Name: Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Immunfärbungsprotokoll für Erbsenblattlaus-Embryos, das die Gewebepermeabilität erhöht und die Hintergrundfärbung reduziert. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinexpressionsanalysen in embryonalen Geweben.

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Wir danken Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) für die Bereitstellung des monoklonalen 4D9-Antikörpers, Technology Commons (TechComm) vom College of Life Science NTU für die konfokale Mikroskopie, Hsiao-Ling Lu für das Korrekturlesen des Manuskripts und Chen-yo Chung für die Unterstützung bei den Dreharbeiten. CC dankt insbesondere Charles E. Cook für die strategischen Vorschläge und die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (101-2313-B-002-059-MY3 und 104-2313-B-002-022-MY3 für GWL und CC) und der National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 für CC; 103R4000 für GWL) unterstützt.

1. Kultur der Blattläuse . HINWEIS: Der Laborstamm des parthenogenetic viviparous Erbsenblattlaus A pisum wurde ursprünglich in der Zentral-Taiwan gesammelt und hat sich auf Wirtspflanzen (der Gartenerbse Pisum sativum oder Saubohne Vicia faba) unter Langtagsphotoperiode für mehr als 300 Generationen erzogen worden (einer Generation: ~ 10 Tage). <ol><li> Keimung von Samen <ol><li> Weichen Sie die Samen der Wirtspflanzen in Leitungswasser für 3-5 Tage bei RT. Nachfüllen mit frischem Wasser einmal pro Tag. HINWEIS: Alternativ setzen Samen der Wirtspflanzen direkt in feuchten Boden kann die Keimung sowie zu induzieren. </li><li> Wachsen 10 keimenden Samen in einem kleinen Topf (Durchmesser von 9 cm x 7 cm hoch) mit Erde in der Wachstumskammer unter Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C. </li><li> Über 10 Tage nach Wachstum beginnt, übertragen Blattläuse auf Pflanzen, deren Höhe mehr als 8 cm. </li></ol></li><li> Übertragung der Blattläuse <ol&gt; <li> Halten Sie jeden Topf von Pflanzen in einem 1 L Becherglas, übertragen 8 erwachsene Blattläuse auf Pflanzen mit einem Pinsel, und dann verschließen Sie den Becher mit einem luftdurchlässigen Abdeckung wie Gaze Mesh Blattläuse der Flucht zu hindern. </li><li> Blattläuse in einer Wachstumskammer inkubieren Photoperiode 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 20 ° C. Wasser jeden Blumentopf von Pflanzen jeden Tag neu. </li><li> Zum Erhalt der nächsten Generation von Blattläusen, wiederhole Schritte 1.1.3-1.2.2 zehn Tage nach der primären Blattlaus Übertragung. </li></ol></li></ol> 2. Dissection und Fixierung der Eierstöcke <ol><li> Frisch in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Fixierungspuffer Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA). </li><li> Füllen Sie eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit PFA (etwa 500 ul), legen Sie die Platte unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung, und tauchen Sie ein Erwachsener Blattlaus in der PFA für die Präparation. </li><li> Sezieren Eierstöcken, indem Sie den Kopf und Bauch mit einem Satz von Zangen, Aufschneiden der RückenKutikula des Bauches, und Ziehen der Eierstöcke von der Bauchhöhle. </li><li> Fix drei Paare von Eierstöcken in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 1 ml PFA bei RT für 20 min. </li><li> Dekantieren Fixierungspuffer mit einer Transferpipette (Glas- oder Einweg) und waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% Triton X-100 in 1 × PBS (PBST) 3-mal für jeweils 10 min dann. Mild Schütteln auf einem Mischer / Rotator (Drehwinkel: 60 ° (F60) / Drehzahl: 8 RPM) ist sowohl für die Fixierung und spülmaschinengeeignet. </li></ol> 3. Die Behandlung mit Proteinase K (PK), die Permeabilität Embryonalgewebe Erhöhen HINWEIS: PK Behandlung Embryonen aus Keimband Erweiterung Weiter (Stufe 11 der Entwicklung) angewandt. Für die jüngeren Embryonen, ist dieser Schritt optional. <ol><li> Seriell verdünnter die Stammlösung von PK (10 mg / ml) mit 1x PBS auf die Arbeitskonzentration 1 ug / ml. </li><li> Eierstöcke mit 1 ug / ml PK (etwa 500 ul) Inkubieren für 10 min mit leichtem Schütteln. </li><li> Dekantieren PK solutiauf und dann waschen die Eierstöcke mit 700 &amp; mgr; l von Glycine (2 mg / ml) 3 Mal für jeweils 5 Minuten. </li><li> Zweimal waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST 10 min je. </li><li> Fix Eierstöcke wieder mit Fixations Puffer für 15 min bei RT mit mildem Schütteln. