Name: Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Erfahren Sie die epigenetische Umwandlung von adulten Hautfibroblasten in insulinproduzierende Zellen für die Diabetes-Zelltherapie. Diese Methode verzichtet auf pluripotente Zwischenstufen und retrovirale Vektoren.

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Diese Arbeit wurde von Carraresi Stiftung und Europäische Stiftung für die Erforschung von Diabetes (EFSD) gefördert. GP wird von einem Post-Doc-Stipendium der Universität von Mailand unterstützt. Die Autoren sind Mitglieder der COST-Aktion FA1201 Epiconcept: Epigenetik und Periconception Umwelt und die COST Aktion BM1308 Freigabe Fortschritte auf Großtiermodellen (SALAAM). TALB ist Mitglied der COST Action CM1406 Epigenetische Chemical Biology (Epichem).

Hinweis: Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen unter Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Kulturverfahren durchgeführt werden, auf thermostatgesteuerten Bühnen und die Zellen werden bei 37 ° C während ihrer Handhabung beibehalten. 1. Haut Fibroblast Isolation <ol><li> Bereiten Kulturschale Beschichtungslösung <ol><li> Man löst 0,1 g Schweine-Gelatine in 100 ml Wasser (Endkonzentration 0,1%). Sterilisieren Lösung mit Autoklaven. </li><li> 1,5 ml steriler 0,1% Schweinegelatine bis 35 mm Petrischalen. Warten 2 h zu beschichten, so dass sie bei Raumtemperatur gehalten. Hinweis: Menschliche Hautbiopsien erhoben werden durch Exzision unter örtlicher Betäubung von einem avaskulären Bereich der anterioren Seite des Unterarms und gespeichert in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung bei +4 ° C vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Wash Biopsien mit neuen PBS mit 2% antibi ergänztotic Antimykotika-Lösung. </li><li> Platz Biopsien in einer 100 mm Petrischale und Schnitt in etwa 2 mm 3 Fragmente mit sterilem Skalpelle. </li><li> Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss unmittelbar vor der Fragmente Plattierung. </li><li> Platzieren 5-6 Hautfragmente in die vorbeschichteten 35 mm Petrischale. </li><li> Bereiten Fibroblastenkulturmedium: 77% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 20% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% L-Glutamin-Lösung und 2% Antibiotikum, Antimykotikum-Lösung. </li><li> Hinzufügen , um ein Tröpfchen von Fibroblastenmedium über jedem Fragment (üblicherweise 100 &amp; mgr; l pro Fragment) und Kultur sie bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Nach 24 Stunden wurden 500 &amp; mgr; l von Fibroblasten - Kulturmedium über die Fragmente fügen Sie sie in 5% CO 2 bei 37 ° C feucht zu halten. </li><li> Ändern Sie das Medium mit einer Pipette mindestens einmal alle 48 Stunden. </li><li> Nach 6 Tagen Inkubation vorsichtig entfernen Gewebefragmente und sie verwerfen. Hinweis: Nach 6 Tagen Fibroblastens beginnen aus den Gewebefragmenten zu wachsen und beginnen, eine Zellschicht zu bilden. </li><li> Aktualisieren Medium, 2 ml Fibroblasten - Kulturmedium und weiterhin Zellschicht Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. </li></ol> 2. Fibroblast Kultur <ol><li> Kultur Fibroblasten bei 37 ° C in 5% CO 2 , bis 80% Konfluenz </li><li> Für Passagierung absaugen Fibroblasten-Kulturmedium aus Gewebekulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit 4 ml PBS, ergänzt mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung. </li><li> Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren. </li><li> Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen Fibroblastenkulturmedium Trypsin Wirkung neutralisieren. Zentrifugation nicht notwendig ist. </li><li> Platten-Zellen in neue Kulturschalen (mitaus Gelatine) und die Kultur bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. Halten Sie das Durchtrittsverhältnis zwischen 1: 2 und 1: 4, je nach Wachstumsrate. </li><li> Wenn die Zellen erreichen rund 80% Konfluenz Passage sie (in der Regel zweimal pro Woche). </li></ol> 3. Fibroblast Plating für epigenetische Conversion <ol><li> In 0,26 ml / cm 2 von 0,1% Schweinegelatine (herzustellen , wie in 1.1 beschrieben) auf Zellkulturschalen. Warten Sie 2 Stunden zu beschichten. </li><li> Entfernen Sie die Beschichtungslösung Überschuss 10-30 min vor der Fibroblasten Plattierung. </li><li> Entfernen Fibroblasten-Kulturmedium aus den Kulturschalen. