Name: Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie ein standardisiertes Verfahren zur Induktion intestinaler Ischämie-Reperfusionsschäden bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zu Verletzungsmechanismen und Geweberegeneration im Gastrointestinaltrakt.

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Diese Arbeit wurde von russischen Science Foundation unterstützt wurde, gewähren keine. 14-50-00060 und LLC RUSCHEMBIO. Diese Arbeit wurde von der Morbus und Colitis Grundlage von Amerika gewähren 294.083 (AVT), und von NIH Zuschusses RO1 DK47700 (CJ) unterstützt.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee des Trudeau Institute genehmigt. 8-12 Wochen alte C57BL / 6-Mäuse wurden für die Studie verwendet. 1. Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Bereiten Sie und chirurgische Instrumente zu sterilisieren. </li><li> Bereiten Sie Isofluran-basierte Anästhesiesystem mit Nasenkegel und Heizkissen. Stellen Sie sicher, Heizkissen ist nicht überhitzt (&lt;39 ° C). </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Isofluran Gasspül- Kanister richtig positioniert ist, um die Auslassöffnungen an der Unterseite des Behälters, um sicherzustellen, sind nicht in irgendeiner Weise blockiert oder verstopft. Wiegen Gasspül Kanister vor dem Verfahren und Dokumentengewicht auf Kanister. Entsorgen Kanister, wenn Kanister Gewicht 50 g akkumulierte Gewicht übersteigt (~ 12 h). </li></ol> 2. Anesthesia <ol><li> Anästhesieren Maus mit 3% Isofluran in einer Induktionskammer (1 L / minO 2). <ol><li> Beurteilen Sie Narkosetiefe durch die Unfähigkeit, aufrecht zu bleiben, Verlust der gezielte freiwillige Bewegung, Verlust des Lidschlussreflexes, Muskelentspannung, und der Verlust der Reaktion Stimulation (toe oder Schwanz Prise mit festem Druck) zu Reflex. </li><li> Beurteilen Sie die Atemfrequenz und Muster von Brustwand und Bauchbewegungen zu beobachten. Unter optimalen Anästhesie sollte die Atemfrequenz ~ 55-65 Atemzüge pro Minute sein. </li><li> Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und rasieren schnell den Bauchbereich der Maus. </li></ol></li><li> Hornhautaustrocknungs, legen fad Augensalbe in die Augen zu verhindern. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen und verbinden Sie es über Bugspitze an Anästhesiesystem. Achten Sie darauf, Latex Bugnase Membran passt fest über den Kopf der Maus, und es gibt kein Leck von Isofluran. </li><li> Reduzieren Sie Isofluran Rate auf 1,5%, und injizieren Buprenorphin (0,1 mg / kg) und Ketamin (10 mg / kg) subkutan Wind-up der Schmerz-Kaskade zu verhindern. </li><li> Wischen Sie the Haut des Operationsgebietes mit einem sterilen mit Betadine von 70% Ethanol gefolgt chirurgische Lösung getränkten Wattestäbchen. </li></ol> 3. Chirurgie <ol><li> Machen Sie eine Mittellinie 3-5 cm Laparotomie mit Betriebs Schere. Abdeckung Betriebsbereich mit sterilem nicht-haftenden Unterlage mit Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Isolieren Blinddarm und Ileum und setzen die A. mesenterica superior mit Wattestäbchen in Kochsalzlösung angefeuchtet ist. </li><li> Zur Erleichterung der Clip anwenden, machen kleine Scharten im Gekröse rund um die A. mesenterica superior mit feinen Iris scissors.To dies zu tun, vorsichtig den Darm mit Dressing Zange heben und Gekröse auf beiden Seiten der A. mesenterica superior an der gewünschten Clip Position geschnitten (Abbildung 1A). Dann fügen einige Tropfen steriler Kochsalzlösung auf den Bereich der gewünschten Clip Position vor Clips anwenden. Hinweis: Um die Scheinoperation durchzuführen, folgen Sie dem chirurgischen Eingriff bis 3.2 zu treten. Wenden Sie keine Clips. Stattdessen halten das Gewebe feucht durch hinzugefügt warme saline wie in 3.6 für 1 Stunde beschrieben. Danach gehen 4.1 zu Schritt, </li><li> Verschließen Sie die ersten Ordnung Zweige der A. mesenterica superior mit mikrovaskulären Clips (70 g Kraft) zur Anbringung von Klammern mit einem 5-7 cm Bereich des ischämischen Ileum zu schaffen neben Blinddarms (1B). Obwohl die Position der Schiffe konservativ ist, könnte es zwischen Mäusen (siehe Beispiele auf Abbildung 1) leichte Variationen. Deshalb, 2 oder 3 Clips sind in der Regel erforderlich (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, schwarze Pfeile). Hinweis: Verwenden Sie qualitativ hochwertige Behälter Clips. Hochdruck-Clips können Gefäße schädigen und zu verhindern, Regeneration während Niederdruck-Clips (&lt;30 g) nicht vollständig Blutfluss blockieren. </li><li> Blockieren Sicherheiten Blutfluss durch den Darm mit Hilfe von zwei mikrovaskulären