Sie den Tank in einem Winkel Zucht zu fördern. </li><li> Sammeln Sie inszeniert Embryonen. <ol><li> Alle 15 min, sammeln Embryonen, die durch die Erwachsenen zu einem frischen Zuchtbecken zu übertragen und die Eier vorbei, die hinten durch ein Teesieb gelassen werden. HINWEIS: Zebrabärbling-Embryonen synchron entwickeln, wenn bei vergleichbaren Dichten und Temperaturen gehalten. </li><li> Spülen Sie die Eier mit Ei Wasser (0,21 g / L Instant Ocean Salze in 1 l doppelt destilliertem Wasser) aufnehmen und in eine Petrischale. Übertragen Sie die Petrischale mit einem feuchten Inkubator bei 28,5 ° C mit Luftzirkulation. </li></ol></li><li> Zwei Stunden nach der letzten Erhebung, Art befruchtet, mehrzelligen Embryonen in 10 cm Petrischalen und reduzieren Dichte auf 50 Embryonen pro Schale. Wählen Embryonen aus einem einzigen, 15min Zeitfenster Sammlung für Downstream-Anwendung. Inkubieren Embryonen bei 28,5 ° C. HINWEIS: Zum Beispiel sammeln Embryonen bei 08.30, 08.45, 09.00, 09.15, 09.30, 09.45, 10.00 und 10.15 Uhr. Vergleicht man über Zeitpunkte, wenn die größte Zahl der befruchteten Embryonen aus den Klauen um 9:00 gesammelt sind, dann verwenden Sie nur diese Embryonen für die Downstream-Anwendungen. </li></ol> 2. für Einzel Zelldissoziationsmedium Set Up <ol><li> Etwa 30 Minuten vor dem Zeitpunkt der Umgebung (18 HPF) entfernen Embryonen aus ihrem Chorion manuell mit einer feinen Pinzette. </li><li> Sammeln und beschriften Sie die folgende für jede Bedingung: zwei 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen, ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb, einer 35 mm Zellkulturschale und zwei FACS-Röhrchen mit einem Sieb 35 um Zelle gekrönt. </li><li> Kühlen Sie die folgenden Reagenzien auf Eis: Ei Wasser 0,21 g / L Instant Ocean Salze in 1 l doppelt destilliertem Wasser enthält; De-yolking Puffer enthaltend 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl und 1,25 mM NaHCO 3; und FACS-Puffer enthält, Leibovitz L-15-Medium, supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. </li><li> Bringt 1 ml pro Probe Zelldissoziationsmedium Reagenz 1 auf RT. Thaw 1 ml Zelldissoziationsmedium Reagenz 2 pro Probe auf Eis. Bringen Sie unmittelbar vor dem Gebrauch auf RT. </li></ol> 3. Single Zelldissoziationsmedium <ol><li> Unter Verwendung einer breiten Bohrungsglaspipette übertragen 100-300 Embryonen in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem minimalen Volumen an Wasser Egg. </li><li> Euthanize Embryonen, die durch Wasser mit 1 ml eiskaltem Ei Wasser ersetzt und Untertauchen Rohr in Eis für 20 min. ACHTUNG! Es ist wichtig , die Zustimmung angemessenen institutionellen Tierpflege Aufsichtsgremium für diese Euthanasie Verfahren zu erhalten (auf Eis durch Zelldissoziationsmedium als sekundäre Euthanasie gefolgt Kühlen). Standard-Euthanasie erfordert in der Regel, dass Embryonen &lt;3 Tage nach der Befruchtung gebleicht werden, nachdem sie gekühlt werden, die für den Erhalt der lebenden Zellen nicht geeignet ist. </li><li> Waschen Sie die Embryonen zweimal mit 1 ml eiskaltem Wasser Ei. Zum Waschen verwenden, um eine breite Bohrung Glaspipette Ei Wasser und P1000 zu entfernen Egg Wasser hinzuzufügen. </li><li> Entfernen Sie das Eigelb durch den Embryo Wasser mit 1 ml Deyolking Buffer ersetzen und Verreiben 8-12 mal mit einer P1000 Spitze, oder bis das Eigelb gelöst und nur die Körper der Embryonen sind sichtbar. </li><li> Sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation bei 300 g für 1 min. Verwenden Sie eine Pipette vorsichtig den Überstand zu entfernen, ohne das Gewebe Pellet zu stören. Re-suspend in 1 ml Wasser Ei. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.5 für insgesamt drei Waschungen, aber auf dem letzten Waschen resuspendieren in 1 ml RT Zelldissoziation Reagenz 1. </li><li> Inkubieren in Zelldissoziation Reagenz 1 10 min bei RT mit Rohren horizontal angeordnet. Alle 2-3 min, verreiben vorsichtig mit einem P1000 Pipette Verklumpen zu verhindern. Hinweis: Behandeln Proben sanft während Verreiben Schritten. Irgendwann eine einzige, werden große Klumpen aus einem Gewirr von Embryo Körper in der Röhre bilden. Dieser Willezerstreuen mit zusätzlichen Verdauung durch vorsichtiges Zerreiben unterstützt. NICHT VORTEX. </li><li> Sammeln Sie Gewebe durch Zentrifugation bei 300 g für 3 min. Überstand entfernen und resuspendieren in 1 ml Zelldissoziationsmedium Reagenz 2. </li><li> Inkubieren für 5-15 min bei RT. Die Röhrchen horizontal. Alle 2-3 min, verreiben sanft Verklumpen zu verhindern. Alle 5 min, zu bewerten Verdauung Fortschritt. <ol><li> Zur Beurteilung der Verdauung Fortschritt, verdünnen 2 ul Überstand in 18 &amp; mgr; l FACS-Puffer und Pipette als ein Tröpfchen auf einer Zellkulturschale. </li><li> Legen Sie ein Deckglas über die Probe und beobachten unter einer Gewebekultur Mikroskop bei 10X und 20X Vergrößerung. HINWEIS: Die Zubereitung als eine Mischung aus einzelnen Zellen, kleine Cluster, große Cluster erscheinen soll, und gelegentlich meist intakten Embryo Körper. </li><li> Visuell beurteilen, um den Anteil der Zubereitung, die einzelne Zellen und kleine Cluster ist. HINWEIS: Über Verdauung Lebensfähigkeit zu reduzieren; Unter Verdauung wird einzelne Zellausbeute zu reduzieren. