Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Fibroblasten in insulinsezernierende Zellen umzuwandeln, ohne Pluripotenz zu induzieren oder retrovitale Vektoren zu verwenden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin und insbesondere in der Zelltherapie von Diabetes zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir einen Schalter im Phänotyp erhalten können, ohne einen stabilen pluripotenten Zustand in den konvertierenden Zellen zu induzieren und ohne retrovirale Vektoren.

Verfahren wird von Georgia Pennarossa, einer Postdoktorandin in unserem Labor, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 1,5 Milliliter sterile 0,1%ige Schweinegelatine in die 35-Millimeter-Petrischalen und lassen Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur beschichten. Waschen Sie anschließend die Biopsien der menschlichen Haut mit PBS, das mit einer 2%igen antibiotischen antimykotischen Lösung ergänzt ist.

Anschließend legen Sie die Biopsien in eine 100-Millimeter-Petrischale und schneiden sie mit sterilen Skalpellen in etwa zwei Kubikmillimeter große Fragmente. Legen Sie dann fünf bis sechs Hautfragmente in die vorbeschichtete 35-Millimeter-Petrischale. Geben Sie ein Tröpfchen Fibroblastenmedium über jedes Fragment und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Nach sechs Tagen Inkubation sind die Gewebefragmente vorsichtig zu entsorgen. Die Fibroblasten sollten beginnen, aus den Gewebefragmenten herauszuwachsen und beginnen, eine Zellmonoschicht zu bilden. Bei diesem Verfahren kultivieren Sie die Fibroblasten bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid bis zu 80 % Konfluenz.

Dann werden die Zellen in neue Kulturschalen eingelegt. Kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und halten Sie das Durchgangsverhältnis je nach Wachstumsrate zwischen eins zu zwei und eins zu vier. Geben Sie anschließend 0,1 % Schweinegelatine in die Zellkulturschalen und lassen Sie sie zwei Stunden lang beschichten.

Entfernen Sie überschüssige Beschichtungslösung 10 bis 30 Minuten vor dem Plattieren von Fibroblasten. Entfernen Sie dann das Fibroblasten-Kulturmedium aus den Kulturschalen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, ergänzt mit 1%iger antibiotischer Antimykotikumslösung.

Fügen Sie dann eine dünne Schicht Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellmonoschicht vom Boden der Gewebekulturschale zu lösen beginnt und die Zellen dissoziieren. Danach verdünnen Sie die Zellsuspension mit neun Teilen Fibroblasten-Kulturmedium, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren.

Zählen Sie dann die Zellen in einer Zählkammer unter dem Mikroskop bei Raumtemperatur. Berechnen Sie das Volumen des Fibroblasten-Kulturmediums, das erforderlich ist, um die Zellen wieder zu suspendieren und die Zellkonzentration von 7,8 mal 10 bis zum 4. Fibroblasten pro Quadratzentimeter zu erhalten. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 150 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie die Zellen erneut mit einem berechneten Volumen Fibroblasten-Kulturmedium. Anschließend die Zellen auf die mit 0,1 % Gelatine beschichteten Schalen aufbringen und 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid kultivieren. Bereiten Sie am Tag Null, unmittelbar vor der Anwendung, 5-aza-CR-Stammlösung vor, indem Sie 2,44 Milligramm 5-aza-CR in 10 Millilitern DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt auflösen.

Sterilisieren Sie es durch Filtration. Als nächstes verdünnen Sie einen Mikroliter 5-Aza-CR-Stammlösung in einem Milliliter Fibroblasten-Kulturmedium. Um die Plastizität der Zellen zu erhöhen, wird 24 Stunden nach der Zellbeschichtung das Kulturmedium von den ausgesäten Fibroblasten entfernt.

Fügen Sie eine mikromolare 5-Aza-CR-Stammlösung hinzu und kultivieren Sie sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie am ersten Tag frische HP Medium zu. Nach der Inkubation mit einem mikromolaren 5-aza-CR wird das Medium entfernt und die Zellen dreimal mit HP-Medium gewaschen, um sicherzustellen, dass 5-aza-CR weggespült wird.

Inkubieren Sie dann die mit 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten drei Stunden lang mit HP-Medium bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Um die Wirksamkeit der 5-aza-CR-Behandlung zu überwachen, prüfen Sie, ob morphologische Veränderungen vorliegen. Die Zellen sollten die typische längliche Morphologie von Fibroblasten verlieren und eine kleinere runde oder ovale Form mit vergrößerten Zellkernen annehmen.

Bereiten Sie an den Tagen eins bis sechs das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse und die Activin A-Stammlösung vor. Kultivieren Sie dann die mit 5-aza-CR behandelten Fibroblasten sechs Tage lang in pankreatischem Basalmedium, das mit Activin A-Stammlösung ergänzt wurde, bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium täglich. Bereiten Sie an den Tagen sieben bis acht die Retinsäure-Stammlösung vor, indem Sie 16,6 Milliliter DMSO zu 50 Milligramm Retinsäure hinzufügen.

Kultivieren Sie die Zellen in Pankreas-Basalmedium, ergänzt mit Activin A-Stammlösung und Retinsäure-Stammlösung, zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium täglich. Kultivieren Sie an den Tagen neun bis 36 die Zellen und das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse, ergänzt mit ITS, B27 und BFGS-Stammlösung, wechseln Sie das Medium in den ersten 15 Tagen täglich und erfrischen Sie das Medium ab dem 16. Tag jeden zweiten Tag. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.

Diese Abbildung zeigt die morphologischen Veränderungen, die während der endokrinen Pankreasdifferenzierung stattfinden. Nach sieben Tagen der Induktion organisieren sich die menschlichen Zellen allmählich in Clustern. Als Reaktion auf die Zugabe von Retinsäure ordnen sie sich in einem retikulären Muster neu an und gruppieren sich in unterscheidbaren Aggregaten.

Diese Formationen schreiten mit der Zeit voran, rekrutieren Zellen und aggregieren vergrößerte 3D-Kolonien. Schließlich werden Kolonien zu kugelförmigen Strukturen, die dazu neigen, sich abzulösen und frei im Nährmedium fließen, was an typische Pankreasinseln in vitro erinnert. Nach 36 Tagen Pankreasinduktion kehrten die globalen DNA-Methylierungsniveaus menschlicher epigenetisch umgewandelter Zellen zu denen zurück, die in den unbehandelten Fibroblasten beobachtet wurden.

Die Kolokalisation von PDX1 mit CPEP wird am Ende der Konversionsphase beobachtet, während diese endokrinen Pankreasmarker in unbehandelten Fibroblasten vollständig fehlen. Diese Grafik zeigt die Menge der Insulinfreisetzung aus den epigenetisch umgewandelten Zellen als Reaktion auf eine Exposition von 20 Millimolaren D-Glukose und 20 Millimolaren L-Glukose. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 38 Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Forschung den Weg für Forscher auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, um die Zelltherapie von Diabetes beim Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fibroblasten in insulinsezernierende Zellen umwandelt, ohne Pluripotenz zu induzieren oder retrovirale Vektoren zu verwenden.