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Eierstöcke mit 0,2% PBST zweimal je 10 min. </li></ol> 4. Methanol Inkubation zur Unterdrückung der endogenen Peroxidase (POD) Aktivität HINWEIS: Methanol Inkubation ist nicht auf Embryonen Phalloidin-Färbung oder Antikörper-Epitope, die Methanol empfindlich sind zogen angewendet. <ol><li> Seriell dehydratisieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Dehydratisieren Ovarien mit 100% Methanol für 1 h bei RT mit mildem Schütteln. HINWEIS: Zufriedenstellende Ergebnisse der Färbung konnte immer noch von Blattlaus Gewebe, die in 100% Methanol bei gespeichert wurden erhalten -20 &amp;# 176; C für einen Monat. </li><li> Seriell rehydrieren Ovarien mit unterschiedlichen Prozentsatz von Methanol in 0,2% PBST (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) durch Inkubation Ovarien bei jeder Konzentration von Methanol-Lösung für 10 min unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Antikörper-Färbung <ol><li> Verdünnen Sie den 10x Blockierungslösung aus dem DIG-basierten Puffersatz (DIG-B) auf 1x. HINWEIS: Die 1x DIG-B Blockierungslösung ist effektiver zur Verringerung des Hintergrundfärbung als die Standard-Blockierungsmittel aus 5% (v / v) normales Ziegenserum (NGS) und 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA ) in 0,2% PBST. </li><li> Inkubieren der Eierstöcke mit dem 1x DIG-B Blockierungslösung für 2,5 bis 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln. HINWEIS: drei Paare von Eierstöcke in einem 1,5-ml-Röhrchen, beträgt 200 &amp; mgr; l und dem minimalen Volumen für Proben Sperrung und Antikörperfärbung. </li><li> Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die primären Antikörper in geeigneten dilutiauf Verhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln. HINWEIS: Bei dem hier beschriebenen Experiment, verwenden Sie die folgenden optimalen Verdünnungen des primären Antikörper: (1) ApVas1 Antikörper: 1: 500 für chromogene Färbung 1.50 für Immunfluoreszenzfärbung; (2) Anti-α Tubulin-Antikörper: 1: 500; (3) 4D9 monoklonale Antikörper: 1:25. </li><li> Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4-mal für 15 Minuten jeweils. </li><li> Inkubieren Ovarien 1x DIG-B Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT mit mildem Schütteln. </li><li> Überstand dekantieren und ersetzen mit frischem 1x DIG-B Sperrlösung, die Sekundär-Antikörper in geeigneten Verdünnungsverhältnis. Färben die Eierstöcke 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Verdünnungsverhältnisse von Sekundärantikörper: (1) Für die Immunfluoreszenzfärbung: 1: 500 für Alexa Fluor 633 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG oder Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG; (2) Für chromogene Färbung: 1: 200 zur biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG. HINWEIS: Der biotinylierte sekundäre Antikörper wird zur Wechselwirkung mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC) in dem Substrat-basierten (chromogenen) Erkennung, durch die die Färbung Signale signifikant verstärkt angewendet. </li><li> Für Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen Färbung im Dunkeln, weil der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist. </li></ol></li><li> Abwaschen sekundären Antikörpers mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min. </li></ol> 6. Nuclear und F-Aktin-Färbung HINWEIS: Dies ist nur für Immunfluoreszenzfärbung angewendet. <ol><li> Fleck Ovarien mit 0,2% PBST mit DAPI (2 ng / ul) und Phalloidin-TRITC (100 nM) für 2 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Eierstöcke mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min. </li><li> Inkubieren Eierstöcke mit dem Eindeckmedium O / N bei 4 ° C mit mildem Schütteln. </li></ol> 7. Signal Entwicklung HINWEIS: Dies ist nur für chromogene Färbung aufgetragen. <ol><li> Vorzubereiten 100 ulReagenz Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zum Verstärken der Signale, die durch Zugabe von 1 ul des Reagenz A (Avidin) in 98 ul 0,2% PBST über vorsichtiges Pipettieren gründlich gemischt und die Zugabe von 1 ul Reagenz B (Biotin konjugiert mit Meerrettichperoxidase ), gefolgt von sofortigem Mischen. Inkubieren des Gemisches für 30 min bei RT mit mildem Schütteln. </li><li> Ovarien (einschließlich der dissoziierten Eikammern) in der Mischung der Reagenzien A und B Inkubation 30 min bei RT mit mildem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Mischung von Reagenzien A und B mit 0,2% PBST 4 mal je 10 min. </li><li> Übertragen Sie die Eierstöcke in PBST eingetaucht, um eine gut auf der