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, supplementiert mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung. </li><li> Hinzufügen, um eine dünne Schicht (10% des Kulturmediums Volumen) von Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g / L Schweine Trypsin und 0,2 g / L EDTA) und inkubiere bei 37 ° C bis zur Zellmonoschicht von der Unterseite des Gewebes zu lösen beginnt, Kulturschale und Zellen distanzieren. </li><li> Verdünnte Zellsuspension mit 9 Teilen fibroblast Kulturmedium Trypsin Aktion zu neutralisieren. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung einer Zählkammer unter einem Mikroskop bei Raumtemperatur. Berechnen des erforderlichen Volumens von Fibroblastenkulturmedium Zellen zu resuspendieren, eine Zellkonzentration von 7,8 x 10 4 Fibroblasten / cm 2 zu erhalten. Dies hängt von der speziellen Art der Kammer verwendet wird. Die Zellen / ul = Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro kleines Gitter x 90 (Multiplikationsfaktor) x Verdünnung </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 150 g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen mit dem vorher errechneten Volumen der Fibroblasten-Kulturmedium. </li><li> Platten Zellen auf 0,1% Gelatine vorbeschichtet Geschirr und Kultur sie für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li></ol> 4. Erhöhung der Zellplastizität Mit dem De-Methylierungsmittel 5-Aza-CR <ol><li> Tag 0 <ol><li> Bereiten Sie 5-Aza-CR-Stammlösung von 2,44 mg 5-Aza-CR Auflösen in 10 ml DMEM mit hohem Glucose mediÄh. Sterilisieren durch Filtration. Bereiten Sie 5-Aza-CR Lager unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Verdünne 1 ul von 5-Aza-CR-Stammlösung in 1 ml Fibroblasten-Kulturmedium (Endkonzentration 1 uM). </li><li> Um Zellplastizität erhöhen, 24 Stunden nach der Zellschichten (Hierher 3.8), zu entfernen Kulturmedium aus ausgesät Fibroblasten und fügen 1 &amp; mgr; M 5-Aza-CR - Stammlösung und Kultur für 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Bereiten frischen humanen pluripotenten (HP) Medium , wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Nach Inkubation mit 1 &amp; mgr; M 5-Aza-CR, entfernen Medium und wasche die Zellen dreimal mit PBS, um sicherzustellen, dass 5-aza-CR abgespült wird. </li><li> Inkubiere 5-Aza-CR behandelten Fibroblasten mit HP Medium für 3 Stunden (Erholungsphase) bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Nach der Erholungsphase, entfernen Medium, waschen dreimal mit PBS. </li><li> Um die Effizienz der 5-Aza-CR Behandlung zu überwachen, überprüfen Sie in diesem Schritt foder das Vorhandensein von morphologischen Veränderungen (detaillierter in Abschnitt Ergebnisse). Die Zellen verlieren die typische längliche Morphologie von Fibroblasten und eine runde oder ovale Form zu erwerben, in der Größe kleiner zu werden, mit vergrößerten Kernen. </li><li> Fahren Sie mit Pankreas-Differenzierung. </li></ol></li></ol> 5. Pancreatic Differenzierung Protokoll <ol><li> Tage 1-6 <ol><li> Bereiten Pancreatic Basal Medium , wie in Tabelle 2 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine Vorrats-Lösung Activin: Man löst 5 ug eines rekombinanten humanen Protein in 166,6 ul sterilem Wasser Activin. </li><li> Kultur 5-Aza-CR - Fibroblasten in 0,26 ml / cm 2 von Bauchspeicheldrüsen Basal Medium, ergänzt mit 1 &amp; mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) für 6 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator behandelt. Ändern Medium täglich. </li></ol></li><li> Tage 7-8 <ol><li> Bereiten Retinsäure Stammlösung durch Zugabe von 16,6 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 50 mg Retinoesäure acid. </li><li> Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1 &amp; mgr; l / ml Activin A - Stammlösung (siehe 5.1.2) und 1 ul / ml Retinsäure - Stammlösung (siehe 5.2.1) für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Ändern Medium täglich. </li></ol></li><li> Tage 9-36 <ol><li> Kulturzellen in 0,26 ml / cm 2 von Pancreatic Basal - Medium , ergänzt mit 1% (v / v) Insulin-Transferrin- Selen (ITS), 2% (v / v) B27 und 0,1% (v / v) Recombinant Human FGF Grund (bFGF) Stammlösung (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. Ändern Sie das Medium täglich für die ersten 15 Tage. </li><li> Vom 16. Tag an, aktualisieren Sie jeden zweiten Tag Medium, unter einem Mikroskop, da aggregierte Zellen bilden vom Boden der Kulturschale lösen kann. </li></ol></li></ol>

