Name: Gründung der Krebszellkulturen von Human Konventionelle Osteosarkom Stem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Krebsstammzellen aus humanen Osteosarkom-Biopsien mit der Sphärenbildungs-Assay-Methode. Dieses Protokoll ermöglicht die Erforschung gezielter Therapien gegen Knochentumoren.

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Diese Studie wurde durch den ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010 unterstützt.

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Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

KSZ haben mehrere Eigenschaften, die die Identifizierung dieses bestimmten zellulären Untergruppe in der Tumormasse ermöglichen. Auf der Basis dieser Merkmale, wie zum Beispiel eine erworbene Resistenz gegen Chemotherapie Mittel für die Überexpression des ATP-Bindungs - Cassette - multidrug - Efflux - Transporter 28, 32, 33, oder für die Aufregulation der Expression von Entgiftungsenzyme wie ALDH 32, die für die Expression zytotoxisch eines bestimmten Oberflächenmarker, wie beispielsweise CD133, CD44, CD34, CD90 und andere , 30, 34, 35, 41, verschiedene Methoden zu isolieren CSCs wurden 42-44 entwickelt. Eine dieser Techniken ist die Sphäre Bildungstest, der auf der Kapazität des CSCS beruht unter nicht-haftenden Bedingungen zu wachsen. Die Fähigkeit von Gewebestammzellen und KSZ Kugeln zu bilden wurde zuerst in Studien zur Identifizierung von neuralen Stammzellen von Reynolds et al. 37. Anschließend Gibbs et al. 38 used diese Studien zu isolieren CSCs von soliden Tumoren, insbesondere von Knochensarkomen zu beginnen. Wir haben beschlossen , von Gibbs et al illustriert die Kugelbildung Assay - Verfahren zu verwenden. CSCs von OSA - Zelllinien von herkömmlichen OS - Biopsien erhalten zu isolieren. Wir angepasst ist, die ursprüngliche Methode die Ergebnisse dieses Assays zu verbessern und die Reproduzierbarkeit für andere Krebszelllinien zu erleichtern. Mit Bezug auf die Errichtung der Kugel Bildungstest, überprüften wir, dass Plattierung 40.000 Zellen / Vertiefung eine gute Praxis ist für Zellen in Isolation zu Beginn des Tests beibehalten wird. Dieser Trick ist sehr wichtig, die Möglichkeit, dass die kugelförmigen Kolonien von zellulären Aggregation entstehen zu vermeiden und nicht von der besonderen und exklusiven Kapazität eines einzelnen CSC unter nicht-haftenden Bedingungen zu wachsen und eine sphärische Kolonie bilden. Diese Fähigkeit ist ein besonders kritischer Punkt dieses Assays. Wir bestätigt, dass auch eine gute Rate der Kugelbildung zu erhaltenIst es ausreichend, Aliquots von Wachstumsfaktoren alle 3 d und nicht jeden Tag zu aktualisieren, wie in der ursprünglichen Methode beschrieben. In dieser Studie haben wir auch und ausführlich beschrieben eine gute Methode, um die kugelförmigen Kolonien zu isolieren, wenn sie unter nicht-haftenden Bedingungen kultiviert, gebildet. Dieser Schritt ist in diesem Assay kritisch, weil es sehr wichtig ist, um zu versuchen, so viele der Kugeln wie möglich zu isolieren, ohne sie zu beschädigen in jeder Vertiefung gebildet sind. Es ist auch wichtig, dass nur die Kugeln und nicht die einzelnen Zellen zu isolieren, die in Suspension für die Dauer des Assays