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Sammeln der Zellpräparation durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren in 1 ml kaltem FACS-Puffer. </li><li> Befeuchten Sie ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb mit FACS-Puffer. Übergeben Sie die Zellsuspension durch die 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb auf eine 35 mm-Zellkulturschale. Waschen Sie die Zelle Sieb einmal mit 1 ml FACS Sortierpuffer. </li><li> Übertragung der Durchfluss in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer. </li><li> Graf Zellausbeute unter Verwendung einer Zählkammer. Verdünnen Weitere Proben bis 5x10 6 Zellen pro ml oder optimale Konzentration für die FACS - Maschine der Wahl empfohlen. Optional Wenn diese der Hemocytometer, Gegenfärbung toten Zellen mit Trypanblau Zellausbeute zählen Lebensfähigkeit der Zellpräparation Sortierung vor der FACS zu bestätigen. HINWEIS: Die Vorbereitungen, die zu verdünnen sind, werden überschüssige Menge an Zeit in Anspruch nehmen zu sortieren. Die Vorbereitungen, die zu sind concentrated neigen zu Multimeren zu verklumpen und sind suboptimal für eine reine Population zu sortieren. </li><li> Reserve 10-20% jeder Probe als ungefärbten Kontrollen. Für restlichen Proben, Flecken tote Zellen durch Zugabe eines fluoreszierenden Live / Dead (L / D) Diskriminierung in jeder Probe zu färben. Nicht waschen. Hinweis: alle Fluoreszenzfarbstoff, der Zellen mit beeinträchtigter Zellmembranen und Flecken Nukleinsäuren durchdringt, kann als L / D-Farbstoff verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Fluoreszenzspektren mit der FACS-Maschine der Wahl und des Fluorophors Kennzeichnungs Zellen von Interesse vereinbar ist. <ol><li> Nicht waschen die Herstellung nach den Farbstoff Zugabe, da einige Zellen im Transitverkehr zu FACS Reinigung sterben werden und sollte aus der sortierten Population ausgeschlossen werden. </li></ol></li><li> Befeuchten Sie die 35 &amp; mgr; m Zellsieb capped FACS-Röhrchen mit 20 &amp; mgr; l FACS-Puffer. In Zellen mit dem Sieb und sammeln durch die Schwerkraft. Lagern auf Eis. </li></ol> 4. FACS Anreicherung <ol><li> Verwenden Sie FACS für einzelne zu bereichern, Lebende Zellen, die fluoreszierende Marker exprimieren. <ol><li> Stellen Sie eine Gate-Zellen, die aus Trümmern in einem Streudiagramm der Vorwärtsstreuung (FSC-A) Amplitude vs Seitenstreuamplitude (SSC-A), die beide mit linearer Skalierung zu unterscheiden. Achtung! Zebrabärbling - Zellen sind typischerweise kleiner als Maus oder menschliche Zellen. Dies ist in einem unteren basal Trennung zwischen den Zellen und Debris reflektiert. </li><li> Vom Tor in 4.1.1 festgelegt, setzen Sie ein Tor für einzelne Zellen zu bereichern und Multimere mit einem Streudiagramm Vorwärtsstreuung Höhe (FSC-H) und Low-Side-Streuhöhe (SSC-H), die beide mit linearer Skalierung auszuschließen. Hinweis: Zellen mit überproportional hohen FSC-H und niedrigen SSC-H sind wahrscheinlich Multimere und werden von der Sortierung ausgeschlossen. </li><li> Vom Tor Satz in 4.1.2, mit einzelnen Farbsteuerung, setzen Sie ein Tor nur lebende Zellen enthalten ein Streudiagramm von FSA-A mit linearer Skalierung und Amplitude des Kanals verwendet, um L / D Fleck mit log Skalierung zu erkennen. Fügen L / D-negativen Zellen. </li><li> Vondas Tor in 4.1.3 festgelegt, einzelne Farbsteuerung verwenden, stellen eine Gate nur lebende Zellen mit positiven Fluoreszenz unter Verwendung eines Streudiagramm von FSA-A mit linearer Skalierung und Amplitude des Kanals verwendet werden, zu fluoreszierendes Protein Zellmarker mit Log-Skalierung zu erkennen . Fügen Sie positive Zellen. </li><li> Gesetzt keine Kompensationssteuerungen, falls erforderlich, für eine Interferenz zwischen dem L / D-Färbung und fluoreszierendes Protein Spektren zu berücksichtigen. </li></ol></li><li> Set Art Logik-Zellen, die in alle Tore in Schritt 4.1 gesetzt fallen. <ol><li> Mit Doppel-Zellen markiert, überprüfen Sie für Zellsortierung Gating. HINWEIS: Die Zellen für die Sortierung werden die Zellen statt Schutt, einzelner Zellen anstatt Multimere, L / D-negativ und Fluoreszenz-positiven Zellen sein. </li></ol></li><li> Sortieren 2.000-4.000 Zellen aus der Population von Interesse in 5 ul kaltem FACS-Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Um Scher und Belastung auf Zellen während des Sortierens, verwenden Sie die niedrigsten Drücken möglich, dass die Zelle zu minimierenSorter. HINWEIS: Die 5 ul Tröpfchen FACS Puffer dient als Puffer für Zellen die FACS-Maschine verlassen. 