Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einzelne Zellen aus Zebrafischembryonen im Frühstadium zu isolieren, um sie in einem mikrofluidikbasierten Einzelzell-Multiplexsystem zu erfassen, um die Genexpression einzelner Zellen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche transkriptionellen Veränderungen Zellen während der Spezifizierung und Differenzierung durchlaufen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um einen unvoreingenommenen Ansatz handelt, um die Heterogenität aufzudecken, die in herkömmlichen populationsbasierten Techniken maskiert wird.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Herstellung der lebensfähigen Präparate einzelner Zellen technisch anspruchsvoll, aber für die nachgelagerte Analyse unerlässlich ist. Einmal gemeistert, kann die Verarbeitung der gesamten Embryoproben zu einzelnen lysierten Zellen auf einem integrierten mikrofluidischen Chip in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn die Schritte richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass nur einzelne Zellen auf dem mikrofluidischen Gerät eingefangen werden.

Nach der Zucht von adulten Wildtyp- und transgenen Zebrafischen werden die Embryonen im Abstand von 15 Minuten gemäß den von der Einrichtung und der Institution genehmigten Standardarbeitsanweisungen entnommen. Mindestens zwei Stunden später übertragen Sie 100 bis 300 befruchtete Embryonen von einem einzigen Zeitpunkt in eine neue Petrischale mit frischem Eiwasser. Und verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Chorion manuell aus jedem Embryo zu entfernen.

Verwenden Sie anschließend eine Glaspipette mit breitem Durchgang, um die Embryonen in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer minimalen Menge Eiwasser zu übertragen. Wenn alle Embryonen übertragen wurden, ersetzen Sie das Wasser durch 1 Milliliter eiskaltes Eiwasser und tauchen Sie den Schlauch 20 Minuten lang in Eis. Nach der Einschläferung verwenden Sie eine Glaspipette mit breitem Durchgang, um den Überstand zu entfernen.

Und eine P-1000-Pipette, um den Embryonen zweimal frisches Eiwasser hinzuzufügen. Ersetzen Sie nach dem zweiten Waschen das Eiwasser durch 1 Milliliter Dotterpuffer und verwenden Sie eine P-1000-Pipette, um die Embryonen acht- bis zwölfmal zu zerreiben, bis sich das Eigelb aufgelöst hat und nur noch die Körper der Embryonen sichtbar sind. Sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation.

Entfernen Sie dann mit der Pipette vorsichtig den Überstand, ohne das Gewebepellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen wieder in 1 Milliliter frischem Eiwasser. Nachdem Sie die Embryonen zwei weitere Male gewaschen haben, suspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Zelldissoziationsreagenz 1 bei Raumtemperatur. Legen Sie dann das Röhrchen für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur auf die Seite.

Mit sanfter Verreibung alle zwei bis drei Minuten, um ein Verklumpen zu verhindern. Am Ende der Inkubation schleudern Sie die Zellen wieder herunter und suspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Zelldissoziationsreagenz-2. Inkubieren Sie die Zellen horizontal bei Raumtemperatur für weitere fünf bis 15 Minuten mit sanfter Verreibung alle zwei bis drei Minuten.

Verdünnen Sie alle fünf Minuten 2 Mikroliter Überstand in 18 Mikrolitern FACS-Puffer und geben Sie die Zellen als Tröpfchen auf eine Zellkulturschale. Legen Sie ein Deckglas über die Probe und verwenden Sie ein Gewebekulturmikroskop, um den Verdauungsfortschritt bei 10- und 20-facher Vergrößerung zu beurteilen. Wenn das Präparat eine Mischung aus hauptsächlich einzelnen Zellen mit einigen kleinen und großen Zellclustern und einigen meist intakten Embryokörpern zu sein scheint, schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder in 1 Milliliter kaltem FACS-Puffer

Befeuchten Sie anschließend ein 40-Mikron-Zellsieb mit FACS-Puffer. Und filtrieren Sie die Zellen durch das Sieb in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale. Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 100 Mikrolitern FACS-Puffer und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss.

Als nächstes verdünnen Sie die Probe auf 5 mal 10 auf die 6. Zellen pro Milliliter. Und reservieren Sie 10 bis 20 % der Zellen für die ungefärbte Kontrolle. Färben Sie den Rest der Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff für die Unterscheidung lebend/tot.