bleiben konnte. Um diese kritischen Punkte zu überwinden, haben wir eine besondere Isolationsmethode entwickelt, die, wie oben gezeigt, gute Ergebnisse für CSC Isolation gab. Offensichtlich gibt es die Möglichkeit, dass nicht alle Bereiche, die wiedergewonnen werden gebildet, aber die Verlustquote sehr gering ist. Tatsächlich haben wir auch die Möglichkeit, einen Filter mit 40 um Poren zu verwenden Sphären zu isolieren, nachdem sie groß werden (Formed etwa 100 bis 200 Zellen). Diese Trennung stoppt Kugelbildung, sondern erlaubt es, die einzelnen Zellen, ein Teil der Methylrest ist, und die kleinsten Kugeln gefiltert werden. Diese Eliminierung wird durch gründliche Filtration durchgeführt, wie in dem Protokoll beschrieben. Darüber hinaus ermöglicht die Auswahl der größten kugelförmigen Kolonien durch die 40 &amp; mgr; m mesh mit dem daraus folgenden Verlust der kleinsten kugelförmigen Kolonien eine CSCS mit der höchsten Kapazität auszuwählen kugelförmigen Kolonien zu bilden und mit größerer stemness. Alle diese Modifikationen wurden durchgeführt, den Test zu verbessern und CSCs helfen Forscher untersuchen die kritischste Schritt der ursprünglichen Methode der Kugelbildungstest zu verstehen und zu reproduzieren. Unter den Studien in vitro - Methoden in Bezug zur Isolierung von CSCs, diese Studie zu zeigen sollen , wie diese angepasst Kugel Bildungstest eine gute Methode zur Isolierung von CSCs könnte ausOSA-Zelllinien. Die Anpassungen der ursprünglichen Methode und der detaillierten Isolationstechnik beschrieben ihre Wirksamkeit zu verbessern. In kurzer Zeit kann eine gute Anzahl KSZ erhalten und für verschiedene Experimente verwendet werden. Daher ist es möglich, die stielartigen Phänotypen und insbesondere schnell bestätigen, das doppelten stielartigen Phänotyp zu untersuchen, die OS-KSZ charakterisiert. So könnte dieser modifizierte Test eine gute Technik für CSCs zu isolieren und ihre Biologie zu studieren. In der Zukunft, wobei dieses Verfahren mit zusätzlichen Anpassungen, auch verwendet werden können CSCs von anderen finite Krebszelllinien von Biopsien von seltenen soliden Tumoren erhalten, zu isolieren. Die Möglichkeit des CSCS aus seltenen soliden Tumoren, wie beispielsweise OS Isolierung ermöglicht nicht nur die Verbesserung der Studien über diese bestimmte Krebs, sondern erstreckt sich auch auf Untersuchungen von verschiedenen Arten von Krebs bessere Verfahren für ihre Isolierung zu entwickeln und auf zukünftige Studien der Biologie diese wichtige zelluläre Teilmenge. Daher ist, wie wirin dieser Studie gemacht haben, ist es wichtig, die Methoden der CSC Isolation durch das Studium der CSC Biologie, mit dem Endziel der Suche nach molekularen Ziele und die Entwicklung einer sehr spezifischen Anti-Krebs-Therapie gegen diese besondere zelluläre Teilmenge, die wahrscheinlich verantwortlich ist zu verbessern die Aufrechterhaltung des Primärtumors, die Entwicklung ihrer Wiederkehr, und der Ursprung von Metastasen in verschiedenen Organen. Die Studie von CSC Biologie ist auch wichtig für die Suche nach Therapien, die bei der Heilung von Krebs prägnanten sein könnte, wie OS, für die die Überlebensrate nach neoadjuvanter Behandlung bleibt sehr schlecht.