2.000-4.000 Zellen Sammeln direkt in FACS-Puffer beseitigt die Notwendigkeit für die Zentrifugation vor auf die IFC-Chips zu laden. Diese Strategie wird empfohlen, weil der Zentrifugation zur Bildung von Multimeren führen kann, wenn die Zellen miteinander in dem Pellet anhaften. </li><li> Beurteilen Sie die Post-Sortiertragfähigkeitsanalyse. <ol><li> Übertragung 1 &amp; mgr; l Zellen in ein frisches FACS-Röhrchen sortiert mit 100 ul FACS Sortierpuffer und 1: 1000 Verdünnung von L / D-Fleck. Führen Sie die Zellen durch die FACS-Sorter mit der Gating-Strategie in Schritt 4.1. Verwenden Sie den Anteil von L / D negativ auf positiv Lebensfähigkeit von sortierten Zellen abzuschätzen. </li></ol></li></ol> 5. Wägezellen auf Mikrofluidik-Chip <ol><li> Mit Hilfe einer Zählkammer, messen sowohl die Konzentration und Größe der sortierten Zellen. <ol><li> Verdünnte sortierten Zellen auf mindestens 10 &amp; mgr; l. Einen aliquoten von 5 μ; L Zellen mit 5 ul Trypanblau. Legen Sie auf Hämozytometer und anwenden Deck. </li><li> Sammeln Hellfeldbilder aller Zellen in 4 x 4 Gitter von Hemocytometer. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen und berechnen lebenden Zellen / ml. Lebende Zellen nehmen nicht Trypan blau. HINWEIS: Verwenden Sie eine beliebige Standard-Bildanalyse-Software, den Durchmesser aller lebenden Zellen zu messen. Berechnen Sie den Mittelwert und Standardabweichung der Zellengröße, und wählen Sie von Interesse, eine IFC Platte geeignet für die Zellgrößenbereich. Wenn Zellgrößenbereich eine IFC Plattenzellgrößenbereich spreizt, verwenden Sie mehrere Platten, die das gesamte Spektrum von Zellen von Interesse zu erfassen. </li></ol></li><li> Wägezellen auf IFC Platte den Anweisungen des Herstellers nach (siehe Materialien). <ol><li> Verdünnte Zellen bis 1x10 6 Zellen / ml und Auftrieb Optimierung durchführen als den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: weder Buoyancy Optimierung sorgt dafür, dass die Zellen auf den Boden sinken, noch schweben an die Spitze des Lade well für optimale Beladung auf IFC Chip. Das Verhältnis von Puffer zu Zellen, die durch Zelltyp kann variieren, aber liegt typischerweise im Bereich 6: 4-7: 3 von Zellen: Puffer. </li><li> In Zellen auf grundierte-IFC-Platte. Lastplatte in kompatible Fluidik-Maschine, und führen Sie Skript, um eine Zelle Ladezellen durch Mikrofluidik Schaltung zu schieben und in Capture-Bahnen. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie, dass Zellen in Fangstellen auf IFC Platte eingelegt werden. <ol><li> Entfernen IFC Platte von Fluidik-Maschine. Montieren Sie die IFC Platte auf einem Mikroskop mit einem Plattenadapter ausgestattet. </li><li> Sammeln Sie Schnappschüsse von Hellfeld und Fluoreszenz für jede Einfangstelle bei 10-facher Vergrößerung. HINWEIS: Hell Capture Zeiten können von 10 bis 50 ms liegen, je nach Lampenintensität. Die Fluoreszenz-Capture-Zeiten können 250 bis 750 ms liegen, abhängig von Fluorophor Helligkeit. Vermeiden Zellen überzubelichten Lichtschäden zu verhindern. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthesis <ol><li> Führen Zelllyse in situ gemäß IFC Platte Anweisungen des Herstellers. <ol><li> In Lysepuffern in die Vertiefungen auf IFC Platte. Lastplatte auf kompatible Fluidik-Maschine und Lauf Zelllyse Skript als den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Führen Sie die reverse Transkription nach IFC Platte Anweisungen des Herstellers. <ol><li> In der reversen Transkription Reagenzien IFC Platte. Lastplatte auf kompatible Fluidik-Maschine. Führen Sie die reverse Transkription-Skript. Probenzyklusbedingungen: 1 Zyklus bei 25 ° C für 10 min, 1 Zyklus bei 42 ° C für 1 h, dann 1 Zyklus bei 85 ° C für 5 min. </li></ol></li><li> Führen Sie Vorverstärkung mit Gen-spezifischen Sonden nach IFC Platte Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Aufgrund ihrer höheren Spezifität bei niedriger Kopienzahlen verwenden fluorogenen-markierten Sonden anstatt für den Einsatz optimierte Sonden mit Interkalator Farbstoffen. <ol><li> Pool-Primer und