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<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
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<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
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<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Verfahren, das die Umwandlung von Fibroblasten der menschlichen Haut in Insulin-produzierende Zellen, durch eine transiente und kurze Exposition gegenüber 5-Aza-CR, gefolgt von einem gewebespezifischen Induktionsprotokoll ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht einen Wechsel von Mesoderm Endoderm verwandten Zellen, ohne die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren oder microRNAs noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, die 14 Zellen mehr instabil und...

Ein grundlegendes Ziel der regenerativen Medizin ist die Erzeugung von neuen, funktionsfähigen Zellen, die verwendet werden können, zu reparieren oder zu ersetzen beschädigte, entartete Gewebe. leicht verfügbar adulte Zellen in neue remaking, indem sie aus einem Zelltyp in einen anderen umzuwandeln, ist ein besonders attraktiver Ansatz, insbesondere, wenn die erforderliche Zellpopulation Zugang nicht reichlich oder schwierig ist. Allerdings sind adulte Zellen bemerkenswert stabil. Sie erhalten ihre differenzierten Zustand durch eine schrittweise Einschränkung ihrer Möglichkeiten und, sobald sie die reifen Terminal Spezialisierung erreichen, sie es stabil 1 behalten. In den letzten Jahren haben eine Reihe von Protokollen entwickelt worden, dass die Umprogrammierung zu Pluripotenz einer somatischen Zelle (iPS) ermöglichen erreicht durch die erzwungene Expression einer ganzen Reihe von Transkriptionsfaktoren 2,3. Alternativ kann die Zellumwandlung durch direkte Abstammungslinie transdifferentiation erhalten werden, eine einzige 4 Einführung </sup&gt; oder eine Kombination von Transkriptionsfaktoren 5-7. Diese Strategie geht es nicht um den Übergang durch eine de-differenzierten Zustand , sondern erfordert eine hohe Expression des spezifischen Transkriptionsfaktoren 8. Wir haben kürzlich eine Umwandlungsprotokoll, das auf der kurzen Belichtungs adulter Zellen zu den demethylating Eigenschaften des Cytidinanalogon 5-Azacytidin (5-Aza-CR), einem gut charakterisierten DNA-Methyltransferase-Inhibitor entwickelt. Die Demethylierung Schritt wird sofort durch eine spezifische Differenzierungsprotokoll 9-11 gefolgt, die die erforderliche terminalen Phänotyp zu erhalten ermöglicht. Dieses Verfahren ist in der Lage reife, differenzierte Zellen in Zellen einer anderen Abstammung zu konvertieren und hat den wesentlichen Vorteil, sowohl die Verwendung von viralen Vektoren und die Transfektion einer exogenen Transkriptionsfaktoren zu vermeiden. Der Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustand, und die damit verbundene erhöhte Anfälligkeit Instabilität der Zelle wird ebenfalls vermieden. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Das detaillierte Protokoll, das die Umwandlung von adulten menschlichen Hautfibroblasten in voll funktionsfähigem insulinsezernierenden Zellen ermöglicht wird hier vorgestellt. Allerdings ist es erwähnenswert, dass die Technik auf unterschiedlichen Zelltypen angewendet wurde und führte zu positiven Ergebnissen, wenn die Zellen gegenüber verschiedenen Differenzierungswege Adressierung. Darüber hinaus hat epigenetische Umwandlung erfolgreich in der Mensch und Schwein Spezies 9-13 sowie in dem Hund (Manuskript eingereicht) was auf eine breite Wirksamkeit und Robustheit des Ansatzes verwendet.