Sarkome sind eine heterogene Gruppe von seltenen malignen Tumoren Bindegewebe vorwiegend aus dem embryonalen Mesoderm 1 stammen. Die verschiedenen Typen sind Knochensarkomen und Weichteilsarkomen. Knochen-Sarkome, eine Gruppe von relativ selten Primärtumoren, bestehen aus mehreren Subtypen, einschließlich Osteosarkom (OS). OS, einem der am häufigsten Primärtumoren des Knochens, eine mesenchymale Malignität ist die umfangreiche klinische, histologische zeigt und molekulare Heterogenitäten 2, 3. Leider OS tritt vorwiegend bei Kindern und jungen Erwachsenen 4, 5 und repräsentiert 60% die gemeinsamen histologischen Subtypen von Knochensarkomen in der Kindheit 6, 7. OS betrifft in der Regel die Skelettbereiche, die durch schnelles Knochenwachstum gekennzeichnet sind (zB die Metaphyse der langen Röhrenknochen). Unter den histologisch verschiedenen Subtypen von OS, konventionellen OS, auch Mark oder Zentral OS genannt wird, hat einen hohen Grad der Bösartigkeit und eine Quote share von 80% 8. Diese 80% von 60% herkömmlichen Osteoblasten - OS besteht, 10% chondroblastische OS und 10% fibroblastic OS 6, 8-10. Andere OS-Subtypen gehören anaplastic, teleangiektatischen, Riesenzellreiche und kleine Zelle OS. Trotz der Fortschritte in kombinierten Operation und Chemotherapie in OS Management, bleibt das Ergebnis schlecht, mit einem langfristigen Überlebensrate von 65-70% bei Patienten ohne Metastasen 11, 12. Distant häufig Rezidive als pulmonale Metastasen auftreten , oder, weniger oft, als Metastasen zu den entfernten Knochen und lokale Rezidive 13. Metastasen sind oft resistent gegen herkömmliche Behandlungen. Dieser Widerstand ist der Grund , warum die 10-jährige krankheitsfreie Überleben bei 14 Diagnose etwa 30% bei Patienten mit metastasierten Erkrankung ist, 15. Wie bei normalem Gewebe wird Krebsgewebe einer heterogenen Sammlung von Zelltypen zusammen. Zellen innerhalb des Tumors scheint zu verschiedenen Stadien der Entwicklung zu entsprechen. Innerhalb eines nOrmal Gewebe besteht mit der Fähigkeit, eine Subpopulation von Zellen zu selfrenew, also Vorläufern und reifen Zellen für Gewebshomöostase bereitstellt. In ähnlicher Weise wird Krebs einer ähnlichen heterogene Population von Zellen zusammengesetzt in verschiedenen Stadien der Entwicklung, mit unterschiedlichen Graden der Proliferation und tumorigene Potenzial. Eine Untergruppe dieser Krebszellen, bezeichnet als Krebsstammzellen (KSZ), ein Reservoir von selbsttragenden Zellen mit dem exklusiven Fähigkeit , das maligne Potential von Tumoren selfrenew und aufrechtzuerhalten bildet, wodurch die verschiedenen Zelllinien zu erzeugen, die die Tumormasse 16 bilden. In den 1990er Jahren, Studien über die akute myeloische Leukämie lieferte die erste zwingende Beweise für die Existenz von CSC Subpopulationen 17, 18. CSCs seit aus einer großen Anzahl von soliden Tumoren 19, um dadurch zu einem der am besten erforschten Themen in der Krebsforschung isoliert. CSCs können von normalen Stammzellen durch Mutationen in Genen entstehen in der Tat, dass die normale machenStammzellen Krebs 20-23. Mehrere Transformation Mutationen und Interaktionen mit der Mikroumgebung könnte auch zu einer gesunden Vorläufern und reifen Zellen dazu beitragen, die Selbsterneuerung Kapazität und Unsterblichkeit zu erwerben, die CSCs typisieren. Es gibt mehrere Hypothesen über diese Transformation. Gesunde Vorläufern, gesund reifen Zellen und Krebszellen, entdifferenzieren auf Stammzellen, einen stielartigen Phänotyp durch die Aktivierung Selbsterneuerung-assoziierten Gene zu erhalten 24-28. Trotz mehreren neueren Studien haben die Ursprünge von CSCs noch entdeckt werden. Ein besonderes Merkmal von CSCs ist, dass ihre Fähigkeit, die Multi-Therapieansatz zu widerstehen, die der kombinierten Operation und Chemotherapie mit verschiedenen Medikamenten besteht. Jüngste Studien haben gezeigt, dass auch CSCs Resistenz erwerben können Chemotherapeutika zu zytotoxisch. Mögliche Erklärungen für diesen Widerstand umfassen die Überexpression von ATP-bindenden Kassette (ABC) Multidrug - Transporter (dhMDR1 und BCRP1) Überexpression von Chemotherapie - metabolisierenden Enzymen wie Aldehyd - Dehydrogenase 1 (ALDH1) und / oder Änderungen in Zellzykluskinetik 30-33. Die direkte Folge all dieser Konzepte, die bisher beschrieben worden sind, ist, dass eine Krebstherapie nur dann effizient sein würde, wenn der CSC-Subpopulation vollständig eliminiert wurden, während ein lokales Rezidiv oder Fernmetastasen auftreten könnte, wenn auch