Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Das übergeordnete Ziel dieses Immunfärbungsprotokolls besteht darin, die Proteink表达ion in den Embryonen von Blattläusen nachzuweisen. Es werden kritische Bedingungen identifiziert, die die Gewebedurchlässigkeit erhöhen und die Hintergrundfärbung verringern, was seit Langem bestehende Probleme bei der Färbung embryonalen Gewebes von Blattläusen darstellen. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie spezifische Bedingungen bereitstellt, die eine effektive Penetration von Antikörpern ermöglichen und die Hintergrundfärbung reduzieren, was in einem Standard-Immunfärbungsprotokoll üblicherweise nicht beschrieben wird.

Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir untersuchten, wie Keimzellen in einer Erbsenlaus, einem Insektenmodell für genomische und umweltbezogene Studien, spezifiziert werden. Der Labortyp der Erbsenlaus, A. pisum, wurde ursprünglich in Zentral-Taiwan gesammelt und seitdem über mehr als 300 Generationen auf Wirtspflanzen gezüchtet.

Um die Keimung zu fördern, werden die Samen der Wirtspflanzen drei bis fünf Tage lang bei Raumtemperatur in Leitungswasser eingeweicht. Das frische Wasser wird einmal täglich erneuert. Zehn keimende Samen werden in einem kleinen Topf mit Erde in der Wachstumskammer bei einer Lichtperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius kultiviert.

Ungefähr 10 Tage nach Beginn des Wachstums beträgt die Höhe der Pflanzen normalerweise mehr als acht Zentimeter. Stellen Sie jeden Pflanzentopf in einen einliterigen Glasbecher und übertragen Sie erwachsene Blattläuse mithilfe eines Pinsels auf die Pflanzen. Verschließen Sie den Becher anschließend mit einer luftdurchlässigen Abdeckung, beispielsweise Gaze, um ein Entweichen der Blattläuse zu verhindern.

Die Blattläuse in einer Wachstumskammer bei einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 16 Stunden Licht und acht Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius inkubieren, wobei jede Pflanzengefäße einmal täglich bewässert wird. Ein Loch einer Vertiefungsplatte mit etwa 500 Mikrolitern einer 4-prozentigen Paraformaldehydlösung füllen. Die Platte unter ein Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung stellen und einen erwachsenen Blattlaus in das Paraformaldehyd zur Zerlegung eintauchen lassen.

Lösen Sie die Ovarien, indem Sie Kopf und Abdomen mit einer Pinzette festhalten, das dorsale Cuticula des Abdomens aufschneiden und die Ovarien aus der Bauchhöhle herausziehen. Fixieren Sie danach drei Ovarienpaare in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das ein Milliliter Paraformaldehyd bei Raumtemperatur enthält, für 20 Minuten unter leichtem Schütteln auf einem Mischgerät. Entsorgen Sie den Fixierpuffer mit einer Glaspipette und waschen Sie die Ovarien anschließend dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBST, jeweils unter leichtem Schütteln.

Um die Ovarien zu behandeln, inkubieren Sie diese zuerst 10 Minuten lang unter leichtem Schütteln mit Proteinase K, um die Permeabilität des embryonalen Gewebes zu erhöhen. Nach der Inkubation entsorgen Sie die Proteinase-K-Lösung und waschen die Ovarien anschließend dreimal je fünf Minuten lang mit 700 Mikrolitern Glycin. Danach waschen Sie die Ovarien zweimal je 10 Minuten mit PBST.

Fixieren Sie die Eierstöcke erneut mit Fixierungspuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu unterdrücken, dehydrieren Sie die Eierstöcke nacheinander mit verschiedenen Konzentrationen von Methanol in 0,2 Prozent PBST in Volumenverhältnissen von eins zu drei, eins zu eins und drei zu eins und inkubieren Sie die Eierstöcke anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit 100 Prozent Methanol. Danach rehydrieren Sie die Eierstöcke nacheinander, wie im Textprotokoll beschrieben.

Für drei Ovarpaare in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen ist 200 µL das Mindestvolumen für die Probenblockierung und die Antikörper-Färbung. Inkubieren Sie die Ovarien vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit der 1x DIG-B-Blockierungslösung unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation entsorgen Sie den Überstand und ersetzen ihn durch frische 1x DIG-B-Blockierungslösung, die den Primärantikörper in der geeigneten Verdünnungsrate enthält.

