Name: TRUE Gene Silencing: Screening eines Heptamer-Typ Kleiner Leitfaden RNA-Bibliothek für potentielle Krebs Therapeutika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie ein Screening-Protokoll für Heptamer-sgRNA-Bibliotheken zur Identifizierung potenzieller Therapeutika gegen Blutkrebs. Diese Methode unterstützt gezielte Genomeditierung für die Onkologie-Forschung.

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Diese Arbeit wurde von Anpassungsfähig und Seamless Technologie-Transfer-Programm durch zielorientierte F &amp; E, Japan Science and Technology Agency, die Wissenschaft Forschungsförderungsfonds von der Förderung und den gegenseitigen Aid Corporation für Privatschulen von Japan unterstützt, und die JSPS KAKENHI Grants-Nummern 24300342 und 15H04313 .

1. Aufbau eines Heptamer-Typ sgRNA Bibliothek <ol><li> Wählen einer Teilmenge der 16.384 (4 7) 7-nt - Sequenzen , wenn der umfassende Bibliothek konstruiert werden soll. HINWEIS: Die Sequenzen können statistische und / oder gestaltet sein, spezifische zelluläre RNAs abzuzielen. Für letztere hairpin - Strukturen ähnlich der T-Arm von tRNA in einer Ziel - RNA mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms zu finden und / oder optisch und wählen Sequenzen komplementär zu 7-nt - Sequenzen unmittelbar stromabwärts der Haarnadelstrukturen 4,10, 17,18. </li><li> Synthetisieren jedes der ausgewählten Heptamere als ein vollständig 2&#39;- O -methylated, 5&#39;- und 3&#39;-phosphorylierter RNA mit einem DNA / RNA - Synthesizer. Verwenden Sie die Phosphoramidit-Methode auf dem Glas mit kontrollierten Poren (CPG) Unterstützung, und lassen Sie das 5&#39;-terminale 4,4&#39;-Dimethoxytrityl (DMT) Gruppe im letzten Zyklus zu schützen (die Zugabe des Phosphat &#39;5) der Synthese 23. HINWEIS: Benutzerdefinierte synth e tisches RNA kann auch von Oligonukleotid-Lieferanten erhalten werden. </li><li> Nach Abschluss der letzten Synthesezyklus, übertragen Sie die CPG mit dem synthetisierten Oligonukleotid aus der Säule in eine Glasampulle mit einem Schraubverschluss Teflon-Liner, 1 ml von 29% Ammoniumhydroxid und brüten sie bei 55 ° C für 8 h auf das Oligonucleotid von dem CPG abzuspalten und die Schutzgruppen von den Basen und Phosphaten entfernen. </li><li> Verdunsten Ammoniumhydroxid mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und wieder aufzulösen das Oligonucleotid in 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetat. </li><li> Reinige den synthetischen Oligonukleotids durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Polystyrol-Divinylbenzol-Säule mit einem Puffer, der 10-50% Acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetat. Führen Sie die Säule bei 2,0 ml / min für 25 min bei 80 ° C. </li><li> Hinzufügen 0,25-0,5 ml konzentrierter Essigsäure zu der fraktionierten Probe (1-2 ml), eine 20% ige Essigsäurelösung zu machen, und Incubate diese Lösung für 1 h bei Raumtemperatur die DMT-Gruppe zu entfernen. </li><li> Trocknen der Probe mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C, wieder aufzulösen sie in 1 ml von 29% igem Ammoniumhydroxid, und Inkubieren der Lösung für 15 min bei Raumtemperatur die Seitenkette des 5&#39;-Phosphat zu entfernen. </li><li> Reduzieren das Volumen (1 ml) der Probe auf etwa 0,3 ml mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C. </li><li> Dialysieren die gesamte konzentrierte Probe gegen destilliertes Wasser (500 ml) über Nacht einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewichts-Cut-off 1000 bei 4 ° C verwendet wird. </li><li> Übertragen die dialysierte Probe aus dem Dialyseschlauch in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette, trocknen mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und anschließend wieder aufzulösen es in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser, dessen Volumen sollte klein genug, um eine von mehr als 100 uM Lösung herzustellen. </li><li> Messen, um eine optische Dichte der RNA bei 260 nm mit einem Spektrophotometer und stellen seine Konzentration auf 100uM von Wasser zur Injektion-grade Zugabe von Wasser. Speichern die RNA-Lösung bei unter -20 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Screening der sgRNA Bibliothek für Zell Viability <ol><li> Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60 und RPMI-8226) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Bereiten Vertiefungen, die die Medien nur für Untergrundsubtraktion. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen. </li><li> 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 &amp; mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Assay jedes sgRNA in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage. </li><li> Eine geeignete Menge eines handelsüblichen WST-8-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C im selben Inkubator für 1 bis 4 Stunden. </li><li> Messen Sie die Absorption einT 450 nm mit einem Mikroplattenleser. HINWEIS: In den meisten Fällen Linearität zwischen Extinktion und Lebendzellzahl wird beibehalten werden, es sei denn der Wert Extinktion 1,0 übersteigt. </li></ol> 3. Bewertung der effektiven sgRNAs durch Durchflusszytometrie <ol><li> Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Vorbereitung mindestens 10 Vertiefungen für eine sgRNA getestet werden. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen. </li><li> 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 &amp; mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage. </li><li> Sammeln Sie die mit dem gleichen sgRNA behandelten Zellen von mindestens 10 Brunnen in einen 5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 · g, und entsorgen Sie die Medien. </li><li> 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit dem Rohr und resuspendieren der Zellen. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 g und verwerfen PBS. Zugabe von 150 ul 1x Annexin V-Bindungspuffer auf das Rohr und die Zellen erneut zu suspendieren. </li><li> In 2 ul Phycoerythrin (PE) konjugiertem Annexin V-Lösung und 1 ul 7-Aminoactinomycin D (7AAD) Lösung in das Röhrchen, mischen sie gut, und Inkubation die Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Analysieren Sie die Probe ein Durchflusszytometer 24 verwendet wird . </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