Clips über Gefäße (40 g Kraft), Demarkieren den Bereich des ischämischen Darms (Abbildung 1). Occlusion von Kollateralen ist erforderlich, umBlutversorgung von benachbarten Blutgefäßen verhindern (siehe die Position der Clips auf 1A, D, E, grüne Pfeile). </li><li> Optional: Fügen Sie Heparin-Lösung (6 USP-Einheiten / ml), die Blutgerinnung zu verhindern. Tropfenweise 0,5 ml Heparin-Lösung auf den isolierten Darm hinzuzufügen. </li><li> Nasse sterile nicht-haft Pad zarte Tücher mit Kochsalzlösung vorgewärmt auf 37 ° C und OP-Bereich gelten. Stellen Sie sicher, dass bleibt Tücher während des gesamten Verfahrens nass. </li><li> Pflegen Ischämie für 60 min unter Verwendung von 1-1,5% Isofluran-Narkose im gesamten Gebäude. Wenn Ischämie Verfahren korrekt durchgeführt wird, wird der ischämischen Region Wein in der Farbe rot in etwa 30 Minuten ändern. Beachten Sie, dass die Blutgefäße distal der Clipposition während der Ischämie (Abbildung 1, rechts Platten) , die erfolgreiche Okklusion vergrößert. </li><li> genau überwachen die Maus während der Ischämie-Phase. Weiterhin Kochsalzlösung in die nicht-adhärenten pad anzuwenden Abdecken der Operationsstelle. </li><li> Kennzeichendie Ränder des ischämischen Bereich von 20 &amp; mgr; l auf dem Gewebe Gill`s 3 Hämatoxylin Pipettieren zum Vergleich (1E, rechte Tafel) Ernten der ischämischen Gewebe und benachbarte gesunde Gewebe aus der gleichen Maus zu erleichtern. </li></ol> 4. Reperfusion Bühne <ol><li> Am Ende der Ischämie fügen einige Tropfen Kochsalzlösung auf der Clip und sanft mikrovaskulären Clips mit Clip-Anbringvorrichtung entfernen. Dann drücken Sie vorsichtig den Darm wieder in die Bauchhöhle Salzlösung angefeuchtete Wattestäbchen verwenden. Nicht ausreichend tragfähige Unterlage und schließen Sie die Bauchdecke und die Haut mit 9 mm Edelstahl Wundklammern. Wenn Reperfusion durchgeführt wird, die länger als 3 Stunden, eine resorbierbare Vicryl Naht verwenden, um die Bauchdecke zu schließen, bevor Wundklammern auf die Haut aufgebracht wird. </li><li> Pflegen Mäuse in einem geheizten sauberen Käfig für die gewünschte Zeitdauer (30 min, 60 min, 120 min bzw. 180 min) für die Reperfusionsphase. </li><li> Überprüfen Tiere mindestens alle 30 min Stabilität zu gewährleisten. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Necropsy und Ernten des Dünndarms <ol><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Überdosis gefolgt durch zervikale Dislokation zu der gewünschten Zeit nach Reperfusion. </li><li> Öffnen Sie Bauchhöhle und sammeln das ischämische Darmgewebe zur weiteren Analyse. Ernte gesund normales Gewebe neben dem verletzten Gewebe als interne Kontrolle zu Konto für jede systemische Reaktion auf eine Verletzung. Hinweis: Diese Kontrolle ist besser geeignet als die Scheinkontrollmäuse betrieben, weil scheinoperierten Mäusen keine systemische Reaktion auf IR-induzierte Schädigung erleiden. </li><li> Waschen Sie den Darminhalt 30 ml Spritze mit aufgesetzter Sondennadel mit Kochsalzlösung gefüllt und anschließend schneiden Sie den Darm in Längsrichtung. Wenn eine Probe des Darmes für die Genexpressionsanalyse erforderlich ist, schneiden Sie ein 1,5 mm-Fragment in Längsrichtung, und verwenden Sie das restliche Stück für die histologische Analyse. </li><li> Für die histologische Analyse, bereiten eine Schweizer Rolle ein Paar Zangen mit dem intest rollenine. </li><li> Zur Aufrechterhaltung der gerollter Form, legen Sie die Stücke des Darms zwischen Biopsie Schaumstoffpolster in Gewebekassetten (Abbildung 2). Legen Sie die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin. </li><li> Fix Gewebe in Formalin für mindestens 24 Stunden. Ersetzen Formalin mit 70% Ethanol für weitere 24 hr. Store Gewebe in 70% igem Ethanol bei Raumtemperatur unbegrenzt. </li><li> Einbetten von in Paraffin, schneiden 5 um - Schnitte und flecken mit Hämatoxylin und Eosin ein Standardprotokoll (Abbildung 3) verwendet wird . </li></ol> 6. Scoring <ol><li> Ergebnis der Maus - Ischämie-Reperfusionsschaden wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Wählen Sie eine geeignete Scoring - Methode. </li><li> Optional: Teilen Sie das Sichtfeld in vier Abschnitte, da die Schwere der Verletzung im gesamten Abschnitt variiert. </li><li> Berechnen Sie den durchschnittlichen Grad von jedem Abschnitt von Partituren blind erhalten. </li><li> Vergleichen Sie die Klasse des verletzten Gewebes zwischen den Fällen und Kontrolle sowie zu the heil Gewebe einen Kruskal-Wallis-Test verwenden, gefolgt von einem mehrVergleichsTest Dunn. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht

