Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Das übergeordnete Ziel dieses Immunfärbeprotokolls ist es, die Proteinexpression in den Blattlausembryonen nachzuweisen. Es werden kritische Bedingungen identifiziert, die die Gewebepermeabilität erhöhen und die Hintergrundfärbung verringern, was beides seit langem bestehende Probleme bei der Färbung von embryonalem Gewebe von Blattläusen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie spezifische Bedingungen für eine effektive Penetration von Antikörpern und eine Verringerung der Hintergrundfärbung bietet, die normalerweise nicht in einem Standard-Immunfärbeprotokoll beschrieben werden.

Wir hatten die Idee zu diesem Maß zum ersten Mal, als wir untersuchten, wie Keimzellen in einer Erbsenblattlaus, einer Vielzahl von Insektenmodellen, für Genomik- und Umweltstudien spezifiziert werden. Der Laborstamm der Erbsenblattlaus, A. pisum, wurde ursprünglich in Zentraltaiwan gesammelt und wird seit mehr als 300 Generationen auf Wirtspflanzen gezüchtet.

Zum Keimen weichen Sie die Samen der Wirtspflanzen drei bis fünf Tage lang in Leitungswasser bei Raumtemperatur ein. Füllen Sie das frische Wasser einmal täglich auf. Züchten Sie zehn keimende Samen in einem kleinen Topf mit Erde in der Wachstumskammer unter einer Fotoperiode von 16 Stunden Licht, acht Stunden Dunkelheit und 20 Grad Celsius.

Etwa 10 Tage nach Beginn des Wachstums beträgt die Höhe der Pflanzen in der Regel mehr als acht Zentimeter. Halten Sie jeden Topf mit den Pflanzen in einem Ein-Liter-Glasbecher und übertragen Sie erwachsene Blattläuse mit einem Pinsel auf die Pflanzen. Verschließen Sie dann das Becherglas mit einer luftdurchlässigen Abdeckung, z. B. einem Mullnetz, um das Entweichen von Blattläusen zu verhindern.

Inkubieren Sie die Blattläuse in der Wachstumskammer unter einer Photoperiode von 16 Stunden Licht, acht Stunden Dunkelheit, bei 20 Grad Celsius und gießen Sie jeden Topf mit Pflanzen einmal täglich. Füllen Sie eine Vertiefung einer Spotplatte mit etwa 500 Mikrolitern 4 Prozent Paraformaldehyd. Legen Sie die Platte bei geringer Vergrößerung unter ein Stereomikroskop und tauchen Sie eine erwachsene Blattlaus zur Dissektion in das Paraformaldehyd

Präparieren Sie die Eierstöcke, indem Sie den Kopf und den Bauch mit einer Pinzette festhalten, die dorsale Kutikula des Bauches aufschneiden und die Eierstöcke aus der Bauchhöhle wegziehen. Fixieren Sie anschließend drei Eierstockpaare in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter leichtem Schütteln auf einem Mixer. Entsorgen Sie den Fixierungspuffer mit einer Glaspipette und waschen Sie die Eierstöcke dann dreimal 10 Minuten lang mit PBST unter leichtem Schütteln.

Um die Eierstöcke zu behandeln, inkubieren Sie sie zunächst 10 Minuten lang mit Proteinase K unter leichtem Schütteln, um die Durchlässigkeit des embryonalen Gewebes zu erhöhen. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Proteinase K-Lösung und waschen Sie die Eierstöcke dreimal fünf Minuten lang mit 700 Mikrolitern Glycin. Waschen Sie anschließend die Eierstöcke zweimal 10 Minuten lang mit PBST.

Fixieren Sie die Eierstöcke erneut mit Fixierpuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Um die Aktivität der engoenösen Peroxidase zu unterdrücken, dehydrieren Sie die Eierstöcke seriell mit unterschiedlichen Anteilen von Methanol in 0,2 Prozent PBST mit Volumenverhältnissen von eins zu drei, eins zu eins und drei zu eins, und inkubieren Sie dann die Eierstöcke eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit 100 Prozent Methanol. Rehydrieren Sie dann die Eierstöcke seriell, wie im Textprotokoll beschrieben.

Für drei Paar Eierstöcke in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen sind 200 Mikroliter das Mindestvolumen für die Probenblockierung und Antikörperfärbung. Inkubieren Sie die Eierstöcke mit der 1x DIG-B-Blockierungslösung für vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation ist der Überstand zu verwerfen und durch eine frische 1x DIG-B-Blockierungslösung zu ersetzen, die den Primärantikörper im geeigneten Verdünnungsverhältnis enthält.