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; für die Zellwäsche und Lösungsvorbereitung</td></tr><tr><td>Antibiotische Antimykotische Lösung</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>Bestandteil von Fibroblasten, HP und Pankreasmedien</td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>Für die Isolierung von Fibroblasten</td></tr><tr><td>Schweinegelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Für die Beschichtung von Schalen</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Für die Lösungsvorbereitung</td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Für die Isolierung von Fibroblasten</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Für Fibroblasten-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td>FBS; Bestandteil des Fibroblasten- und HP-Mediums</td></tr><tr><td>L-Glutamin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Bestandteil des Fibroblasten-, HP- und Pankreasmediums</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Für die Dissoziation von Fibroblasten</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 MIT GITTERN</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>5-Azacytidin</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-Aza-CR, für Inkrerase-Zellen Plastizität in Fibroblasten</td></tr><tr><td>Ham's F-10 Nutrient Mix</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>Für HP Medium</td></tr><tr><td>DMEM, Low Glucose, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>Für HP Medium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Life</td><td>Technologies</td><td>10828028</td><td>Bestandteil von HP Medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Life Technologies</td><td>11140035</td><td>Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedien</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedien</td></tr><tr><td>Guanosin</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium</td></tr><tr><td>Adenosin</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium</td></tr><tr><td>Cytidin</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>Nukleosid-Mix-Stoffbestandteil von HP-Medium</td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>Nukleosid-Mix-Stoffkomponente aus HP-Medium</td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>Nukleosid-Mix-Stoffkomponente aus HP-Medium</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &; Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Zur Sterilisation der Lösung</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinante Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF; Bestandteil von HP und Pankreas-Basalmedium</td></tr>: <tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA; Bestandteil des Pankreas-Basalmediums</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>für Pankreas-Basalmedium</td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>Bestandteil des Pankreasmediums</td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Bestandteil des Pankreas-Basalmediums</td></tr><tr><td>Activin A rekombinantes humanes Protein</td><td>Life Technologies</td> Technologies<td>PHG9014</td><td>Für Pankreasmedium</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Für Pankreasmedium</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO; Für Retinsäure Stoffaufbereitung</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS; Für Pankreas-Endmedium</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung&nbsp; 1 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>5-Methylcytidin</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>Zur immunzytochemischen Analyse. Arbeitsverdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Anti-C-Peptid-Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDX1 Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>Für die immunzytochemische Analyse. Arbeitsverdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insulin ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>Zum Nachweis der Insulinfreisetzung</td></tr></tbody></table>

epigenetische umwandlung als eine sichere und einfache methode, insulin absondernden zellen aus adulten fibroblasten der haut zu erhalten