verdünnt auf endgültige 180 nM jeder. In gepoolten Primer an IFC Platte. Lastplatte auf kompatible FLUIDIcs Maschine. Führen Sie Vorverstärkung Skript. </li></ol></li><li> Führen Vorverstärkung mit den folgenden Zyklusbedingungen: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min, dann 18 Zyklen mit 15 sec bei 95 ° C denaturieren dann Tempern und Verlängerung bei 60 ° C für 4 min. Store cDNA bei 4 ° C bis zur Ernte vorge amplifiziert. Ernte-cDNA aus mikrofluidischen Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers und lagern bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 7. Wählen Sie cDNA von Einzelzellen für Einzelziel qRT-PCR <ol><li> Verdünnte cDNA in 25 &amp; mgr; l Verdünnungs Reagens nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die ungefähre endgültige Ausbeute beträgt 28 &amp; mgr; l von vorverstärkten cDNA pro Zelle. Reservieren Sie einen aliquoten Teil des Verdünnungsmittels für die Verwendung als nicht-Template Kontrolle in qRT-PCR. <ol><li> Mit Bezug auf Hellfeld und Fluoreszenz-in-Schritt aufgezeichneten Bilder 5.3.2, Score jede Einfangstelle. Manuell zu zählen und die Anzahl der Zellen aufzuzeichnen. Beurteilen und notieren, ob jede Zelle Grippeorescent. HINWEIS: Jede einzelne Website enthalten 0, 1 oder&gt; 1 Zelle, wo&gt; 1 Zelleinfang Websites umfasst, die mehrere Zellen und / oder nicht identifizierbare Trümmer enthalten. Wenn die Bilder ausreichender Qualität, ein Pixelwert sind auch zugeordnet werden können, um die Intensität des Fluoreszenzsignals quantitativ zu bestimmen. </li></ol></li><li> Ausgewählte Proben für qRT-PCR-Analyse. <ol><li> Wählen Sie cDNA-Proben von Fangstellen identifiziert in Schritt 7.2, die genau 1 Zelle mit positiven Fluoreszenz enthalten. Pool 1 &amp; mgr; l Aliquots von cDNA aus jeder Probe. ANMERKUNG: Dies ist der &quot;Pool&quot; positive Kontrolle verwendet, um zu bestimmen, ob die Gene von Interesse in einer der ausgewählten Zellen exprimiert werden. </li><li> Wählen Sie cDNA aus mindestens einer Fangstelle, die genau 0-Zellen als negative Kontrolle enthält. Verwenden Sie Verdünnungsmittel aus Schritt 7.1.2 als No-Template-Steuerung. </li></ol></li><li> Führen Sie qRT-PCR-Assays. <ol><li> Verwenden Sie nur Sonden verwendet für die Prä-Amplifikation in Schritt 6.4.1. Laden Sie alle Proben in triplicate. Zyklusbedingungen für eine 10 &amp; mgr; l-Reaktion auf einer 384-Well-Platte: 1 Zyklus 50 ° C 2 min, 1 Zyklus 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen mit 95 ° C 15 sec Denaturierung dann Annealing und Extension bei 60 ° C für 1 Minute </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Validieren qRT-PCR-Produkte von Standard-Gelelektrophorese. Bestätigen Produkt eine einzelne Bande bei einem erwarteten Molekulargewicht (variiert für jede Sonde). HINWEIS: Wenn eine Sonde mehrere Bänder oder eine einzelne Bande bei einem ungeeigneten Größe erzeugt, dann Spezifität ist fraglich, und das schließt das Gen aus der Analyse. </li><li> Überprüfen Sie alle Amplifikationskurven und Konto für alle Anomalien 14. Berechnen Sie den Mittelwert CT - Wert für jede Probe / Gen - Kombination 15. HINWEIS: CT-Werte für positive Kontrollen liegen typischerweise im Bereich von 10 bis 30. CT-Werte für negative Kontrollen liegen typischerweise im Bereich von 35 bis 40 (ohne Verstärkung). CT-Werte von 30 bis 35 sind sehr niedrig Ausdruck betrachtetund sollten mit Vorsicht interpretiert werden 14. </li><li> Report-Daten <ol><li> Wenn Proben in der CT fallen = 10-30, Daten auch als fache Veränderung der Transkript Fülle relativ zu einer Kontrollprobe gemeldet werden kann. HINWEIS: Falten Änderung gleich 2 ^ (- ΔΔCT) , wo ACt zu einem Housekeeping - Gen relativ ist , indem die durchschnittliche CT der Probe aus dem Housekeeping - Gen subtrahiert und ΔΔCT ist die Unterschiede in ACt zwischen der Probe und einer positiven Kontrolle 15. </li></ol></li></ol>

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<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
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<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Verfahren verwendet die Expression eines Fluoreszenzprotein unter der Kontrolle eines Zelltyp-spezifischen Promotor eine Population von Herzvorläuferzellen von Zebrabärbling-Embryonen in mikrofluidischen assistierten Einzelzellerfassungssystem zur Verwendung zur Anreicherung Expression einer Untergruppe von Herz Gene in einzelnen zu beurteilen Zellen. Vorausgesetzt, dass FACS Laseranregung und Emissionsfähigkeiten sind kompatibel mit dem Fluorophor (en) der Wahl kann dieses Verfahren für jeden fluo...

