Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus porcinen subkutanen weißen Fettgeweben stammende Stammzellen zu isolieren, um ihre Fähigkeit zur Differenzierung in mesenchymale Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Adipositas-Forschung zu beantworten. Sie ist ein geeignetes Werkzeug, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die an der Regulation der Entwicklung von Fettgewebe beteiligt sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine große Anzahl von stromavaskulären Zellen gewonnen werden kann, was eine detaillierte Analyse der Adipozyten-Differenzierung und -Biologie ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik liegt im Bereich der Stammzelltherapieforschung, da aus Schweinefettgewebe stammende Stammzellen multipotent sind und in mehrere Zelllinien transdifferenzieren können. Legen Sie das Ferkel zunächst in Bauchlage auf einen sauberen Operationstisch.

Rasieren Sie das gesamte Fell entlang der Mittellinie vom Nacken bis zum Schwanz ab und desinfizieren Sie die dorsale Haut dreimal mit 7,5 % Povidon-Iod. Nach dem dritten Desinfektionsgang lassen Sie das Povidon-Iod etwa 10 Minuten lang auf der Hautoberfläche einwirken. Anschließend besprühen Sie die Haut mit 70 % Ethanol.

Und verwenden Sie mit Ethanol getränkte Mullkompressen, um die Haut in eine Richtung abzuwischen, um das Desinfektionsmittel zu entfernen, bis keine offensichtliche Färbung mehr zu erkennen ist. Als Nächstes führen Sie einen Schnitt vom Halsbereich bis zum Bein durch. Heben Sie dann Fett und Haut mit einer Pinzette an und trennen Sie mit einem Skalpell die dorsale Fettschicht aus subkutanem Fettgewebe und die angrenzende Hautschicht von den Muskeln.

Das Haut- und Fettgewebe sofort in einen sterilisierten 200-Milliliter-Becher eintauchen, der serumfreies DMEM mit einer Temperatur von 37 °C enthält, und die Außenseite des Bechers mit 70 %igem Ethanol besprühen. Anschließend den Becher in eine laminare Luftströmungs-Werkbank stellen und eine sterilisierte, dreilagige Folienabdeckung der Größe 40 × 30 cm neben den Becher legen. Das Gewebe mit der Hautseite nach unten auf die Folie überführen.

Verwenden Sie Pinzette und Schere, um das verbleibende Muskelgewebe vom Fettgewebe zu entfernen. Schneiden Sie das Fett in quadratische Stücke von 7 mal 7 Zentimeter und überführen Sie die Fettstücke anschließend in einen neuen sterilisierten 200-Milliliter-Becher, der serumfreies DMEM mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius enthält. Platzieren Sie nun einen speziell angefertigten Scheibenhalter, ausgestattet mit einer Schneidklinge aus Kohlenstoffstahl, auf die Abdeckfolie und legen Sie eines der Fettstücke mit der Fettseite nach unten auf den Schneideapparat.

Schneiden Sie das Fett in etwa 1 Millimeter dicke Stücke, die so nah wie möglich an der Haut liegen, ohne diese jedoch zu verletzen. Anschließend zerkleinern Sie die Fettgewebestücke mit einer Schere so fein wie möglich und geben sie in einen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben, der mit einem gefilterten Verdauungsmedium ergänzt um Kollagenase gefüllt ist. Inkubieren Sie den Kolben unter Schwenken 90 Minuten lang bei 45 U/min in einem Rüttelinkubator bei 37 Grad Celsius.

Wenn das Verdauungsmedium zu einer Suspension wird, ohne nennenswerte Gewebeklumpen, beenden Sie die Verdauung durch Zugabe eines gleichen Volumens Kulturmedium, das DMEM F-12 mit 10 % FBS enthält. Um die aus Schweinefettgewebe stammenden Stammzellen zu gewinnen, filtrieren Sie die verdauten Fettgewebesuspension durch eine einzelne Schicht Chiffon in eine sterilisierte 250-Milliliter-serologische Flasche, wobei Sie mit einer Pinzette die Mitte der Chiffonlage niederschlagen, um den Durchtritt des Verdauungsansatzes zu lenken und zu unterstützen. Lassen Sie die Flüssigkeit ablaufen und drehen Sie die Chiffonlage mit der Pinzette, um den Durchtritt vollständig abzuschließen, und verteilen Sie das Medium auf vier 50-Milliliter-Kegelzentrifugenröhrchen.