Tüpfelplatte mit einem Kunststoff-Pipette. </li><li> Bereiten Substratlösung von 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB): Lösen Sie eine DAB Tablet Plus über heftiges Vortexen ein anderes enthält Harnstoff-Wasserstoffperoxid in 1 ml ddH 2 O für 1 min. HINWEIS: DAB, ein Ausfällen von Peroxidase-Substrat, ist eine populäre Chromogen Immunfärbung. Es produziert eine brEigen- und unlöslicher Niederschlag, nachdem er durch die Peroxidase oxidiert wird. Schwache Signale können durch Zugabe von Nickelchlorid zu der Substratlösung (Endkonzentration 0,05-0,08%) verbessert werden. </li><li> Entfernen Sie die in der gut restlichen PBST-Lösung und füllen mit 100 ul der DAB Substratlösung für die Signalentwicklung. </li><li> Überwachen Intensität der Signale unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung. </li><li> Stopp-Reaktionen durch Entfernen des DAB-Lösung, gefolgt von der Wiederbefüllung mit 1x PBS sofort. Wiederholen Sie zweimal die Wäsche. </li><li> Übertragen Sie die Eierstöcke zurück in die 1,5-ml-Tube und dann mit 1x PBS oder PBST waschen zweimal für jeweils 15 min. </li><li> Eierstöcke in einem Glycerin-basierten Mounting Medium (70% Glycerin) O / N Inkubieren bei 4 ° C unter mildem Schütteln inkubiert. </li></ol> 8. Montage der Blattlaus Embryos HINWEIS: Die Dicke der Blattlaus Embryonen variiert zwischen Entwicklungsstadien. Montagestrategien werden so modifiziert, dass frühe passen (germaria und Stufen 0-10), Mitte (Stufen11-18), und am späten Embryonen (Stufen 19-20), die in 2B gezeigt sind - D. Embryonalen Staging gefolgt Miura et al. 12 <ol><li> Übertragen Sie die Eierstöcke mit Eindeckmedium auf die Zelle Tablett mit einer Plastiktropfen und beobachten Proben unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung. </li><li> Schneiden Sie die Kelche mit der seitlichen Eileiter mit Insektenstifte zugeordnet und dann auch über eine isoliert Ovariole in ein leeres Glas mit einer Pipette. Bilden Sie das Endvolumen auf 50 bis 100 &amp; mgr; l mit Eindeckmedium. </li><li> Übertragen Sie eine Ovariole auf den Objektträger mit einem Glas Tropf und dann zu sezieren Eikammern mit Insekten Pins. HINWEIS: Bei Embryonen älter als Stufe 6 der Entwicklung, Trennung von Eikammern vorgeschlagen; für germaria und die ersten beiden Eikammern jünger als Stufe 6 ist die Trennung optional. </li><li> Verlagern einen seziert Ei Kammer auf einen sauberen Objektträger mit einem Glas Tropf. </li><li> Setzen Sie ein Deckglas (Größe: 22 x 22mm) in den sezierten germaria oder Eierkammern (mit Embryonen im Stufen 1-10 von Entwicklungs) langsam, um Blasen zu vermeiden. <ol><li> Halterung Eikammern (enthaltend Embryonen in den Stufen 11-18 der Entwicklung) auf einer Folie mit einseitiger Deck Brücke und Stelle noch ein Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) oben auf der Probe. </li><li> Berg Eikammern (mit Embryonen älter als Stufe 19 der Entwicklung) auf einem Objektträger mit beidseitigem Deckbrücke und legen Sie eine weitere Deckglas (Größe: 18 x 18 mm) auf der Oberseite der Probe. </li></ol></li><li> Füllen Sie den Raum unter der oberen Deckglas mit Montage Medien zu vermeiden, Trocknen der Probe. </li><li> Mild rollen den Embryo durch Verschieben des Deckglases, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erhalten. </li><li> Dichtung um den Rand des Deckgläser (einschließlich der Brückendeckgläser) mit Nagellack. </li></ol> 9. Imaging Analysis <ol><li> Fotografisches Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder der ganze-mount Embryonen mit einem compound Mikroskop mit DIC Optik und einem Trockenobjektivlinse (10X, 20X, 40X) mit einer Kamera verbunden ausgestattet. Installieren Sie die Software für die Bildübertragung zwischen Kamera und Computer mit den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Erwerben Projektionen der fluoreszenzmarkierten Embryonen mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop 14. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für das Fotografieren, z-Stapeln und 3D Projizieren mit Imaging-Software. <ol><li> Drehen Sie den Schieber auf den Kopf, finden Sie den montierten Probe mit 10X-Objektiv, und kreisen Sie die Probenfläche mit einer feinen geölt-basierte Stift. HINWEIS: Das macht die Identifizierung der Probe leichter bei der Suche nach es durch Ziele eines konfokalen Mikroskops. </li><li> Einen Tropfen Öl auf der Oberseite der Deckfläche, dessen gegenüberliegende Seite ist, wie in 9.2.1 beschrieben markiert. </li></ol></li><li> Finden Sie die Fokusebene bei 40X Ölimmersionsobjektiv dann zu einem 63X Ölimmersionsobjektiv zu ändern. Manuell die Feinfokussteuerung nach oben zu verschieben und zu tunwn um das beste Brennebene zu erfassen. HINWEIS: Für die Beobachtung strukturelle Details germaria und frühen Embryonen, empfehlen wir, 40X Ziele oder solche mit höherer Vergrößerung. </li><li> Scannen Sie den Embryo in verschiedenen Anregungskanäle und Bild einen z-Stack zu erhalten. HINWEIS: Erbsenblattlaus Gewebe zu reduzieren Dicke jeder optischen Schnitt auf 1,5 um oder weniger. