Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1 ^Hoch Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Sca1-positive mesenchymale Stammzellen aus verschiedenen Fettpolstern der Maus zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Verwendung der immunmagnetischen Kügelchen-basierten Zellsortierung aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus verschiedenen Fettdepots für spätere Experimente effektiv angereichert werden können. Im Allgemeinen werden Forscher, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Stärke und Dauer der Kollagenase-vermittelten Gewebeverdauung optimiert werden sollte, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Sortierung zu erhalten.

Um die subkutanen Fettpolster zu isolieren, legen Sie die Maus zunächst in Rückenlage auf ein Schaumstoff-Präparierbrett und besprühen Sie das Tier mit 70 % Ethanol. Nachdem du die Pfoten am Brett befestigt hast, machst du einen kleinen Schnitt in die Haut des Unterbauchs. Fassen Sie dann die Oberseite des Schnitts mit einer Pinzette an und trennen Sie mit einer Schere die Haut und das Bauchfell vom Bauch zum Brustkorb.

Seitliche Schnitte in der Haut entlang der Körperseite reflektieren die Haut vom Bauchfell weg in Richtung Kopf. Ziehen Sie dann die restliche Haut zurück, halten Sie das Leistenfett vom Körper fern und befestigen Sie die Haut mit 22-Gauge-Nadeln an der Platte. Fassen Sie dann mit der Pinzette ein Leistenfettpolster an seinem Ursprung in der Nähe des Peritoneums und schneiden Sie mit einer feinen Schere zwischen Haut und Leistenfett hindurch, wobei Sie in Richtung Leistengegend vordringen und vermeiden, dass das subkutane Fettpolster mit der Haut kontaminiert wird.

Legen Sie dann das isolierte Leistenfettpolster in eine SQ-markierte 60-Millimeter-Schale mit 37 Grad Celsius Nährmedium und entnehmen Sie das Leistenfettpolster auf die gleiche Weise von der anderen Seite des Tieres. Um die viszeralen Fettpolster zu isolieren, schneiden Sie das Bauchfell, um die viszeralen Fettpolster und den Darm freizulegen. Schieben Sie dann den Darm zur Seite, in Richtung Thorax.

Fassen Sie das viszerale Fettpolster am distalen Ende, ziehen Sie es vorsichtig nach oben und präparieren Sie es, wobei Sie darauf achten, das Nebenhodengewebe auszuschließen. Legen Sie dann das Fettpolster in eine VIS-markierte 60-Millimeter-Schale mit 37 Grad Celsius Nährmedium. Wenn alle Fettpolster gesammelt sind, geben Sie die Schalen in eine Gewebekulturhaube und saugen Sie das Medium an.

Verwenden Sie eine gebogene Schere, um die Ballen zu zerkleinern. Geben Sie dann die Fettstücke in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen mit frisch zubereiteter Kollagenase. Schütteln Sie anschließend die Röhrchen bei 300 U/min und 37 Grad Celsius für 10 bis 20 Minuten, bis das Gewebe verdaut ist.

Einige Stücke von subkutanem Fettpolstergewebe können noch sichtbar sein. Geben Sie 20 Milliliter Nährmedium in die Kollagenaselösung, um die Verdauung zu stoppen, und verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um die Gewebeaufschlämmung 10 Mal zu aspirieren und abzugeben, um das verdaute Gewebe vollständig zu dissoziieren. Filtern Sie die Zellen durch 100-Mikron-Zellsiebe und zentrifugieren Sie das Gewebe.

Dekantieren Sie dann das Medium vorsichtig, achten Sie darauf, die Pellets nicht zu stören, und resuspendieren Sie beide Zellgruppen vorsichtig in fünf Millilitern sterilem Wasser. Warten Sie zwei Minuten, bis die Erythrozyten lysiert sind. Stoppen Sie dann die Reaktion in jedem Röhrchen mit 25 Millilitern Medium, das mit FBS versetzt ist.

Filtern Sie beide Adipozytenpopulationen durch neue 100-Mikron-Zellsiebe, schleudern Sie sie wieder herunter und resuspendieren Sie die Pellets dann in ein bis drei Millilitern Medium. Nach dem Zählen durch Trypanblau-Ausschluss wird eins mal zehn separat auf die sechste subkutane Fettpolsterzelle und die viszeralen Zellen in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Zellkulturplatte platte. Nachdem Sie die Zellen trypsinisiert haben, verdünnen Sie das Trypsin mit einem Milliliter Trennpuffer und zentrifugieren Sie dann die Kulturplatten.