Befeuchten Sie dann ein mit einem 35-Mikron-Zellsieb verschlossenes FACS-Röhrchen mit 20 Mikrolitern FACS-Puffer, geben Sie die Zellen in das Sieb und sammeln Sie sie durch Schwerkraft. Sortieren Sie mit der dargestellten Gating-Strategie die einzelnen lebenden Zellen, die den fluoreszierenden Marker exprimieren. Überprüfung des Anschnitts mit den doppelt beschrifteten Zellen.

Sortieren Sie 2.000 bis 4.000 Zellen aus der interessierenden Population in 5 Mikroliter kalten FACS-Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Übertragen Sie dann 1 Mikroliter der sortierten Zellen in ein neues FACS-Röhrchen mit 100 Mikrolitern FACS-Sortierpuffer und einer Verdünnung von 1 bis 1.000 Grad Lebend-/Totfärbung. Und führen Sie die Zellprobe mit den Sortierschiebern durch, um die Lebensfähigkeit nach der Sortierung zu beurteilen.

Laden Sie anschließend 1 Mikroliter Zellen, verdünnt in 9 Mikrolitern FACS-Puffer, auf ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration und den durchschnittlichen Durchmesser zu bestimmen. Wählen Sie nun einen integrierten mikrofluidischen Schaltkreis oder IFC-Chip aus, der für den durchschnittlichen Zelldurchmesser der Probe geeignet ist, und grundieren Sie die Fluidik gemäß den Anweisungen des Herstellers. Laden Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Platte und laden Sie die Platte in eine kompatible Fluidikmaschine.

Führen Sie dann ein entsprechendes Zellenladeskript für den IFC-Chip aus, um die Zellen in die Capture-Lanes zu schieben. Um zu bestätigen, dass sich die Zellen in den Fangstellen befinden, montieren Sie die Platte an einem Mikroskop, das mit einem Plattenadapter ausgestattet ist, und erhalten Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder jeder Fangstelle mit einer 10-fachen Vergrößerung. Die Zellen können dann für die nachgelagerte Beurteilung ihrer Zielgenexpression mittels QRT-PCR aufbereitet werden.

Im 18-Somiten-Stadium kann die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die ZsYellow-Expression der Embryonen zu überprüfen. Nach dem Sortieren erhält man Zellen mit unterschiedlichen Durchmessern. Die IFC-Platte kann verwendet werden, um Zellen mit einem gewünschten Durchmesser zu erfassen.

In diesem Experiment wurden zum Beispiel Zellen mit einem Durchmesser von fünf bis 10 Mikrometern verwendet. Wie erwartet exprimierten die sortierten und gefangenen Zellen aus Embryonen 18 Stunden nach der Befruchtung den ZsYellow-Fluoreszenzmarker. Hier wurde die QRT-PCR verwendet, um die relative Genexpression spezifischer Gene von Interesse in 40 Einzelzellen von Zellfangstellen auf einer IFC-Platte zu bestimmen.

Da der Bereich der Zyklusschwellenwerte für das Housekeeping-Gen zu groß war, um die Genexpression zwischen den Proben zu vergleichen, und viele Zyklusschwellenwerte 30 überstiegen, wurden die Werte als Heatmap visualisiert. Beim Vergleich zwischen den Proben wurde in diesem Experiment eine erhebliche Heterogenität in der Genexpression beobachtet. Mit Zellen, die aufgrund ihres Genexpressionsmusters in die Typen 1 bis 5 eingeteilt werden.

Einmal gemeistert, kann die Verarbeitung der gesamten Embryoproben zu einzelnen lysierten Zellen auf einem integrierten mikrofluidischen Chip in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn die Schritte korrekt ausgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass nur einzelne Zellen auf dem mikrofluidischen Chip eingefangen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Hochdurchsatz-Einzelzellsequenzierung durchgeführt werden, um die Transkriptome einzelner Zellen vollständig zu charakterisieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie zur Erforschung der zellulären Heterogenität in sich früh entwickelnden Embryonen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zellen aus Zebrafischembryonen isoliert, einzelne Zellen in einem mikrofluidischen Basis-Einzelzell-Multiplexsystem einfängt und die Genexpression einzelner Zellen bewertet.