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir identifizierten optimalen Bedingungen für eine erfolgreiche Immunfärbung in der Erbsenblattlaus A. Pisum, ein aufstrebendes Modellorganismus für genomische und Entwicklungsstudien 3,15. Optimierten Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Reduzieren der Hintergrundfärbung verstärkt die Intensität und Spezifität von Signalen. Sie unterscheiden sich von Standardprotokollen für die Immunfärbung in anderen Tiermodellen in den Schritten zum Erzeugen von Poren in Zellmembranen ...

Blattläuse sind hemipteran Insekten mit kleinen (1-10 mm) weichen Körper. Sie ernähren sich von Pflanzen durch das Saugen Phloemsaft mit stechenden Mundwerkzeuge. Darüber hinaus setzen sie auf eine obligate Endosymbionten Bakterium, Buchnera aphidicola, um essentiellen Aminosäuren, die einen Mangel an der Phloemsaft Ernährung sind zu synthetisieren. Blattläuse haben einen komplexen Lebensgeschichte, die parthenogenetic viviparous Reproduktion im Frühjahr und Sommer Langtagsphotoperioden und sexuelle oviparous Wiedergabe durch Kurztagsphotoperioden, in denen sie eine begrenzte Anzahl von überwinternden Eiern 1,2 lag ausgelöst umfasst. Im Frühjahr diesen Eiern schlüpfen, um die erste Generation der rein weiblichen Blattläusen (fundatrices) zu produzieren, nach vielen Runden parthenogenetic Wiedergabe bis in den Herbst. Die zyklische Parthenogenese in Blattläuse, wo asexuelle und sexuelle Phasen wechseln im jährlichen Lebenszyklus hat sich als eine evolutionäre Neuheit 1,2 angesehen. In den parthenogenetic viviparous BlattläuseNimmt der Embryogenese innerhalb Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen). Im Gegensatz dazu entwickeln sexuelle oviparous Embryonen in die befruchtete Eier. Abgesehen von der reproduktiven Plastizität kann Blattläuse transgeneFlügel polyphenism Anzeigen: als Antwort auf Überbelegung Signale und Raubtier-Bedrohungen können die unwinged asexuelle Weibchen lebendgebärender produzieren geflügelten Nachkommen für Langstreckenwanderung. Veröffentlichung der Genomsequenz des Erbsenblattlaus Erbsenlaus -die erste Genomsequenz für eine basale hemimetabolous insekten ermöglicht die weitere Erforschung der reproduktiven Plastizität Flügel polyphenism und weitere Funktionen, darunter Insekten-Pflanzen-Interaktionen, virale Vectoring und Symbiose in Blattläuse auf molekularer Basis 3. Zusätzlich zu dem sequenzierten Genoms werden Werkzeuge zum Charakterisieren Genexpression und die Funktion zur Förderung der Erbsenblattlaus als reife Modellorganismus 4 erforderlich. Wir haben robuste Protokolle der ganzen-mount beschrieben <em&gt; in situ-Hybridisierung zum Nachweis der Expression von mRNA in Blattlaus Embryonen 5-7. RNA-Interferenz (RNAi) durch doppelsträngige RNA-Injektion und Fütterung für Gen-Silencing in Blattlaus Nymphen und Erwachsene verwendet worden, aber stabilen Bedingungen für die Gen in den Embryonen Knockdown noch nicht gemeldet 8-10. Immunfärbung, ein Antikörper-basierten Ansatz, der Protein-Expression in Proben nachweisen kann vor und nach RNAi hat auf Erbsenblattlaus Embryonen 11-13 durchgeführt. , Erhöhung der Gewebe Durchlässigkeit und Eliminierung von Hintergrundfärbung sind jedoch noch nicht zufriedenstellend Verwendung von Standardprotokollen für die Immunfärbung in der asexuellen viviparous Embryonen von Erbsenblattlaus. Beispielsweise fanden wir, dass das Eindringen von Antikörper zu den Geweben verringert in gastrulating Embryonen (Stufen 8-10), und dass Embryonen morphologisch identifizierbaren Extremitätenknospen (Stufen 13-14) waren kaum durchlässig für Antikörper. Darüber hinaus wurde die Hintergrundfärbung in der ungeschlechtlichen viviparo visualisiertus Erbsenblattlaus Embryonen färbt unter Verwendung von Antikörper gegen die Keimbahn Marker Vasa als auch die gegen das Engrailed / Invected Protein in den embryonalen Segmente 12,13 ausgedrückt. Tatsächlich Hintergrundfärbung noch in Embryonen mit dem