Die Entwicklung von Mausmodellen der intestinalen Verletzungen IR haben stark verbessert das Verständnis der Mechanismen der Gewebeverletzung und bei der Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien Aided zu Gewebeschäden 7,9,11,34 minimieren. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die richtige Positionierung der mikrovaskulären Clips, richtige Timing der Ischämie und korrekte histologische Untersuchung des IR-Verletzung. Die Dauer der Ischämie ist kritisch für ...

Der Darm ist sehr empfindlich auf Unterbrechung des Blutflusses, die Ischämie und epithelialen Schaden verursacht. Reperfusion nach Ischämie stellt Wiedersauerstoffversorgung des Gewebes und kann weiter Pathologie fördern. Daher wird intestinale Ischämie und Reperfusionsverletzung mit einer breiten Palette von Erkrankungen verbunden sind , einschließlich nekrotisierender Enterokolitis, Allograft Abstoßung in Dünndarmtransplantation, Komplikationen der Bauchaortenaneurysma Chirurgie, kardiopulmonalen Bypass und entzündlicher Darmerkrankung 1,2. Intestinale IR Verletzungen, vor allem akute Mesenterialischämie, ist ein lebensbedrohlicher Zustand , was zu Morbidität und Mortalität 3. Obwohl wenig verstanden wird intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung dachte mit Veränderungen in der Darmflora verbunden zu sein , sowie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und inflammatorische Zytokine und Chemokine 1,4-6. Dies führt zur Aktivierung von sowohl innate und adaptive Immunmechanismen , die eine Entzündung und Gewebeschädigung 1,7,8 fördern. Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Mechanismen der IR Verletzungs verstehen, da sie leicht Verstärkungs- und loss-of-function genetische Experimente ermöglichen. Mehrere Tiermodelle von IR wurden die komplette Gefäßverschluss, Low - Flow - Ischämie entwickelt und segmentierten Gefäßverschluss (kürzlich in einem umfassenden Überblick zusammengefasst 9). Intestinale Ischämie verursacht durch vollständige Gefäßverschluss der Arteria mesenterica superior (SMA) ist eine einfache und häufig verwendete Modell von IR bei großen Tieren und Nagetiere 11.09. Jedoch verschiedene Bereiche des Darmes haben unterschiedliche Verletzungsanfälligkeit. Darüber hinaus Verwechselung die breite Palette von Anästhetika, Analgetika, Arterienverschluss Techniken sowie Inkonsistenz in der Dauer von ischämischen Verletzungen und Erholung führen zu variablen Grad der Verletzung unser Verständnis der Biologie des IR über mehrere studies. Tabelle 1 zeigt diese Inkonsistenzen in murine IR - Studien. Der größte Nachteil von mit kürzeren Ischämiezeiten (30-45 min) zielt auf das Fenster der Erholung, auf die erkennbaren Unterschiede zwischen Fällen und Kontrollen beobachtet werden können. Mild Schädigung des Epithels kann eine Stunde nach der Reperfusion gelöst werden, deshalb spezialisierte pathologische Metriken erforderlich sein können Unterschiede in der epithelialen Restitution zu finden. Im Gegensatz dazu, wie übermäßigen Schaden durch 100 min von ischämischer Verletzung gesehen kann in der vollständigen denudement des Epithels führen, wenn eine Rückerstattung nicht mehr möglich ist, die Rate der Sterblichkeit erhöhen und Recovery-Zeit. Deshalb beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen IR bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik in unserem Bereich zu fördern. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Heizkissen</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>Alternative: Braintree Scientific Heizkissen</td></tr><tr><td>Tischgerät für die Forschungsanästhesie</td><td>Vasco</td><td>UCAP 0001-0000171</td><td>Alternative: Parkland Scientific, V3000PS</td></tr><tr><td>Nose Cone</td><td>Parkland Scientific</td><td>ARES500</td><td></td></tr><tr><td>Scavenger-Kanister und Ersatzpatrone</td><td>Parkland Scientific</td><td>80000, 80120</td><td></td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td>Surgivet</td><td>V711802</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td>Kontrollierte Substanz, kontaktieren Sie IACUC</td></tr><tr><td>Tierschermaschine&nbsp;</td><td>Oster&nbsp;</td><td>Oster Golden A5 078005-050-003</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Webster</td><td>8804604</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>McKesson</td><td>562766</td><td>Kontrollierte Substanz, Kontakt IACUC</td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamin HCl)</td><td>Pfizer</td><td>NADA 45-290</td><td>Geregelte Substanz, Kontakt IACUC</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Puritanische Medizinprodukte</td><td>806-WC</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td>10% Povidon-Jod</td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung</td><td>Aspen</td><td>46066-807-60</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur einstellen</td></tr><tr><td>IR-Nagetierthermometer</td><td>BIOSEB</td><td>BIO-IRB153</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovaskuläre Clips, 70 g</td><td>Roboz Chirurgisch&nbsp;</td><td>RS5424, RS5435</td><td>Alternativ: WPI 14121, für SMA-Okklusion</td></tr><tr><td>Mikrogefäßclips, 40 g</td><td>Roboz Chirurgisch</td><td>RS6472</td><td>Alternative: WPI 14120, für den Verschluss von Kollateralgefäßen</td></tr><tr><td>Clip-Anlegezange</td><td>World Precision Instruments</td><td>14189</td><td>Alternative: Roboz #RS-5410 oder&nbsp; #RS-5440</td></tr><tr><td>Gill's 3 Hämatoxylin</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-390-17</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klammern, Reflex 9 mm</td><td>Cell Point Scientific</td><td>201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip-Applier</td><td>Beckton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Byopsy Foam</td><td>Pad Simport</td><td>M476-1</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekassette</td><td>Fisher Healthcare</td><td>15182701A</td><td>Histosette II Kombination Deckel und Boden</td></tr><tr><td>10% gepuffertes Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Irisschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263-G SC</td><td>Alternative: Roboz RS6816</td></tr><tr><td>Schere zur Bedienung</td><td>World Precision Instruments</td><td>501219-G</td><td>Alternative: Roboz RS6814</td></tr><tr><td>Abrichtzange</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5228, RS-8122</td><td>Alternative: World Precision Instruments 1519-G</td></tr><tr><td>Heparin, endotoxinfrei, 300 USP-Einheiten/Fläschchen, 50 mg</td><td>Sigma</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Pinzette zum Entfernen von Wundclips</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-9263</td><td>Alternative: World Precision Instruments: 500347</td></tr><tr><td>Mäuse C57BL/6J Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Best.-Nr. 0664</td><td></td></tr><tr><td>Telfa nicht adhärente Verbände, 3 x 4, steril</td><td>Coviden</td><td>1050</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transferpipetten</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td>Verwenden Sie Pipetten, um Kochsalzlösung tropfenweise hinzuzufügen</td></tr></tbody></table>