An der Universität für Pharmazie und angewandte Biowissenschaften Niigata ist eine Patentanmeldung für eine Untergruppe der sgRNAs vom Heptamer-Typ anhängig.

In den meisten Fällen scheinen vollständig 2′-O-methylierte, 5′- und 3′-phosphorylierte sgRNAs vom Heptamer-Typ, die in Wasser für Injektionszwecke (in einer Konzentration von 100 μM) gelöst wurden, mindestens ein Jahr lang bei unter -20 °C stabil zu sein, wenn man ihre Aktivität zur Induktion von Apoptose in Krebszellen betrachtet. Ihre Stabilität würde sich jedoch je nach Reihenfolge, Qualität und Reinheit ändern. In einigen Fällen scheint 5'- oder 3'-Phosphat eines Teils der sgRNA-Moleküle während der Lagerun...

TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist einer der RNA-directed gene silencing Technologien 1. Diese Technologie wurde auf die Eigenschaften von tRNase Z L (oder 3 &#39;tRNase), tRNA 3&#39; - Prozessierung Endoribonuclease entwickelt basiert: es jedes Ziel - RNA an einer erwarteten Stelle unter der Leitung eines künstlichen kleinen Führungs RNA spalten kann (sgRNA) durch eine Anerkennung pre-tRNA-ähnlichen oder Mikro pre-tRNA-ähnlichen Struktur zwischen der Ziel - RNA gebildet , und der sgRNA 2-9. sgRNA, die in der Regel 7-31 nt in der Länge, ist in vier Gruppen eingeteilt, 5&#39;-Hälfte-tRNA, RNA Heptamer, 14-nt RNA linear und hook RNA. Wir haben die Wirksamkeit von TRUE gene silencing demonstriert durch verschiedene künstlich gestaltete sgRNAs Einführung in die Zellen 10 leben - 15. Wir haben auch gezeigt, dass sgRNAs durch Zellen wi aufgenommen werden kann,thout jegliche Transfektionsreagenzien und können ihre Ziel - RNA - Niveaus downregulate und / oder Apoptose in menschlichen Krebszellen induzieren 16 - 18. TRUE Gen - Silencing erscheint auf dem intra- und interzellulären Genregulationsnetz System über tRNase Z L und natürliche sgRNAs 19 zu arbeiten - 21. Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamers-Typ sgRNAs konstruiert 22 für potentielle therapeutische Heptamers-Typ sgRNAs für Blutkrebs zu suchen. Wir haben es für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Und 4 von ihnen haben gezeigt, dass Tumorwachstumsraten in Maus-Xenograft Experimente reduzieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wiezu konstruieren, die sgRNA Bibliothek, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie Zytometrie die effektiven sgRNAs durch die Strömung weiter auszuwerten. Analyse für sgRNA der zellulären Ziel - RNAs und Bewertung der effektiven sgRNAs in Modellen Maus - Xenotransplantat kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden 17,22, obwohl diese in diesem Protokoll nicht enthalten.