sekundären Antikörper allein gefärbt deutlich sichtbar. Um die Durchlässigkeit ohne Beschädigung Integrität Blattlaus Geweben erhöhen wir sorgfältig titriert die Konzentration von Proteinase K und bestimmt optimale Bedingungen für die Gewebeverdauungs auf Blattläuse Embryonen. Um nicht-spezifische Färbung in der Erbsenblattlaus zu vermeiden, suchten wir nach Verbindungen, die effektiv blockieren könnten Embryonen und zu unterdrücken Aktivität von endogenen Peroxidase (POD), ein Enzym zur Verstärkung von Signalen während der Immunfärbung eingesetzt. Ein Blockierungsmittel durch eine Digoxigenin (DIG) basierende Puffersatz vorgesehen ist, sondern die traditionell verwendet normalem Ziegenserum (NGS) / Rinderserumalbumin (BSA), deutlich reduziert Hintergrundfärbung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Methanol InHiBit des endogenen POD-Aktivität wirksamer als Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Einzelheiten bezüglich dieser Blattlaus-spezifischen Bedingungen für die Immunfärbung an Embryonen wird in den folgenden Abschnitten beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>30% Wasserstoff-Perxidase (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Zum Bleichen der endogenen Peroxidase von Embryonen.</td></tr><tr><td>4' 6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Zur Markierung der Doppelstrang-DNA. GIFTIG. Tragen Sie Handschuhe, geben Sie in kleine Aliquots und feeze, um die Exposition zu minimieren</td></tr><tr><td>4D9 anti-engrailed/invected Maus monoklonale Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>AB_528224</td><td>Zur Markierung der sich entwickelnden Segmente des Embryos.</td></tr><tr><td>ApVas1 polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td><td>Unser Labor</td><td>N/A</td><td>Zur Markierung des Keimbahn-spezifischen Vas1-Proteins der Blattlaus in Embryonen. Dieser Antikörper wurde von unserem Labor hergestellt.</td></tr><tr><td>Austerlitz Insektenstifte</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Zum Trennen jeder Eikammer von einer Eierzelle. Größe 000, SCHWARZ EMAILLIERT.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern.</td></tr><tr><td>Kamera verbunden mit Verbundmikroskop</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Zum Fotografieren von Blattlausembryonen.</td></tr><tr><td>Kolorimetrisches 8-Zellen-Tablett</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Zur Entwicklung des Färbesignals von Blattlausembryonen. Durchmesser 95 x 57 mm, Zellentiefe 2 mm.</td></tr><tr><td>Durchlichtmikroskop mit DIC-Optik</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Zum Fotografieren von Blattlausembryonen, die auf den Objektträgern montiert sind.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern. Wir haben die 10x Blockierungslösung in 1x als Blockierungsreagenz verdünnt.</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Zum Sezieren von Eierstöcken von Blattläusen. Hersteller-Nr. 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glastropfer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Übertragen von Eierstöcken von Blattläusen von der Slotplatte auf die Röhrchen. 150 mm Gesamtlänge und 5 3/4" Spitzenlänge.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Zur Reinigung von Blattlausembryonen und zur Montage.</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Zur Blockierung der Enzymaktivität der Proteinase K (PK).</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG-konjugiertes Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Zum Nachweis von Primärantikörpern aus der Maus.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-konjugiertes Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Zum Nachweis von Primärantikörpern von Kaninchen.</td></tr><tr><td>Intelli Mischer</td><td>ELMI Laborgerät</td><td>RM-2M</td><td>Zur Verbesserung der gründlichen Reaktion von Reagenzien mit den Eierstöcken.</td></tr><tr><td>Konfokale Laserscanning-Mikroskopie</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Zum Fotografieren von Blattlausembryonen, die auf Objektträgern mit florecent Etikett montiert sind.</td></tr><tr><td>Methanol&nbsp;</td><td>Burdick und Jackson</td><td>AH2304</td><td>Zum Bleichen der endogenen Peroxidase von Embryonen.</td></tr><tr><td>Objektträger&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>10143560</td><td>Für die Einbettung von Embryonen. SUPERFROST geschliffene Kanten, ca./env. 