murine modell der intestinalen ischämie-reperfusionsschaden

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinale Ischämie ist ein lebensbedrohlicher Zustand in Verbindung mit einem breiten Spektrum von klinischen Zuständen, einschließlich Atherosklerose, Thrombose, Blutdruckabfall, nekrotisierende Enterokolitis, Darmtransplantation, Trauma und chronische Entzündungen. Intestinale Ischämie-Reperfusions (IR) Schädigung ist eine Folge der akuten mesenterialen Ischämie, hervorgerufen durch unzureichende Durchblutung der mesenterialen Gefäße, was zu Darmschäden. Reperfusion nach Ischämie können weitere Schäden des Darms verstärken. Die Mechanismen der IR-Verletzungen sind komplex und kaum verstanden. Daher sind kleine Versuchstiermodellen kritisch für das Verständnis der Pathophysiologie der IR Verletzung und die Entwicklung neuer Therapien. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der akuten Darm IR Verletzung, die ohne Mortalität reproduzierbaren Verletzung des Dünndarms zur Verfügung stellt. Dies wird durch Induzieren von Ischämie in dem Bereich des distalen Ileums durch zeitliches Occludin erreichtg die peripheren und Terminalnebenzweige der A. mesenterica superior für 60 min mikrovaskulären Clips. Reperfusion für 1 Stunde oder 2 Stunden nach einer Verletzung führt zu reproduzierbaren Schädigung des Darms durch die histologische Analyse untersucht. Die richtige Position der mikrovaskulären Clips ist für das Verfahren kritisch. Daher bietet der Videoclip eine detaillierte visuelle Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieser Technik. Dieses Modell der intestinalen IR Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Wir optimieren das Versuchsprotokoll von IR-Operation reproduzierbare IR induzierte Schädigung des Ileum bei Mäusen zu erhalten. Repräsentative Ergebnisse sind in diesem Abschnitt dargestellt. Abbildung 1 zeigt Beispiele von mikrovaskulären Clips Position Ischämie des Ileum zu induzieren. Schwarze Pfeile zeigen Position der Haupt Clips erster Ordnung Zweige der A. mesenterica superior Okkludieren. Grüne Pfeile...

Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reproduzierbare ischämisch-reperfusionsschädigungsbedingte Verletzungen im distalen Dünndarmbereich der Maus durch vorübergehende Okklusion der peripheren und terminalen kollateralen Äste der Arteria mesenterica superior durchzuführen. Diese Methode kann helfen, grundlegende Verfahren auf dem Gebiet der Gastroenterologie und Immunologie zu verstehen, beispielsweise die Mechanismen von Verletzungen und Regeneration der Kniescheibe. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie von jeder ausgebildeten Person im Labor durchgeführt werden kann.Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass das Verfahren selbst keine Mortalität bei Mäusen verursacht. Bereiten Sie den Operationsbereich gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Verwenden Sie anschließend chirurgische Scheren, um eine drei bis fünf Zentimeter lange mediane Laparotomie durchzuführen.Dann bedecken Sie den Operationsbereich mit einem sterilen, nicht haftenden Tupfer, der mit Kochsalzlösung angefeuchtet wurde. Isolieren Sie das Zäkum und das Ileum, und verwenden Sie mit Kochsalzlösung angefeuchtete Wattestäbchen, um die Arteria mesenterica superior freizulegen. Anschließend heben Sie mit Haltepinzetten vorsichtig den Darm an, um die Anbringung der Klammer zu erleichtern, und verwenden Sie eine Iris-Schere, um das Mesenterium beidseits der Arteria mesenterica superior an der gewünschten Stelle für die Klammerung zu durchtrennen.Halten Sie den Darm in der angehobenen Position und drücken Sie vorsichtig mit der anderen Hand einen Clip-Applikator, um die Backen eines hochwertigen 70-G-Force-Mikrovaskular-Clips zu öffnen. Positionieren Sie dann den Clip auf dem Gefäß und lassen Sie die Backen vorsichtig los, um das Gefäß zu verschließen. Bringen Sie auf dieselbe Weise einen bis zwei weitere Mikrovaskular-Clips an, bis durch die Okklusion der Äste erster Ordnung der Arteria mesenterica superior ein fünf bis sieben Zentimeter langer Bereich des ischämischen Ileums benachbart zum Caecum entsteht.Platzieren Sie nun zwei 40-G-Force-Mikrovaskularklammern über den Darm, um den kollateralen Blutfluss zu blockieren und den ischämischen Darmabschnitt abzugrenzen. Sobald alle Klammern angebracht sind, wenden Sie einen sterilen, empfindlichen Tupfer, der mit 37 °C warmer Kochsalzlösung angefeuchtet wurde, auf den Operationsbereich an und halten Sie die Ischämie 60 Minuten lang unter ständiger Überwachung aufrecht. Wenn das Ischämieverfahren korrekt durchgeführt wurde, verfärbt sich der Bereich innerhalb von etwa 30 Minuten weinrot, und die Blutgefäße distal zur Klammerposition weiten sich, was auf eine erfolgreiche Okklusion hinweist.Markieren Sie am Ende der Ischämie die Ränder des ischämischen Bereichs mit zehn Mikroliter Gill-Hämalaun, um die Entnahme des ischämischen Gewebes und des angrenzenden gesunden Gewebes zu erleichtern. Geben Sie am Ende der Ischämie einige Tropfen Kochsalzlösung auf den Klemmbereich und entfernen Sie die mikrovaskulären Klammern vorsichtig mit einem Klemmapplikator. Schieben Sie anschließend den Darm mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig zurück in die Bauchhöhle.Entfernen Sie den nicht haftenden Tupfer und schließen Sie die Bauchdecke und Haut mit neun Millimeter langen Wundklammern aus rostfreiem Stahl. Halten Sie die Tiere für den gewünschten Reperfusionszeitraum in einem beheizten, sauberen Käfig und überprüfen Sie die Mäuse alle 30 Minuten, um ihre Stabilität zu bestätigen. Am Ende der Reperfusion wird das Tier getötet, die Bauchhöhle geöffnet und das ischämische Gewebe sowie angrenzendes gesundes Normalgewebe entnommen.Verwenden Sie anschließend eine 30-Milliliter-Spritze, die mit einer mit Kochsalzlösung gefüllten Schlundsonde ausgestattet ist, um den Darminhalt auszuwaschen, und schneiden Sie anschließend den Darm längs auf. Falls eine Darmprobe für die Genexpressionsanalyse benötigt wird, bewahren Sie ein längsgerichtetes Fragment von 1,5 bis 2 Millimeter auf. Für die histologische Analyse verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm zu einer Schweizerrolle aufzurollen, und legen Sie die Darmstücke zwischen Biopsieschaumstoffpolster in die Kassette.Legen Sie die Kassetten schließlich zur Fixierung des ischämischen und gesunden Darmgewebes in zehnprozentige gepufferte Formalinlösung. Hier ist eine repräsentative Gewebekassette dargestellt, die aus Schweizer Rollen aus Kontroll- und ischämischen Bereichen des Ileums nach einer Stunde Ischämie und einer Stunde Reperfusion hergestellt wurde. Achten Sie auf den Farbunterschied zwischen dem Kontroll- und dem ischämischen Gewebe.Ein Stück Milz wurde ebenfalls hinzugefügt, um die Positionierung des Kontroll- und Ischämie-Reperfusion-Darmes während der Verarbeitung und Färbung zu erleichtern. In diesen Bildern sind repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen von Kontroll- und ischämischen Bereichen des Ileums nach einer Stunde Ischämie bzw. nach einer Stunde Ischämie gefolgt von zwei Stunden Reperfusion dargestellt. Beachten Sie den schweren epithelialen Schaden, der nach einer Stunde Ischämie beobachtet wurde und sich durch hämorrhagische VILI, Entblößung des Epithels mit partieller bis kompletter Ablation der Zotten sowie Infiltration durch Immunzellen auszeichnet.Nach einer zweistündigen Reperfusion bestehen die VILI-Schädigung und Entzündung weiterhin, es tritt jedoch keine Gewebeblutung auf. Die Analyse der entzündlichen Sinica-Expression eine und zwei Stunden nach Ischämie-Reperfusion in ischämischen und Kontroll-Darmabschnitten zeigt eine Hochregulation von TNF-alpha, IL-1-beta, IL-6-Sideacin sowie eine Zunahme der Cxcl-2-Chemokin-mRNA-Expression unter beiden Ischämie-Reperfusion-Bedingungen im Vergleich zum gesunden Kontrollgewebe. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in drei Stunden und dreißig Minuten ordnungsgemäß durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine reproduzierbare intestinale Ischämie-Reperfusionsschädigung durchführt.