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative Medizin benötigt neue, voll funktionsfähige Zellen, die den Patienten zur Verfügung gestellt werden, um degeneriertes oder beschädigtes Gewebe zu reparieren. Wenn solche Zellen nicht ohne weiteres verfügbar sind, können sie mit verschiedenen Ansätzen gewonnen werden, zu denen unter anderem Reprogrammierung und Transdifferenzierung gehören, mit Vorteilen und Einschränkungen, die für die verschiedenen Techniken spezifisch sind. Hier wird eine neue Strategie zur Umwandlung eines adulten reifen Fibroblasten in eine insulinsezernierende Zelle beschrieben, die willkürlich als epigenetische umgewandelte Zellen (EpiCC) bezeichnet wird. Die Methode wurde auf der Grundlage des zunehmenden Verständnisses der Mechanismen entwickelt, die die epigenetische Regulation des Zellschicksals und der Differenzierung steuern. Insbesondere wird im ersten Schritt ein epigenetischer Modifikator, nämlich 5-Aza-Cytidin, verwendet, um adulte Zellen in einen "hochgradig freizügigen" Zustand zu versetzen. Es nutzt dann dieses kurze und reversible Zeitfenster epigenetischer Plastizität, um Zellen wieder auf eine andere Linie auszurichten. Der Ansatz wird als "epigenetische Zellkonversion" bezeichnet. Es ist eine einfache und robuste Methode, um einen effizienten, kontrollierten und stabilen zellularen Inter-Lineage-Switch zu erhalten. Da das Protokoll keine Gentransfektion erfordert, frei von viralen Vektoren ist und keinen stabilen pluripotenten Zustand beinhaltet, ist es sehr vielversprechend für translationale medizinische Anwendungen.

Gründung der Primärkultur aus Hautbiopsien Hautbiopsien wurden in kleine Fragmente geschnitten und platziert in Gelatine vorbeschichtet Gerichte. Nach 6 Tagen begann Fibroblasten aus den Gewebefragmenten und bildeten eine Zellschicht (1A) zu wachsen. Zellen zeigten eine typische längliche Form und, wie erwartet, eine einheitliche immun Positivität für den Fibroblasten - spezifischen Marker Vimentin (Vim, 1B) angezeigt. <p class="jove_content" ...

Hier wird eine neue Methode vorgestellt, die die Umwandlung von adulten Hautfibroblasten in insulinsezernierende Zellen ermöglicht. Diese Technik basiert auf epigenetischer Konversion und beinhaltet weder die Verwendung retroviraler Vektoren noch den Erwerb eines stabilen pluripotenten Zustands. Es ist daher vielversprechend für Anwendungen in der translationalen Medizin.

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fibroblasten in insulinsekretierende Zellen umzuwandeln, ohne Pluripotenz zu induzieren oder retrovirale Vektoren zu verwenden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin und insbesondere in der Zelltherapie von Diabetes zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir einen Phänotypwechsel erzielen können, ohne einen stabilen pluripotenten Zustand in den umgewandelten Zellen hervorzurufen oder retrovirale Vektoren einzusetzen.Die Prozedur wird von Georgia Pennarossa, einer Postdoktorandin in unserem Labor, demonstriert. Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie 1,5 Milliliter sterilem 0,1 %igem Schweinegelatine in die 35-Millimeter-Petri-Schalen geben und zwei Stunden bei Raumtemperatur beschichten lassen. Waschen Sie danach die menschlichen Hautbiopsien mit PBS, der mit 2 % Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung ergänzt wurde.Anschließend die Biopsien in eine 100 Millimeter große Petrischale geben und mit sterilen Skalpellen in etwa zwei Kubikmillimeter große Fragmente schneiden. Danach fünf bis sechs Hautfragmente in die vorbeschichtete 35 Millimeter große Petrischale geben. Üb

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Direkte neuronale Umprogrammierung erzeugt Neuronen, die im Alter von der somatischen Startzelle beibehalten. Hier beschreiben wir eine einzelne Vektor-basierte Methode um induzierte Neuronen von dermalen Fibroblasten von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu generieren.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie die epigenetische Umwandlung von adulten Hautfibroblasten in insulinproduzierende Zellen für die Diabetes-Zelltherapie. Diese Methode verzichtet auf pluripotente Zwischenstufen und retrovirale Vektoren.

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten (Video) | JoVE Journal

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

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