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Mikroskop Abdeckbrille</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Zum Befestigen von Embryonen auf den Objektträgern. Größe 18 x 18 mm. Dicke Nr. 1 (0,13 bis 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Zum Befestigen von Embryonen auf den Objektträgern. Größe 22 x 22 mm. Dicke Nr. 1 (0,13 bis 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Anti-alphaTubulin-Antikörper (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Zur Markierung der Verteilung von Alpha-Tubulin in Zellen.</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Versiegeln der Deckgläser auf den Objektträgern.</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Zur Blockierung der unspezifischen Bindung von Antikörpern.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Zur Fixierung von Blattlaus-Eierstöcken.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Zur Markierung der Verteilung von F-Aktin auf Embryonen.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Als isotonische Lösung für Blattlaus-Eierstöcke.</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>aus Kunststoff N/A</td><td>N/A</td><td>Zum Transfer der Eierstöcke von Blattläusen von der Tube in die Zellschale. Größe 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Zur Schaffung von Poren (Stanzen) auf der Zellmembran und zur Erleichterung des Zugangs von Antikörpern.</td></tr><tr><td>Pyrex-Spotplatte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Für die Dissektion und Farbreaktionen von Blattlaus-Eierstöcken unter der Mikroskopie. Jeder Hohlraum mit einem Durchmesser von 22 mm und&nbsp; Tiefe 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Für die Entwicklung von substratierten Signalen. Auch DAB-Peroxidase-Substrat-Tablettenset genannt.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Zum Sezieren und Betrachten von Blattlaus-Eierstöcken.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Zum Erzeugen von Poren (Stanzen) auf der Zellmembran.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>Zur Verstärkung des Signals. Einschließlich biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper, A- und B-Reagenzien.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>Zur Reinigung von Blattlausembryonen und zur Einbettung.</td></tr></tbody></table>

identifizierung kritischer bedingungen für die immunfärbung in der erbsenblattlaus embryos: erhöhung gewebepermeabilität und abnehmender hintergrundfärbung

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Die Erbsenblattlaus Erbsenlaus, mit einem sequenzierten Genoms und reichlich phänotypische Plastizität, hat sich zu einem aufstrebenden Modell für genomische und Entwicklungsstudien. Wie andere Blattläuse, A. Pisum ausbreiten schnell über parthenogenetic viviparous Vervielfältigung, in denen die Embryonen im Ei Kammern in einem Fließband in der Ovariole. Bisher haben wir eine robuste Plattform von ganzen-mount in situ Hybridisierung ermöglicht Detektion von mRNA-Expression in den Blattlaus Embryonen etabliert. Zur Analyse der Expression von Protein, obwohl, etablierten Protokolle für die Immunfärbung der Ovariolen der asexuellen viviparous Blattläuse nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Bedingungen für die Erhöhung der Gewebepermeabilität und Verringern der Hintergrundfärbung, die beide Probleme bei der Anwendung von etablierten Ansätzen optimiert berichten wir hier. Optimierungen umfassen: (1) Inkubation mit Proteinase K (1 ug / ml, 10 min), die wesentlich f gefunden wurdeoder Antikörper-Penetration in mittleren und späten Stadium Blattlaus Embryonen; (2) Austausch von normalem Ziegenserum / Rinderserumalbumin mit einem Blockierungsreagenz durch eine Digoxigenin (DIG) geliefert -basierte Puffer gesetzt und (3) Anwendung von Methanol statt Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zum Bleichen von endogenen Peroxidase; welche deutlich reduziert die Hintergrundfärbung in der Blattlaus Gewebe. Diese kritischen Bedingungen für die Immunfärbung optimiert werden effektive Erkennung von Genprodukten in den Embryonen von A. Pisum und andere Blattläuse zu ermöglichen.

In dieser Studie, führten wir ganze-mount Immunfärbung an Embryonen der asexuellen Erbsen Blattläuse (Abbildung 1A). Diese weibliche Nachkommen zu produzieren parthenogenetisch und lebendgebärender. Diese weibliche Embryonen im Ei Kammern der Eierstock-Tubuli (Ovariolen) (Abbildung 1B und 2A). Vor der Mikroskopie, die seziert Ovariolen sind die Färbung Ziele; jedoch wird die Trennung Eikammern zur Beobachtung von Embryonen unter einem Mi...