<table><tbody><tr><td>Benutzerdefinierte Heptamer-RNA</td><td>Nippon Bioservice OligoSep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prep HC Kartusche</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Wasser für Injektionszwecke</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mittel</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mischlösung</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Platte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 Lösung</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Bindungspuffer</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true gene silencing: screening eines heptamer-typ kleiner leitfaden rna-bibliothek für potentielle krebs therapeutika

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist eine von der RNA-gerichtete Gen - Silencing - Technologien, die eine künstliche kleine Führungs RNA (sgRNA) verwendet tRNA 3&#39; - Prozessierung Endoribonuklease zu führen, tRNase Z L eine Ziel-RNA zu erkennen. sgRNAs kann durch Zellen ohne Transfektionsreagentien aufgenommen werden und können ihre Ziel-RNA-Niveaus und / oder induzieren Apoptose in menschlichen Krebszellen downregulate. Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamer-Typ sgRNAs für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wie die sgRNA Bibliothek zu konstruieren, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie fueitere bewerten die effektiven sgRNAs mittels Durchflusszytometrie. Rund 2.000 Treffer wäre zu erwarten, durch das Screening der Full-Scale sgRNA Bibliothek von 16.384 Heptamere zusammengesetzt zu erhalten.

Die sechs Heptamer-Typ sgRNAs 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;-ACACACA-3&#39; (H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3&#39; (H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287) und 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) wurden chemisch synthetisiert , wie 2&#39; - O - methyl RNA enthaltenden 5&#39;- und 3&#39;-Phosphate. Diese sgRNAs wurden die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit eines menschlichen Leukämie-Zelllin...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs.

TRUE Gene Silencing: Screening eines Heptamer-Typ Kleiner Leitfaden RNA-Bibliothek für potentielle Krebs Therapeutika

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Screenings besteht darin, potenzielle therapeutische Wirkstoffe gegen Blutkrebs zu finden. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Teilmenge von Heptamer-Sequenzen auswählen. Die Sequenzen können zufällig sein oder so gestaltet sein, dass sie gezielt bestimmte zelluläre RNAs ansprechen. Um spezifische zelluläre RNAs anzusteuern, verwenden Sie ein geeignetes Computerprogramm, um Haarnadelschleifenstrukturen zu identifizieren, die dem T-Arm in einer Ziel-RNA ähneln. Wählen Sie komplementäre Sieben-Nukleotid-Sequenzen direkt stromabwärts der Haarnadelschleife aus. Synthetisieren Sie mittels der Phosphoramidit-Methode auf einer Controlled-Pore-Glass- (CPG-)Trägersubstanz jedes der ausgewählten Heptamere als vollständig 2′-O-methylierte, 5′- und 3′-phosphorylierte RNA mit dem DNA-RNA-Synthesizer. Lassen Sie die 5′-terminale DMT-Schutzgruppe im letzten Synthesezyklus angebracht. Nach Abschluss des letzten Zyklus überführen Sie das CPG mit dem synthetisierten Oligonukleotid aus der Säule in ein Glasfläschchen mit Schraubverschluss und Teflon-Einlage. Geben Sie 1 mL 29%ige Ammoniumhydroxidlösung hinzu und inkubieren Sie das Gefäß bei 55

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von...

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Lernen Sie ein Screening-Protokoll für Heptamer-sgRNA-Bibliotheken zur Identifizierung potenzieller Therapeutika gegen Blutkrebs. Diese Methode unterstützt gezielte Genomeditierung für die Onkologie-Forschung.

TRUE Gene Silencing: Screening eines Heptamer-Typ Kleiner Leitfaden RNA-Bibliothek für potentielle Krebs Therapeutika

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