Die meisten aktuellen Studien der Zell- und Molekularbiologie sind auf Bevölkerungsdurchschnittswerten. Jedoch können wichtige biologische Ereignisse, die von diesen traditionellen populationsbasierten Analysen maskiert werden, da kleinere Populationen wichtige Rollen in biologischen Prozessen und Krankheitsverlauf spielen können. Genexpression in heterogenen Populationen auf Einzelzellebene zu verstehen , kann (und hat) führen zu relevanten biologischen und klinischen Erkenntnisse 1,2. Von Bedeutung für die embryonale Entwicklung Studien, in einer größeren Population von Zellen, sind Vorläuferzellen oft unterrepräsentiert, so dass es schwierig subtile Veränderungen in der Genexpression zu erkennen , die letztlich Entscheidungen Zellschicksal 3 einzuleiten. In ähnlicher Weise kann eine einzige Zelltyp unterschiedlich haben Expressionsprofile in Reaktion auf die Mikroumgebung 4. Zum Beispiel resident Endothelzellen im selben Organ oder in verschiedenen Organen (z. B. Aorta oder Niere) zeigen signifikante Heterogenität trotz teilen gemeinsame morp5 hological und funktionellen Eigenschaften. Darüber hinaus können die gleichen Tumor Bestücken Krebszellen haben auch molekularen Profile oder Mutationen auf Einzelzellebene 6 variiert. In Modellsystemen hat Transkriptomik in einzelnen Zellen erfolgreich neue Zellpopulationen identifiziert, charakterisiert Zwischenzustände , die während der Zelldifferenzierung auftreten, und offenbarte Differential zelluläre Reaktionen 7.8.9 auf Reize. Solche Einsichten hätte in herkömmlichen populationsbasierten Studien maskiert. Zebrabärbling-Embryonen sind eine enorm in Anspruch genommenen Quelle von Stammzellen, Vorläufer und differenzierenden Zellen für Fragen der einzelnen Zelle Heterogenität und molekulare Regulation von zellulären Identitäten während der Entwicklung zu erforschen. Ihre hoch schablonenhaft , ex vivo Entwicklung und einfache genetische Manipulation machen sie ein ausgezeichnetes Modellsystem für diesen Ansatz 10,11. Insbesondere wird eine große Einschränkung der Interpretation von einzelnen Zelle gene - Expressionsdaten ist , dass eine zuverlässige Identifizierung neuer Zwischenzellenzustände während der Entwicklung sehr sorgfältige Timing von Gewebe erfordert Sammlung 9. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass die Heterogenität zwischen gefangenen Zellen Heterogenität innerhalb eines Gewebes an einem einzigen Zeitpunkt anstatt Heterogenität in der Genexpression stellt durch altersabhängige Zelldifferenzierung dargestellt. Im Vergleich zu Mäusen, Zebrabärbling Embryonalentwicklung genau über eine große Anzahl von Embryos 12 synchronisiert werden kann. Zusätzlich mit großer Gelegegrößen, Genaktivität kann als ergiebige Quelle für Stamm- und Vorläuferzellen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, Zellen von Zebrafischembryos zu isolieren und Einzelzellen mit einem handelsüblichen integrierten Mikrofluidik Schaltung (IFC) Chip und Autoprep System für qRT-PCR Genexpressionsanalyse zu erfassen. Dieses Protokoll kann keinen hohen Durchsatz Multiplexassays einschließlich ganze schnell übertragbarTranskriptom - Sequenzierung , die 13 umfassendere Analyse der zellulären Heterogenität ermöglicht. Es bietet auch einige Vorteile zu herkömmlichen Genexpressionsassays. Die Einzelzellisolierung Protokoll ergibt eine hohe Lebensfähigkeit nach FACS, die den Anteil von kompromittierten Zellen verringert, die in Downstream-Anwendungen enthalten sind. Durch die Verwendung eines IFC kann gefangenen Zellen direkt Erfassungsraten beobachtet werden, um zu bewerten und Zellgesundheit morphologisch beurteilen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll zu der Zebrabärbling Forschungsgemeinschaft breit anwendbar und erfordert nur einen markierten transgenen Fischen Linie und den Zugang zu mikrofluidischen Zellerfassungstechnologien. Als Beweis für das Prinzip, von Herz-Vorläufern abgeleitet Einzelzellen wurden auf einem IFC Chip isoliert und gefangen genommen und dann die relative Häufigkeit von Herz-Differenzierungsmarker wurde durch qRT-PCR gemessen. Genexpressionsanalyse auf Einzelzellebene zeigt, dass Herz-Vorläufern mit ihren differe koexistierenntiating Nachkommen. Die Einsicht von Single-Cell-Profilierung von Herz-Vorläufern gewonnen können unter Herzvorläuferzellen während der Entwicklung von Wirbeltieren Licht auf die Heterogenität in Genexpressionsmuster Schuppen, die in der traditionellen populationsbasierten Analysen maskiert wurden.