Färben Sie die Eierstöcke vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln. Nach dem Waschen der Eierstöcke, wie im Textprotokoll beschrieben, den Überstand verwerfen und durch frische 1x DIG-B-Blockierungslösung ersetzen, die den Sekundärantikörper im entsprechenden Verdünnungsverhältnis enthält, und die Eierstöcke wie zuvor färben. Bei der Immunfluoreszenzfärbung ist die Färbung im Dunkeln durchzuführen, da der Sekundärantikörper lichtempfindlich ist.

Die Dicke von Blattlausembryonen variiert zwischen den Entwicklungsstadien. Die Einlagerungsstrategien werden so modifiziert, dass sie für frühe, mittlere und späte Embryonen geeignet sind. Übertragen Sie die Eierstöcke zusammen mit dem Eindeckmedium mit einer Kunststoffpipette in die Zellschale und betrachten Sie die Proben unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung.

Schneiden Sie die mit dem lateralen Eileiter verbundenen Schwielen mit Insektennadeln ab und geben Sie dann eine isolierte Ovariole mit einer Pipette in eine leere Glasmulde. Füllen Sie das endgültige Volumen mit Eindeckmedium auf 50 bis 100 Mikroliter auf. Übertragen Sie dann mit einer Glaspipette eine Eierstöcke auf den Objektträger.

Präpariere Eierkammern mit Insektennadeln. Bei Embryonen, die älter als das sechste Entwicklungsstadium sind, wird eine Trennung der Eikammern empfohlen. Für die Keimzellen und die ersten beiden Eikammern ist die Trennung optional.

Platzieren Sie eine präparierte Eikammer mit einer Glaspipette auf einem sauberen Objektträger. Bei Embryonen in den Stadien eins bis 10 der Entwicklung legen Sie langsam ein Deckglas über die präparierten Keim- oder Eikammern, um Blasen zu vermeiden. Alternativ können Sie bei Embryonen im Entwicklungsstadium 11 bis 18 die Eikammern auf einen Objektträger mit einer einseitigen Deckbrücke montieren und einen weiteren Deckglas auf die Probe legen.

Bei Embryonen, die älter als das 19. Entwicklungsstadium sind, montieren Sie die Eikammern auf einen Objektträger mit einer doppelseitigen Deckbrücke und legen Sie einen weiteren Deckglas auf die Probe. Füllen Sie anschließend den Raum unter dem oberen Deckglas mit Eindeckmedien, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Rollen Sie den oberen Deckglas, um die richtige Ausrichtung für die Beobachtung zu erhalten.

Versiegeln Sie abschließend die Kante der Deckgläser, einschließlich der Brückenabdeckfolien, mit Nagellack, bevor Sie eine Bildanalyse durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist ein Paar Eierstöcke zu sehen, die von einem weiblichen Erwachsenen seziert wurden. Eine Ovariole besteht aus einem Germarium, ein bis zwei O-Stellen sowie fünf bis sieben Embryonen, die alle wie am Fließband in den Eikammern untergebracht sind.

Nach der Paraformaldehyd-Fixierung wird der Aufschluss der Eierstöcke in Proteinase-K-Lösung in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter für 10 Minuten dringend empfohlen. Die Färbeergebnisse zeigen, dass die Signalintensität in den mit Poteinase K verdauten Embryonen signifikant erhöht ist. Die Inkubation von Embryonen in der Blockierungslösung aus einem DIG-basierten Pufferset reduziert mehr Hintergrundfärbungen als die von Embryonen in normalem Ziegenserum und Rinderserumalbumin.

Die endogene Aktivität der Peroxidase kann auch zu einer hohen Hintergrundfärbung führen. Diese Studien zeigen, dass das Eintauchen von Blattlausembryonen in Methanol die Peroxidaseaktivität viel effizienter unterdrücken kann als die Behandlung von Embryonen mit Wasserstoffperoxid. Die in dieser Studie aufgedeckten kritischen Bedingungen können für die Signaldetektion sowohl in Keimzellen als auch in somatischen Zellen eingesetzt werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine erfolgreiche Immunfärbung an Blattlausembryonen durchführt, einschließlich der Erhöhung der Signalintensität und der Reduzierung der Hintergrundfärbung. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, jeden Embryo sanft zu manipulieren, um eine gute Form der Embryonen zu erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe getroffen werden sollten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Messungen wie z.B. die in situ Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. ob die Messanger-RNA mit ihrem Proteinprodukt in den embryonalen Zellen lokalisiert ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Umweltbiologie von Insekten zu beantworten, z. B. wie Keimzellen spezifiziert werden und wie Eizellen bei Blattläusen in verschiedenen Fortpflanzungsphasen bestimmt werden.