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Medizin

Chirurgisches Trauma eine entzündliche Reaktion induziert. Zytokine und endogene Liganden bekannt zu modulieren Myokardinfarkt Größe nach Ischämie und Reperfusion. Wir präsentieren eine modifizierte geschlossener Brust Modell der murinen Ischämie und Reperfusion mit hängenden Gewichte zu Auswirkungen der Thorakotomie zu minimieren.

Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Dieses Protokoll ermöglicht Lesern erfolgreich etablieren ein porcinen Modell der segmentale intestinale Ischämie und anschließend isolieren und Kultur intestinale Stammzellen für das Studium der epithelialen Reparatur nach Verletzung.

Intestinale Stammzellen isoliert und Kultur in einem porcinen Modell der segmentalen kleinen intestinalen Ischämie

Ein Maus-Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion wird gegründet, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu untersuchen. Wir nach distal verbinden rechts mittlere zerebrale Arterie und rechts gemeinsame Halsschlagader und Blutfluss nach 10 oder 40 min der Ischämie wiederherstellen.

Zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-reperfusion

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Wir beschreiben detailliert ein klinisch relevantes Tumormodell der Darmkrebslebermetastasen (CRLM) und den Einfluss der Leberischämie-Reperfusion (I/R) auf Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell kann helfen, die Mechanismen, die der chirurgieinduzierten Förderung des metastasierenden Wachstums der Leber zugrunde liegen, besser zu verstehen.

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Nierenischämie-Reperfusionsverletzungen sind mit hoher Morbidität und Mortalität bei hospitalisierten Patienten verbunden. Hier stellen wir ein einfaches und effektives Mausmodell der einseitigen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung vor und geben einen sequentiellen Überblick über repräsentative pathologische Veränderungen, die in der Niere beobachtet wurden.

Ein effektives Mausmodell der einseitigen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, die bei Mäusen durch Präzisionsligation der linken vorderen absteigenden Koronararterie durch Mikromanipulation einen Myokardinfarkt oder eine myokardiale Ischämie-Reperfusionsverletzung induzieren kann.

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen

Wir beschreiben, wie ein weit verbreitetes chirurgisches Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) bei Nagetieren erstellt werden kann. Das Verfahren beinhaltet einen Verschluss der Arteria mesenterica superior, gefolgt von der Wiederherstellung des Blutflusses. Dieses Modell ist nützlich für Studien, die okklusive Ursachen der intestinalen IRI sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin untersuchen.

Nagetiermodell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung durch Verschluss der Arteria mesenterica superior

Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.

Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Lernen Sie ein standardisiertes Verfahren zur Induktion intestinaler Ischämie-Reperfusionsschäden bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zu Verletzungsmechanismen und Geweberegeneration im Gastrointestinaltrakt.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

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