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Zur Entfernung des Chorions aus Embryonen</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 μm Zellsieb</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Kulturschale</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen mit 35 μm Zellensieb</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 und Spitzen</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 und Spitzen</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC-Chip-Herstellerprotokoll</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 wurde in einem repräsentativen Experiment verwendet</td></tr><tr><td>Papageienglaspipette mit breitem Durchgang</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Für Transfer von Embryonen</td></tr><tr><td>Adulter Wildtyp-Zebrafisch</td><td>N/A</td><td></td><td>Wir verwendeten AB-Linie</td></tr><tr><td>Adulter transgener Zebrafisch</td><td>N/A</td><td></td><td>Wir verwendeten Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien für die Zelldissoziation</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelt destilliertes Wasser</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Meersalz</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>Bestand in Wasser herstellen und zum Dottern Puffer</td></tr><tr><td>verwenden KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>Bestand in Wasser herstellen und zum Dottern Puffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma verwenden Aldrich</td><td>S6014</td><td>Brühe in Wasser herstellen und zur Dotterentgiftung verwenden</td></tr><tr><td>Puffer Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Hitze inaktivieren; jede Marke von FBS sollte in Ordnung sein</td></tr><tr><td>Zelldissoziationsreagenz 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Zelldissoziationsreagenz 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>-20 lagern; auf Eis auftauen; vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen</td></tr><tr><td>Pronase (optional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Farbstoff - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Jeder Lebend-/Totfleck, der für die Durchflusszytometrie geeignet ist, funktioniert</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare<</td></tr><tr><td>strong>Reagenzien für die Verwendung von IFC-Platten und qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen-spezifische Sonden</td><td></td><td></td><td>variieren je nach Experiment</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien, die im IFC-Herstellerprotokoll</td><td></td><td></td><td></td>aufgeführt</tr><tr><td>sind C1 Reagenzien-Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagenzien zum Laden von Zellen auf IFC-Platte</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagenzien für reverse Transkription und Voramplifikationsschritte</td></tr><tr><td>Molekularbiologie Qualität Wasser</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC für PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>IFC Platte für kleine Zellen</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</strong</td><td>><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep Gerät</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Für IFC-Platten Verwendung</td></tr><tr><td>Hämozytometer&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Zum Zählen von Zellen und zur Bestimmung der Zellgröße</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td></td><td></td><td>Zur Entnahme von Embryonen aus Chorion</td></tr><tr><td>Gewebekulturmikroskop</td><td></td><td></td><td>Zur Beurteilung des Einzelzellverdaus</td></tr><tr><td>FACS-Gerät</td><td></td><td></td><td>Zur Isolierung von Zellen von Interesse</td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von einzelzellen aus zebrafischembryonen

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein leistungsfähiger Modellorganismus, um die Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Obwohl viele Aspekte der Embryonalentwicklung von Zebrafischen auf morphologischer Ebene beschrieben wurden, ist wenig über die molekularen Grundlagen der zellulären Veränderungen bekannt, die im Laufe der Entwicklung des Organismus auftreten. Mit den jüngsten Fortschritten in der Mikrofluidik und Multiplexing-Technologie ist es nun möglich, die Genexpression in einzelnen Zellen zu charakterisieren. Dies ermöglicht die Untersuchung der Heterogenität zwischen einzelnen Zellen spezifischer Zellpopulationen, um Zellsubtypen zu identifizieren und zu klassifizieren, Zwischenzustände zu charakterisieren, die während der Zelldifferenzierung auftreten, und differentielle zelluläre Reaktionen auf Reize zu erforschen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Isolierung lebensfähiger, einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen für Hochdurchsatz-Multiplexing-Assays. Diese Methode kann schnell auf jeden embryonalen Zelltyp des Zebrafisches mit fluoreszierenden Markern angewendet werden. Eine Erweiterung dieser Methode kann auch in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien verwendet werden, um das Transkriptom einzelner Zellen vollständig zu charakterisieren. Als Beweis für das Prinzip wurde die relative Häufigkeit von kardialen Differenzierungsmarkern in isolierten, einzelnen Zellen untersucht, die von nkx2,5 positiven kardialen Vorläuferzellen abgeleitet wurden. Durch die Auswertung der Genexpression auf Einzelzellebene und zu einem einzigen Zeitpunkt unterstützen die Daten ein Modell, in dem kardiale Vorläuferzellen mit differenzierenden Nachkommen koexistieren. Die hier beschriebene Methode und der Arbeitsablauf sind auf breiter Basis für die Zebrafisch-Forschungsgemeinschaft anwendbar und erfordern lediglich eine markierte transgene Fischlinie und Zugang zu Mikrofluidik-Technologien.