nur ein einziger CSC überlebt. Die Entdeckung von CSCs in menschlichen Sarkomen 34, insbesondere OS 35 oder in irgendwelchen anderen Knochen und Weichgewebe Krebs, hat eine große klinische Bedeutung , weil es eine mögliche Erklärung bietet, warum viele Behandlungen scheinen wirksam zunächst zu sein, aber die Patienten später Rückfall. Deshalb ist die Hoffnung für die Zukunft Kampf gegen konventionelle OS neue und spezifische zielgerichtete Therapien zu finden basiert auf der Entwicklung innovativer Arzneimittel auf OS-CSCs dank der molekularen Charakterisierung dieser Unter gerichtetBevölkerung und dem Studium der CSC Biologie. Im Jahr 1992, Reynolds und Kollegen, die untersuchten , ob eine Teilmenge von Stammzellen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren vorhanden war, eine Methode entwickelt , Zellen zu isolieren Verdacht 36, stielartigen Zellen 37 zu sein. Diese Methode basiert auf der besonderen Fähigkeit der Diese Zellen kugelförmigen Kolonien zu bilden, wenn sie unter nicht-adhärenten Bedingungen gezüchtet. Ähnliche Techniken wurden von Gibbs und Kollegen im Jahr 2005 beschäftigt 38 eine Subpopulation von stielartigen Zellen in Knochen - Sarkome zu studieren. Zu isolieren und OS-KSZ aus primären Zellkulturen von verschiedenen Arten von herkömmlichen OS charakterisieren, haben wir uns entschlossen, diese Technik für die OS-Zelllinien anzupassen. Hier beschreiben wir diese angepasst Verfahren der Kugelbildungstest, genannt &quot;sarcosphere assay&quot;, die verwendet werden können OS-KSZ aus finite primären Zelllinien von humanen Biopsien herkömmlicher OS abgeleitet zu isolieren. Wir beschreiben auch alle Techniken uSed die stielartigen CSC Phänotyp der Zelllinien durch diesen Test isoliert zu validieren: 1) Bewertung der Expression von Genen, die pluripotenten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) und der CD133-Gens zu charakterisieren, die eine Markierung des CSCS ist; 2) Kolonie-bildenden Einheit (CFU) -Assay; 3) Bewertung der Fähigkeit dieser Zellen in Osteoblasten und Adipozyten unter geeigneten Differenzierungsbedingungen zu unterscheiden; 4) Untersuchung der Oberflächenmarker von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) (dh CD44, CD105 und Stro-1) durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie - Analyse; 5) Bewertung der ALDH Aktivität dieser Zellen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Ca2+ und Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Schweinetrypsin 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration:</td></tr><tr><td>Pulver-Kollagenase aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Lösungsmittel: Pufferlösung, pH 7,4. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Nährstoffgemisch F-12 Schinken</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Lösungsmittel: Hochreines dH2O. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>2-Phospho-L-Ascorbinsäure Trinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration: 5 mg/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Glycerinphosphat-Dinatriumsalz-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: 1 M</td></tr><tr><td>Insulin. Rekombinantes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>Lösungsmittel: NaOH 0,1 M. Stammkonzentration: 10 mM</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Lösungsmittel: DMSO. Stammkonzentration: 500 mM</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Lösungsmittel: DMSO. Stammkonzentration: 200 mM</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Lösungsmittel: DMSO. Bestandskonzentration:&nbsp; 1 mM / 100 &micro;M. In flüssigem Stickstoff lagern, um die biologische Aktivität zu erhalten</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum Südamerika&nbsp;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10.000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Lösungsmittel: Ultrareines dH2O. Stammkonzentration: 2%</td></tr><tr><td>Putrescein-Dihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Lösungsmittel: Ultrareines dH2O. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration: 25 mg/ml</td></tr><tr><td>humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Lösungsmittel: DPBS pH 7,4. Bestandskonzentration: 10 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basischer humaner</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Lösungsmittel: DPBS + 0,2 % BSA. Bestandskonzentration: 25 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Selensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration: 30 mM</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Lösungsmittel: ETOH. Stammkonzentration: 10 mM</td></tr><tr><td>Toluidinblau O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Lösungsmittel: Hochreines dH2O. Stoffkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Öl Rot O</td><td>ICN Biochemikalien</td><td>155984</td><td>Lösungsmittel: 2-Propanol. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Naphtol AS-MX Phosphat Dinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Lösungsmittel: DMSO. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Fast Blue BB Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Lösungsmittel: Tris HCL, pH 9,0. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Lösungsmittel: Tris HCL, pH 9,1. Stammkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, Fraktion V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Stammkonzentration: 2%</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>ICN Biochemikalien</td><td>100375</td><td>Lösungsmittel: Hochreines dH2O. Stoffkonzentration: Pulver</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: 0,2 %. Gefahr - Nur unter der Chemikalienhaube</td></tr><tr><td>verwenden Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Lösungsmittel: DPBS . Bestandskonzentration: 200 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Gefahr - Nur unter chemischer Haube</td></tr><tr><td>verwenden Ab-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Maus monoklonal [SN6] zu CD105 (FITC)</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Flüssigkeit. Anwendung:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Durchflusszytometrie (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>AB-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Maus monoklonal&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [F10-44-2] bis CD44 (PE/Cy7&reg;) )</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>Flüssigkeit. Anwendung:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Durchflusszytometrie (Durchflusszytometrie)</td></tr><tr><td>AB-CD45&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Maus monoklonal&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; [MEM-28] bis CD45 (PerCP))&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>Flüssigkeit. Anwendung:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Durchflusszytometrie (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>AB-CD105&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Humaner CD105-aufgereinigter Antikörper)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung: Immunfluoreszenzfärbung (IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anti-CD44-Antikörper)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung: Immunfluoreszenzfärbung (IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Maus Anti-STRO-1)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Durchflusszytometrie (Flow Cyt) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Immunfluoreszenz-Färbung (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Anti-Kaninchen-IgG (Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen-IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung: Immunfluoreszenzfärbung (IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus IG (FITC-Kaninchen Anti Maus IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Durchflusszytometrie (Flow Cyt) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Immunfluoreszenzfärbung (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>Lösungsmittel: DPBS. Bestandskonzentration: Lyophilisiert. Anwendung: Immunfluoreszenzfärbung (IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade; Laufpuffer MACS Trennpuffer</td><td>Miltenyi</td><td>130,091,221</td><td>Flüssigkeit. Bei 4 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg; Lysereagenz</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Gefahr - Nur unter chemischer Haube verwenden</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Reverse Transkriptionskit</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorophorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Flüssigkeit. Gefahr - Nur unter chemischer Haube verwenden</td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Chemikalien-Haube</td><td>ARREDI TECNICI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Villa</td><td>Modello&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DYNAMICA</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokale Laserscanning-Mikroskopie LSM 5109 Meta&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>iCycler PCR Thermalcycler&nbsp;</td><td>BIORAD_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>CyFlow&reg; RAUM&nbsp;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop Axiovert 200M&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Gefrierbehälter ,</td><td>Nalgene</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Original Pipet-Aid</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>EPPENDORF</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette</td><td>SIGMA_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3&Handel; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>PERKIN ELMER_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Konische Rohre&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (15 und 50 mL) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>352096 (für 15 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 352070 (für 50 mL)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem Flachboden und TC-behandelter</td> BD <td>FALCON</td><td>353047</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>6-Well-Multiwell-Platten mit klarem Flachboden und extrem niedrigem Aufsatz</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (5 und 10 mL) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>357543 (für 5 mL)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 357551 (für 10 ml)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Spritze (5 ml) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischale 100X20 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>R&ouml; hren Rohre&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (3,5 mL, 55x12mm, PS) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>55.484</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischale 60X15 mm&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353004</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen 1,5 mL&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen 25 cm&sup2; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BD FALCON</td><td>353014</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon-Netzfilter, hydrophil</td><td>MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex Filterhalter</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Perry Pinzette&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Lanzette</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Dounce</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

gründung der krebszellkulturen von human konventionelle osteosarkom stem

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Die aktuellen Verbesserungen in der Therapie gegen Osteosarkom (OS) haben das Leben von Krebspatienten verlängert, aber die Überlebensrate von fünf Jahren bleibt schlecht, wenn Metastasen aufgetreten ist. Die Krebsstammzellen (CSC) Theorie besagt, dass es eine Untergruppe von Tumorzellen innerhalb des Tumors, die stielartigen Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit, den Tumor zu erhalten und multidrug-Chemotherapie zu widerstehen. Daher ist ein besseres Verständnis der OS Biologie und Pathogenese erforderlich, um die Entwicklung von gezielten Therapien voranzutreiben diese besondere Untergruppe zu beseitigen und die Morbidität und Mortalität bei Patienten zu reduzieren. CSCs Trenn-, Gründung Zellkulturen von CSCs, und das Studium ihrer Biologie sind wichtige Schritte, um unser Verständnis von OS Biologie und Pathogenese zu verbessern. Die Einrichtung von Menschen stamm OS-CSCs aus Biopsien von OS wurde mehrere Methoden möglich verwenden, einschließlich der Fähigkeit zu schaffen 3-dimensionalen Stammzellkulturen unter nonadherent Bedingungen. Unter diesen Bedingungen können die CSCS kugelförmige Schwimm Kolonien durch Tochterstammzellen gebildet zu schaffen; Diese Kolonien werden &quot;Zellkugeln&quot; bezeichnet. Hier beschreiben wir eine Methode, um CSC Kulturen aus primären Zellkulturen von herkömmlichen OS etablieren aus OS-Biopsien erhalten. Wir beschreiben eindeutig die verschiedenen Passagen erforderlich, um CSCs zu isolieren und zu charakterisieren.

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (KSZ) in Knochensarkomen kürzlich ihrer Pathogenese in Verbindung gebracht worden. In diesem Artikel stellen wir die Isolierung des CSCS aus primären Zellkulturen aus humanen Biopsien herkömmlicher Osteosarkom (OS) mit der Fähigkeit des CSCS erhalten unter nichtadhärenten Bedingungen zu wachsen.