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Das übergeordnete Ziel dieses Immunfärbungsprotokolls besteht darin, die Proteink表达ion in den Embryonen von Blattläusen nachzuweisen. Es werden kritische Bedingungen identifiziert, die die Gewebedurchlässigkeit erhöhen und die Hintergrundfärbung verringern, was seit Langem bestehende Probleme bei der Färbung embryonalen Gewebes von Blattläusen darstellen. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie spezifische Bedingungen bereitstellt, die eine effektive Penetration von Antikörpern ermöglichen und die Hintergrundfärbung reduzieren, was in einem Standard-Immunfärbungsprotokoll üblicherweise nicht beschrieben wird.Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir untersuchten, wie Keimzellen in einer Erbsenlaus, einem Insektenmodell für genomische und umweltbezogene Studien, spezifiziert werden. Der Labortyp der Erbsenlaus, A. pisum, wurde ursprünglich in Zentral-Taiwan gesammelt und seitdem über mehr als 300 Generationen auf Wirtspflanzen gezüchtet.Um die Keimung zu fördern, werden die Samen der Wirtspflanzen drei bis fünf Tage lang bei Raumtemperatur in Leitungswasser eingeweicht. Das frische Wasser wird einmal täglich erneuert. Zehn keimende Samen werden in einem kleinen Topf mit Erde in der Wachstumskammer bei einer Lichtperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius kultiviert.Ungefähr 10 Tage nach Beginn des Wachstums beträgt die Höhe der Pflanzen normalerweise mehr als acht Zentimeter. Stellen Sie jeden Pflanzentopf in einen einliterigen Glasbecher und übertragen Sie erwachsene Blattläuse mithilfe eines Pinsels auf die Pflanzen. Verschließen Sie den Becher anschließend mit einer luftdurchlässigen Abdeckung, beispielsweise Gaze, um ein Entweichen der Blattläuse zu verhindern.Die Blattläuse in einer Wachstumskammer bei einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 16 Stunden Licht und acht Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius inkubieren, wobei jede Pflanzengefäße einmal täglich bewässert wird. Ein Loch einer Vertiefungsplatte mit etwa 500 Mikrolitern einer 4-prozentigen Paraformaldehydlösung füllen. Die Platte unter ein Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung stellen und einen erwachsenen Blattlaus in das Paraformaldehyd zur Zerlegung eintauchen lassen.Lösen Sie die Ovarien, indem Sie Kopf und Abdomen mit einer Pinzette festhalten, das dorsale Cuticula des Abdomens aufschneiden und die Ovarien aus der Bauchhöhle herausziehen. Fixieren Sie danach drei Ovarienpaare in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das ein Milliliter Paraformaldehyd bei Raumtemperatur enthält, für 20 Minuten unter leichtem Schütteln auf einem Mischgerät. Entsorgen Sie den Fixierpuffer mit einer Glaspipette und waschen Sie die Ovarien anschließend dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST, jeweils unter leichtem Schütteln.Um die Ovarien zu behandeln, inkubieren Sie diese zuerst 10 Minuten lang unter leichtem Schütteln mit Proteinase K, um die Permeabilität des embryonalen Gewebes zu erhöhen. Nach der Inkubation entsorgen Sie die Proteinase-K-Lösung und waschen die Ovarien anschließend dreimal je fünf Minuten lang mit 700 Mikrolitern Glycin. Danach waschen Sie die Ovarien zweimal je 10 Minuten mit PBST. Fixieren Sie die Eierst&ouml;cke erneut mit Fixierungspuffer f&uuml;r 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Sch&uuml;tteln. Um die endogene Peroxidase-Aktivit&auml;t zu unterdr&uuml;cken, dehydrieren Sie die Eierst&ouml;cke nacheinander mit verschiedenen Konzentrationen von Methanol in 0,2 Prozent PBST in Volumenverh&auml;ltnissen von eins zu drei, eins zu eins und drei zu eins und inkubieren Sie die Eierst&ouml;cke anschlie&szlig;end eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Sch&uuml;tteln mit 100 Prozent Methanol. Danach rehydrieren Sie die Eierst&ouml;cke nacheinander, wie im Textprotokoll beschrieben.Für drei Ovarpaare in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen ist 200 µL das Mindestvolumen für die Probenblockierung und die Antikörper-Färbung. Inkubieren Sie die Ovarien vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit der 1x DIG-B-Blockierungslösung unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation entsorgen Sie den Überstand und ersetzen ihn durch frische 1x DIG-B-Blockierungslösung, die den Primärantikörper in der geeigneten Verdünnungsrate enthält.Färben Sie die Eierstöcke vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln. Nach dem Waschen der Eierstöcke gemäß der schriftlichen Anleitung verwerfen Sie den Überstand