Als Beweis für das Prinzip wurde die Genexpression zu bewerten Differenzierung Dynamik während der Herzentwicklung erforschen. In Zebrabärbling entstehen Herzvorläuferzellen aus einer mesodermalen Population von Zellen, die an der vorderen Seitenplatte Mesoderm wandern, wo sie verschmelzen die lineare Herzrohr zu bilden. Vor der Fusion beginnen Herz Vorläufern den Transkriptionsfaktor Nkx2.5 (NK2 homeobox 5) zum Ausdruck bringen, die die früheste spezifischer Marker für Herz-Vor...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, einzelne Zellen aus frühen Zebrafischembryonen zu isolieren und in einem mikrofluidikbasierten Multiplex-System für Einzelzellen zu erfassen, um die Genexpression einzelner Zellen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise welche transkriptionellen Veränderungen Zellen während der Spezifikation und Differenzierung durchlaufen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine unvoreingenommene Herangehensweise darstellt, um die Heterogenität aufzudecken, die bei herkömmlichen, auf Zellpopulationen basierenden Methoden verborgen bleibt.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da die Herstellung lebensfähiger Einzelzellpräparationen technisch anspruchsvoll ist, aber für die nachgeschaltete Analyse unerlässlich. Sobald die Methode beherrscht wird, kann die Aufarbeitung von gesamten Embryoproben zu einzelnen lysierten Zellen auf einem integrierten mikrofluidischen Chip innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden, sofern die Schritte ordnungsgemäß durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass nur Einzelzellen auf dem mikrofluidischen Gerät erfasst werden.Nach der Zucht von erwachsenen Wildtyp- und transgenen Zebrafischen sammeln Sie die Embryonen in Abständen von 15 Minuten gemäß den von der Einrichtung und Institution genehmigten Standardarbeitsanweisungen. Mindestens zwei Stunden später überführen Sie 100 bis 300 befruchtete Embryonen eines einzelnen Zeitpunkts in eine neue Petrischale mit frischem Ei-Wasser. Entfernen Sie mithilfe feiner Pinzette manuell die Chorionhülle von jedem Embryo.Als Nächstes überführen Sie die Embryonen mit einer Glaspipette mit großer Öffnung in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem minimalen Volumen an Ei-Wasser. Nachdem alle Embryonen überführt wurden, ersetzen Sie das Wasser durch 1 Milliliter eiskaltes Ei-Wasser und stellen das Röhrchen für 20 Minuten in Eis. Nach der Euthanasie entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette mit großer Öffnung.Sowie eine P-1000-Pipette, um die Embryonen zweimal mit frischem Ei-Wasser zu versetzen. Nach der zweiten Wäsche das Ei-Wasser durch 1 Milliliter De-Yolking-Puffer ersetzen und mit einer P-1000-Pipette die Embryonen acht bis zwölf Mal pipettieren, bis das Eigelb aufgelöst ist und nur noch die Körper der Embryonen sichtbar sind. Das Gewebe durch Zentrifugation sammeln.Entfernen Sie anschließend vorsichtig mit der Pipette den Überstand, ohne das Gewebepellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter frischem Ei-Wasser. Nachdem die Embryonen zwei weitere Male gewaschen wurden, resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Zell-Dissociations-Reagenz-1 bei Raumtemperatur. Danach legen Sie das Röhrchen für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zur Seite.Unter vorsichtiger Trituration alle zwei bis drei Minuten, um Klumpenbildung zu vermeiden. Am Ende der Inkubation die Zellen erneut abzentrifugieren und den Pellet in 1 Milliliter Zelldissoziationsreagenz-2 resuspendieren. Die Zellen anschließend horizontal bei Raumtemperatur weitere fünf bis 15 Minuten inkubieren, wobei alle zwei bis drei Minuten vorsichtig getraturiert wird.Alle fünf Minuten 2 Mikroliter Überstand in 18 Mikroliter FACS-Puffer verdünnen und die Zellen als Tropfen auf eine Zellkulturschale geben. Eine Deckglas über die Probe legen und mit einem Gewebekulturmikroskop die Verdauungsfortschritte bei 10- und 20-facher Vergrößerung beurteilen. Sobald die Probe hauptsächlich aus Einzelzellen mit einigen kleinen und großen Zellclustern sowie vereinzelten weitgehend intakten Embryonalanlagen besteht, die Zellen abzentrifugieren und das Pellet in 1 Milliliter kaltem FACS-Puffer resuspendieren.Als Nächstes benetzen Sie einen 40-Micron-Zellfilter mit FACS-Puffer und filtrieren die Zellen durch den Filter in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale. Nach erneutem Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie das Zellpellet in 100&nbsp;Mikroliter FACS-Puffer und bestimmen die Anzahl der