Färben Sie die Eierstöcke vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln. Nach dem Waschen der Eierstöcke gemäß der schriftlichen Anleitung verwerfen Sie den Überstand und ersetzen ihn durch frische 1x DIG-B-Blockierungslösung, die den sekundären Antikörper in der geeigneten Verdünnungsrate enthält; anschließend färben Sie die Eierstöcke wie zuvor. Führen Sie die immunfluoreszente Färbung im Dunkeln durch, da der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist.

Die Dicke von Blattlaus-Embryonen variiert je nach Entwicklungsstadium. Die Einbettungsstrategien werden daher entsprechend an frühe, mittlere und späte Embryonen angepasst. Überführen Sie die Ovarien mithilfe einer Plastikpipette zusammen mit dem Einbettmedium in die Zellkammer und untersuchen Sie die Proben unter einem Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung.

Schneiden Sie die mit dem seitlichen Eileiter verbundenen Hornhautverdickungen mit Insektennadeln durch und übertragen Sie dann einen isolierten Ovariol mit einer Pipette in eine leere Glasvertiefung. Stellen Sie das Endvolumen mit Montagemedium auf 50 bis 100 Mikroliter ein. Übertragen Sie anschließend einen Ovariol mit einer Glaspipette auf den Objektträger.

Zerlegen Sie die Eikammern mit Insektennadeln. Bei Embryonen, die älter als Stadium sechs der Entwicklung sind, wird die Trennung der Eikammern empfohlen. Für die Keimleiter und die ersten beiden Eikammern ist die Trennung optional.

Verlegen Sie eine präparierte Eikammer mit einer Glaspipette auf einen sauberen Objektträger. Für Embryonen in den Entwicklungsstadien eins bis 10 platzieren Sie langsam ein Deckglas über die präparierten Keimleisten oder Eikammern, um Blasenbildung zu vermeiden. Alternativ montieren Sie für Embryonen in den Stadien 11 bis 18 die Eikammern auf einem Objektträger mit einer einseitigen Brücke aus Deckglas und legen ein weiteres Deckglas auf die Probe.

Für Embryonen, die ein Entwicklungsstadium älter als Stadium 19 aufweisen, montieren Sie die Eikammern mit einer doppelseitigen Deckglasklemme auf einem Objektträger und legen ein weiteres Deckglas auf die Probe. Füllen Sie anschließend den Raum unterhalb des oberen Deckglases mit Einbettmedium, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Rollen Sie das obere Deckglas leicht, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erreichen.

Schließlich die Ränder der Deckgläser, einschließlich der Brückendeckgläser, vor der Bildanalyse mit Nagellack versiegeln, wie im Textprotokoll beschrieben. Gezeigt sind ein Paar Ovarien, die aus einem weiblichen Adulten präpariert wurden. Ein Ovariolum besteht aus einem Keimarium, ein bis zwei O-Stellen sowie fünf bis sieben Embryonen, die alle in einer Art Fließbandanordnung innerhalb von Eikammern untergebracht sind.

Nach der Fixierung mit Paraformaldehyd wird eine Verdauung der Ovarien in Proteinase-K-Lösung mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter über 10 Minuten ausdrücklich empfohlen. Die Färbungsergebnisse zeigen, dass die Signalintensität in den mit Proteinase K behandelten Embryonen deutlich erhöht ist. Die Inkubation der Embryonen in der Blockierungslösung aus einem DIG-basierten Puffer-Set verringert die Hintergrundfärbung stärker als die Inkubation in normalen Ziegenserum und Rinderserumalbumin.

Die endogene Aktivität von Peroxidase kann ebenfalls zu einer starken Hintergrundfärbung führen. Diese Studien zeigen, dass das Eintauchen von Blattlausembryonen in Methanol die Peroxidase-Aktivität deutlich effizienter unterdrückt als die Behandlung der Embryonen mit Wasserstoffperoxid. Die in dieser Studie ermittelten entscheidenden Bedingungen können für die Signalnachweisung sowohl in Keimzellen als auch in somatischen Zellen angewendet werden.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine erfolgreiche Immunfärbung an Blattlausembryonen durchführt, einschließlich der Erhöhung der Signalintensität und der Verringerung der Hintergrundfärbung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Embryo vorsichtig zu manipulieren, um eine gute Embryonenform zu erhalten.

Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können weitere Maßnahmen wie die *in situ*-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Boten-RNA zusammen mit ihrem Proteinprodukt in embryonalen Zellen lokalisiert ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Umweltbiologie von Insekten zu beantworten, wie beispielsweise, wie Keimzellen festgelegt werden und wie Eizellen in unterschiedlichen Fortpflanzungsphasen bei Blattläusen bestimmt werden.