Gründung der Krebszellkulturen von Human Konventionelle Osteosarkom Stem

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Das übergeordnete Ziel dieses Essays besteht darin, Krebsstammzellen aus einer begrenzten Zelllinie zu isolieren, die aus menschlichen Osteosarkomen gewonnen wurde. Der Hauptvorteil dieser Arbeit liegt darin, anderen Forschern auf dem Gebiet der Onkologie klar aufzuzeigen, wie man Krebsstammzellen in vitro isoliert. Anschließend können diese Zellen zur Erforschung von Therapien gegen Osteosarkome und andere solide Tumore verwendet werden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in diesem Bereich sind, Schwierigkeiten haben, wenn sie nicht wissen, wie man die Sarkomkolonien isoliert. Eine visuelle Demonstration ist entscheidend, da der Isolierungsschritt schwer nachvollziehbar und zu verstehen ist. Wir hatten die Idee zu dieser Technik erstmals, als wir über den Sphere-Bildungs-Test gelesen hatten.Beschrieben von Gypsum und Mitarbeitern. Den Ablauf demonstrieren Dr. Gaia Palmini, eine Doktorandin, und Dr. Roberto Zonefrati, ein Techniker aus meinem Labor. Zunächst bereiten Sie alle erforderlichen Kulturmedien vor.Verdauungspuffer und andere Lösungen, die für das Verfahren benötigt werden. Danach wird eine begrenzte Osteosarkom-Zelllinie etabliert, indem Osteosarkom aus einer gesicherten Nadel- oder Operationsbiopsie isoliert und die gewonnenen Zellen wie im begleitenden Textartikel beschrieben unterkultiviert werden.Nachdem die Osteosarkom-Zellkultur etabliert wurde und die Platte nahezu konfluent ist, entfernen Sie das Medium durch Aspiration und behandeln die Zellen mit Trypsin, um sie von der Platte zu lösen. Überführen Sie die Zellen in ein frisches Reagenzglas und pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf und ab, um eventuelle Zellklumpen aufzulösen.Sammeln Sie anschließend zehn Mikroliter der Zellsuspension und überführen Sie diese in eine Zählkammer für das Hämozytometer. Platzieren Sie die Zählkammer unter einem Phasenkontrastmikroskop und ermitteln Sie die Zellkonzentration in der Suspension. Geben Sie danach 280.000 Zellen zu 35 Milliliter Sarkosphären-Wachstumsmedium, das Methocellulose enthält, und mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette, um eventuelle Zellklumpen zu verteilen.Übertragen Sie fünf Milliliter der Zellmischung in jede Vertiefung von sechs-Loch-Platten mit ultra niedriger Anhaftung. Nach dem Ansäen beobachten Sie mithilfe eines invertierten Mikroskops das Erscheinungsbild der Zellen und ob sie gut isoliert sind. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C, 5 % Kohlendioxid enthaltenden Inkubator.Fügen Sie alle drei Tage frische Alkoholate von beta FGF und EGF in jede Mulde hinzu, um die Konzentration der Wachstumsfaktoren aufzufrischen. Überprüfen Sie den Fortschritt des Sarkosphären-Assays, indem Sie die Zellen am Mikroskop an den Tagen sieben, 14, 20, 21 und 28 untersuchen. Sobald Sie das Vorhandensein großer schwarzer Sarkosphären beobachten, die sich alle in der Mitte der Mulde befinden, beenden Sie die Kultur und beginnen Sie den Desolationsprozess.Wenn es Zeit ist, das Sarkosphäre zu isolieren, verwenden Sie eine sterile 1.000-Mikroliter-Pipette, um das Medium, das die Sarkosphären enthält, in eine Spritze mit einem sterilen Membranfilterhalter zu überführen. Nachdem das Medium mit den Sarkosphären vollständig entfernt wurde, geben Sie fünf Milliliter Wachstumsmedium in die Vertiefung und spülen Sie diese gründlich aus, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Sphären gesammelt werden.Verwenden Sie dann ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob alle Sarkosphären gewonnen wurden. Falls nicht, spülen Sie die Vertiefung erneut, bis die Sammlung der Sphären vollständig ist. Danach filtrieren Sie die Suspension durch den Membranfilterhalter unter Schwerkraft, um die Sphären nicht zu beschädigen, und stellen Sie sicher, dass keine Sarkosphären den Filter passieren.Während dieses Vorgangs entfernen Sie Luftblasen vorsichtig mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette. Nachdem