vitalen Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss.Verdünnen Sie die Probe anschließend auf 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Reservieren Sie 10–20 % der Zellen für die unbehandelte Kontrolle. Färben Sie den Rest der Zellen mit einem fluoreszenten Farbstoff zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.Befeuchten Sie dann ein mit einem 35-Mikrometer-Zellfilter versehenes FACS-Röhrchen mit 20 Mikrolitern FACS-Puffer und geben Sie die Zellen auf den Filter, wobei Sie sie durch Schwerkraft sammeln. Sortieren Sie anhand der dargestellten Gating-Strategie die einzelnen lebenden Zellen, die den fluoreszierenden Marker exprimieren. Überprüfen Sie das Gating mit den doppelt markierten Zellen.Sortieren Sie 2.000 bis 4.000 Zellen aus der Zellpopulation der Wahl in 5 Mikroliter kalte FACS-Pufferlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Überführen Sie anschließend 1 Mikroliter der sortierten Zellen in ein neues FACS-Röhrchen mit 100 Mikrolitern FACS-Sortierpuffer und einer 1:1.000-Verdünnung der Vitalfärbung. Führen Sie dann die Zellprobe unter Verwendung der Sortiertore durch, um die Lebensfähigkeit nach der Sortierung zu überprüfen.Laden Sie anschließend 1 Mikroliter der in 9 Mikrolitern FACS-Puffer verdünnten Zellen auf ein Hämozytometer auf, um die Zellkonzentration und den durchschnittlichen Durchmesser zu bestimmen. Wählen Sie nun einen integrierten mikrofluidischen Schaltkreis (IFC-Chip) passender Größe entsprechend dem durchschnittlichen Zelldurchmesser der Probe aus und befüllen Sie die Fluidik gemäß den Herstelleranweisungen. Laden Sie die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen auf die Platte auf und setzen Sie die Platte in eine kompatible Fluidikmaschine ein.Danach ein geeignetes Zellladeskript für den IFC-Chip ausführen, um die Zellen in die Erfassungsschienen zu befördern. Um zu bestätigen, dass die Zellen in den Erfassungsstellen verankert sind, die Platte auf ein Mikroskop mit Plattenadapter setzen und Helligkeitsfeld- und Fluoreszenzbilder jeder Erfassungsstelle mit 10facher Vergrößerung aufnehmen. Anschließend können die Zellen für die nachgeschaltete Analyse ihrer Zielgenexpression mittels QRT-PCR aufgearbeitet werden.Im Stadium mit 18 Somiten kann die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die ZsYellow-Expression der Embryonen zu überprüfen. Nach der Sortierung erhält man Zellen mit einer Reihe von Durchmessern. Die IFC-Platte kann verwendet werden, um Zellen mit einem bestimmten Durchmesser einzufangen.Beispielsweise hatten die Zellen in diesem Experiment einen Durchmesser von fünf bis zehn Mikrometern. Wie erwartet zeigten die sortierten und gewonnenen Zellen aus Embryonen 18 Stunden nach der Befruchtung den fluoreszierenden Marker ZsYellow. Hier wurde eine quantitative RT-PCR verwendet, um die relative Genexpression spezifischer Gene von Interesse in 40 einzelnen Zellen aus den Zellaufnahmestellen einer IFC-Platte zu untersuchen.Da der Bereich der Zyklenschwellenwerte für das Housekeeping-Gen zu breit war, um die Genexpression zwischen den Proben vergleichen zu können, und viele Zyklenschwellenwerte 30 überschritten, wurden die Werte als Heatmap dargestellt. Beim Vergleich der Proben zeigte sich in diesem Experiment eine erhebliche Heterogenität in der Genexpression, wobei die Zellen basierend auf ihrem Expressionsmuster in die Typen 1 bis 5 eingeteilt wurden.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann die Aufbereitung von gesamten Embryoproben zu einzelnen lysierten Zellen auf einem integrierten mikrofluidischen Chip innerhalb von sechs Stunden abgeschlossen werden, sofern die Schritte ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass nur Einzelzellen auf dem mikrofluidischen Chip erfasst werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die hochdurchsatzfähige Einzelzellsequenzierung angewendet werden, um die Transkriptomprofile einzelner Zellen vollständig zu charakterisieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, um die zelluläre Heterogenität in frühen sich entwickelnden Embryonen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zellen aus Zebrafisch-Embryonen isoliert, einzelne Zellen in einem mikrofluidikbasierten Einzelzell-Multiplex-System erfasst und die Genexpression einzelner Zellen bewertet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden...

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese mikrofluidische Methode ermöglicht die Analyse von Genexpressionsmustern einzelner Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

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