und ersetzen ihn durch frische 1x DIG-B-Blockierungslösung, die den sekundären Antikörper in der geeigneten Verdünnungsrate enthält; anschließend färben Sie die Eierstöcke wie zuvor. Führen Sie die immunfluoreszente Färbung im Dunkeln durch, da der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist.Die Dicke von Blattlaus-Embryonen variiert je nach Entwicklungsstadium. Die Einbettungsstrategien werden daher entsprechend an frühe, mittlere und späte Embryonen angepasst. Überführen Sie die Ovarien mithilfe einer Plastikpipette zusammen mit dem Einbettmedium in die Zellkammer und untersuchen Sie die Proben unter einem Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung.Schneiden Sie die mit dem seitlichen Eileiter verbundenen Hornhautverdickungen mit Insektennadeln durch und übertragen Sie dann einen isolierten Ovariol mit einer Pipette in eine leere Glasvertiefung. Stellen Sie das Endvolumen mit Montagemedium auf 50 bis 100 Mikroliter ein. Übertragen Sie anschließend einen Ovariol mit einer Glaspipette auf den Objektträger.Zerlegen Sie die Eikammern mit Insektennadeln. Bei Embryonen, die älter als Stadium sechs der Entwicklung sind, wird die Trennung der Eikammern empfohlen. Für die Keimleiter und die ersten beiden Eikammern ist die Trennung optional.Verlegen Sie eine präparierte Eikammer mit einer Glaspipette auf einen sauberen Objektträger. Für Embryonen in den Entwicklungsstadien eins bis 10 platzieren Sie langsam ein Deckglas über die präparierten Keimleisten oder Eikammern, um Blasenbildung zu vermeiden. Alternativ montieren Sie für Embryonen in den Stadien 11 bis 18 die Eikammern auf einem Objektträger mit einer einseitigen Brücke aus Deckglas und legen ein weiteres Deckglas auf die Probe.Für Embryonen, die ein Entwicklungsstadium älter als Stadium 19 aufweisen, montieren Sie die Eikammern mit einer doppelseitigen Deckglasklemme auf einem Objektträger und legen ein weiteres Deckglas auf die Probe. Füllen Sie anschließend den Raum unterhalb des oberen Deckglases mit Einbettmedium, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Rollen Sie das obere Deckglas leicht, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erreichen.Schließlich die Ränder der Deckgläser, einschließlich der Brückendeckgläser, vor der Bildanalyse mit Nagellack versiegeln, wie im Textprotokoll beschrieben. Gezeigt sind ein Paar Ovarien, die aus einem weiblichen Adulten präpariert wurden. Ein Ovariolum besteht aus einem Keimarium, ein bis zwei O-Stellen sowie fünf bis sieben Embryonen, die alle in einer Art Fließbandanordnung innerhalb von Eikammern untergebracht sind.Nach der Fixierung mit Paraformaldehyd wird eine Verdauung der Ovarien in Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter über 10 Minuten ausdrücklich empfohlen. Die Färbungsergebnisse zeigen, dass die Signalintensität in den mit Proteinase K behandelten Embryonen deutlich erhöht ist. Die Inkubation der Embryonen in der Blockierungslösung aus einem DIG-basierten Puffer-Set verringert die Hintergrundfärbung stärker als die Inkubation in normalen Ziegenserum und Rinderserumalbumin.Die endogene Aktivität von Peroxidase kann ebenfalls zu einer starken Hintergrundfärbung führen. Diese Studien zeigen, dass das Eintauchen von Blattlausembryonen in Methanol die Peroxidase-Aktivität deutlich effizienter unterdrückt als die Behandlung der Embryonen mit Wasserstoffperoxid. Die in dieser Studie ermittelten entscheidenden Bedingungen können für die Signalnachweisung sowohl in Keimzellen als auch in somatischen Zellen angewendet werden.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine erfolgreiche Immunfärbung an Blattlausembryonen durchführt, einschließlich der Erhöhung der Signalintensität und der Verringerung der Hintergrundfärbung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Embryo vorsichtig zu manipulieren, um eine gute Embryonenform zu erhalten.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können weitere Maßnahmen wie die *in situ*-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Boten-RNA zusammen mit ihrem Proteinprodukt in embryonalen Zellen lokalisiert ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Umweltbiologie von Insekten zu beantworten, wie beispielsweise, wie Keimzellen festgelegt werden und wie Eizellen in unterschiedlichen Fortpflanzungsphasen bei Blattläusen bestimmt werden.

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Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung (Video) | JoVE Journal

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

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