Wir suspendieren die Zellen in 500 Mikrolitern pro Röhrchen Trennpuffer und zentrifugieren die Zellen erneut. Resuspendieren Sie nun die Zellen in 90 Mikrolitern pro Röhrchen Trennpuffer und mischen Sie 10 Mikroliter anti-Sca1 FITC-Primärantikörper in die Zellsuspension. Nach 10 Minuten Inkubation bei vier Grad Celsius im Dunkeln waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Trennpuffer pro Röhrchen.

Nach dem Schleudern werden die Zellen in 80 Mikrolitern Trennpuffer pro Zellsuspension resuspendiert. Mischen Sie dann 20 Mikroliter Anti-FITC-Mikrokügelchen in jede Vertiefung und stellen Sie die Platten bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang lichtgeschützt. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in einem Milliliter Trennpuffer und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern frischem Puffer pro Röhrchen.

Setzen Sie nun eine Säule in den Magnethalter ein und spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern Trennpuffer aus. Übertragen Sie die Zellen aus der subkutanen Fettpad-Gewebekultur auf die Säule, achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, und sammeln Sie die unmarkierten Sca1-negativen Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn alle Zellen durchlaufen sind, waschen Sie die Säule dreimal mit 500 Mikrolitern Trennpuffer

Übertragen Sie dann die Säule vom Magneten in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie einen Milliliter frischen Trennpuffer durch die Säule, um die Sca1-positiven Zellen zu eluieren. Zum Schluss werden sowohl die positiven als auch die negativen Sca1-Zellfraktionen heruntergeschleudert und die Pellets in einem Milliliter Kulturmedium resuspendiert. Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen in jeder Fraktion und plattieren Sie die Fraktionen in einzelnen Vertiefungen einer neuen Sechs-Well-Zellkulturplatte.

Vaskuläre Stromazellen, die aus subkutanem Fett isoliert wurden, weisen unabhängig von ihrem Sca1-Expressionsniveau eine fibroblastenähnliche, gestreckte Zellform auf. Wie subkutane Sca1-Hochzellen aus Leistenfett weisen viszerale Nebenhodenfett-abgeleitete Sca1-Hochzellen eine gestreckte Fibroblasten-ähnliche Zellform auf. Während VIS Sca1-Zellen eine epithelioide Form aufweisen.

Sca1-hohe Zellen, die aus isolierten Sca1-GFP-Mäusen isoliert wurden, lassen sich in Gewebekulturen leicht als GFP-positive Zellen identifizieren. Wenn diese Zellen durch Durchflusszytometrie untersucht werden, wird bestätigt, dass die meisten der GFP-positiven Zellen Sca1-Proteine auf ihren Zelloberflächen exprimieren, wie durch Anti-Sca1-Antikörper nachgewiesen wurde. In Verbindung mit real-time PCR-Analysen kann die differentielle Expression der kollagenolytischen Matrix-Metalloproteinasen zwischen inguinalen und nebenhoden fettabgeleiteten Sca1-Stammzellen mit hohem Fettgehalt nachgewiesen werden.

Des Weiteren wird bei der Verwendung von Fluorescein-markierten Typ-I-Kollagengelen zur Beurteilung der perizellulären Abbauaktivität eine deutlich erhöhte Kollagenumbauaktivität beobachtet, die durch viszerale Sca1-Stammzellen mit hohem Fettgehalt vermittelt wird. Einmal gemeistert, kann die Isolierung der Fettpolsterzellen in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, ein sauberes und organisiertes Operationsfeld zu erhalten, um eine effiziente Isolierung der Fettpolster zu gewährleisten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. ein Kollagenabbau-Assay, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum aus Fettgewebe gewonnenen Stammzell-vermittelten Gewebeumbau zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Fettleibigkeit und Matrixbiologie, um die Rolle von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen beim Umbau und der Funktion von Fettgewebe bei Mäusen und Menschen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie primäre Sca1-positive Zellen aus Fettgewebedepots gewinnen und anreichern können.