Sammeln Sie die stromavaskulären Zellen durch Zentrifugation. Danach entfernen Sie das Überstandsmaterial, ohne die Pellets zu stören, um den größten Teil der oberen Fettschicht, die reife Adipozyten enthält, zu eliminieren. Anschließend resuspendieren Sie die Pellets durch Pipettieren und vorsichtiges Schütteln in 10 Milliliter DMEM.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie die Pellets in 10 Milliliter ACK-Lysepuffer. Nach sieben Minuten bei Raumtemperatur beenden Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch Zugabe von 10 Milliliter DMEM zu jedem Reagenzglas und schütteln die Röhrchen vorsichtig, um sie zu mischen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen erneut.

Waschen Sie die Zellen zwei weitere Male mit 10 Milliliter DMEM und sammeln Sie anschließend die Überstände über einen 100-Mikron-Sieb in einem einzelnen 50-Milliliter-Konischglas. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und zählen Sie die Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss. Schließlich säen Sie die adipogenen Stammzellen des Schweins mit einer Dichte von 6 × 10⁴ pro Quadratzentimeter in den entsprechend dimensionierten Kulturgefäß in Zellkulturmedium aus.

Die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren, um die Bildung einer Monolayer zu fördern. Die Morphologie der aus dem stromavaskulären Kompartiment gewonnenen, fettgewebsstämmigen Stammzellen des Schweins ähnelt der von fettgewebsstämmigen Stammzellen der Maus oder des Menschen, wobei 24 Stunden nach der Aussaat eine ausgedehnte, glasfasernähnliche Morphologie beobachtet wird. Die fettgewebsstämmigen Stammzellen des Schweins erreichen innerhalb von 72 Stunden Konfluenz und sind dann bereit für die Differenzierung in Adipozyten oder andere mesenchymale Zelltypen.

Diese Zellen weisen nach chemischer Induktion ebenfalls ein starkes adipogenes Potenzial auf, und reife Adipozyten können bereits nach neun Tagen Differenzierung beobachtet werden, wobei über 90 % der adiposengewebespezifischen Stammzellen aus dem Schwein eine adipogene Differenzierung zeigen. Oberflächenmarker mesenchymaler Stammzellen wie CD 29, CD 44, CD 90 und MHC 1 sind auf den adiposengewebespezifischen Stammzellen aus dem Schwein stark exprimiert, während CD 4a, CD 31, CD 45 und MHC II kaum nachweisbar sind, was zeigt, dass diese adiposengewebespezifischen Stammzellen mesenchymalen Typs Merkmale aufweisen, ohne nennenswerte Kontamination mit endothelialen oder hämatopoetischen Stammzellen aufzuweisen. Zudem können die differenzierten adiposengewebespezifischen Stammzellen aus dem Schwein mittels spezifischer Gewebefärbeverfahren als Adipozyten, Osteozyten oder Chondrozyten identifiziert werden, was belegt, dass diese aus dem stromavaskulären Fraktion stammenden Zellen eine Multipotenz aufweisen, die typisch für mesenchymale Vorläuferzellen ist.

Während dieses Verfahrens ist es wichtig, eine gute aseptische Technik für die Zellkultur anzuwenden und alle Schritte so schnell wie möglich durchzuführen, um die Zellviabilität zu maximieren. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, können die Zellen innerhalb von sechs Stunden von zwei bis drei Schweinen gewonnen werden, sofern das Verfahren korrekt durchgeführt wird.

Diese Standardtechnik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes den Weg, um molekulare Schalter wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die die Differenzierung von Adipozyten steuern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus Schweinefettgewebe stammende Stammzellen isoliert und die pluripotente Fähigkeit dieser Zellen zur Differenzierung in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten bewertet.