alle Sarkosphären filtriert wurden, spülen Sie die Filtrationseinheit, indem Sie zehn Milliliter Wachstumsmedium direkt in die Spritze geben und es ohne Druck filtrieren lassen, um sicherzustellen, dass einzelne Zellen entfernt werden. Sobald die Suspension der Sarkosphären filtriert ist, muss das Filtrat verworfen werden, und es ist besondere Sorgfalt auf die Rückgewinnung der Sarkosphären zu legen, die sich im Netzfilter verfangen haben.Zu diesem Zeitpunkt wird die Filtereinheit demontiert, indem sie von der Spritze entfernt und in eine 100 Millimeter große Petrischale gegeben wird. Der Netzfilter wird mithilfe eines sterilen Pinzettenpaares aus dem Membranfilterhalter entfernt.Und überführen Sie den Filter in eine neue 60-Millimeter-Petrischale. Anschließend spülen Sie den Netzfilter durch vorsichtiges Schütteln. Geben Sie dabei fünf Milliliter Wachstumsmedium hinzu, um die Sarkosphären aus dem Gewirr der Membran freizusetzen.Als Nächstes die Membran in eine Vertiefung geben und mikroskopisch überprüfen, ob sich keine Kugeln mehr in der Membran verfangen haben. Die Membran erneut waschen und anschließend unter dem Mikroskop erneut kontrollieren, falls sich noch immer Kugeln in der Membran verfangen haben. Wenn keine Kugeln mehr in der Membran verbleiben, inkubieren Sie diese in Wachstumsmedium, um die Sarkosphären zu einer Einzelschicht heranzuzüchten.Überwachen Sie das Wachstum der Osteosarkom-Krebsstammzellen, die aus den Sarkosphären gewonnen werden, bis die Zellen in einer 60-Millimeter-Petri-Schale eine Konfluenz von etwa 90 % erreichen. Zusätzlich zu den zahlreichen hier beschriebenen Standardprotokollen sind im begleitenden Textprotokoll ausführliche Angaben zu Methoden zur Beurteilung der Differenzierungskapazität, der ALDH-Aktivität, der Durchflusszytometrie, der Immunfluoreszenz und der RT-PCR-Analyse enthalten.Osteosarkomproben werden durch Nadelaspiration oder chirurgische Überschneidung gewonnen. Bei sachgemäßer Behandlung benötigen die Primärkulturen etwa einen Monat, um Konfluenz in einer 100 Millimeter Petrischale zu erreichen. Nach der Ausweitung werden die Zellen in sechs-Loch-Platten mit ultraniedriger Anhaftung ausgesät, um den Sarkosphären-Assay zu beginnen.Diese Platte hält die Zellen in einem suspendierten Zustand und verhindert die Anheftung an das Substrat. Nach sieben Tagen werden mehrere kleine, von Einzelzellen umgebene, kugelförmige Kolonien beobachtet. Nach 28 Tagen sind mehrere große Sarkosphären zu sehen.Nachdem die kugelförmigen Kolonien isoliert wurden, können stammzellähnliche Krebszellen aus einzelnen Sarkosphären erweitert werden, indem sie auf normale Anheftungsplatten gegeben werden. Die immunfluoreszenten Färbungen zeigten ein mesenchymales Stammzell-ähnliches Phänotyp, da die expandierten Zellen positiv für CD44 und CD105 sowie mäßig positiv für Stro-1 waren. Die RT-PCR zeigte ebenfalls positiv das Embryonalstammzell-Phänotyp durch die Expression von drei embryonalen Stammzell-Marker-Genen.Nanog, Oct3/4 und Sox2 sowie das CD133-Gen, ein Marker für osteosarkomartige Krebsstammzellen. Die detaillierte Isolationsmethode, die wir in diesem Video gezeigt haben, wird anderen Forschern den Weg ebnen, Krebsstammzellen zu untersuchen, indem sie ihnen zeigt, wie sie die kritischsten Schritte des Sphärenbildungs-Assays verstehen und reproduzieren können.Dieser modifizierte Assay ist eine geeignete Technik zur Isolierung von Krebsstammzellen und zur Untersuchung ihrer Biologie. Dieses Verfahren kann mit zusätzlichen Anpassungen ebenfalls zur Isolierung von Krebsstammzellen aus anderen begrenzten Krebszelllinien verwendet werden, die durch Biopsien von soliden Tumoren gewonnen wurden.Zusammenfassend ermöglicht die Isolierung von Krebsstammzellen aus verschiedenen Tumorarten die Untersuchung ihrer Biologie mit dem langfristigen Ziel, molekulare Zielstrukturen zu identifizieren und hochspezifische Antikrebstherapien zu entwickeln, die gegen bestimmte zelluläre Subpopulationen gerichtet sind.

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