Name: Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1 Hoch Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie die immunomagnetische Trennung von Sca1-hohen Fettgewebe-Stammzellen aus Mäusefettdepots. Diese Methode nutzt Kollagenase-Verdauung und magnetische Zellsortierung für die Anreicherung von ASCs.

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Diese Arbeit wird von NIH DK095137 (THC) unterstützt. Wir danken den aktuellen und ehemaligen Labor-Mitglieder, die an der Entwicklung und Verfeinerung der beschriebenen Verfahren beigetragen.

Ethik-Statement: Die University of Michigan Ausschuss für Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) hat sich für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortierforschung, National Research Council) alle Methoden und Protokolle gemäß dem Leitfaden genehmigt. Die Mäuse werden in einer von der Universität Michigan Vivarium gehalten und haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser und hielt auf einem 12 Stunden Hell / Dunkel-Zyklus gegeben. 1. Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Primärkulturmedien DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G und 1x Antibiotika / Antimykotika. Dies wird verwendet, um Gewebe zu halten, bevor die Verdauung. Legen Sie Lager und aliquoten in 37 ºC Wasserbad. </li><li> Bereiten fünf Milliliter Typ III Kollagenase-Lösung auf 5 mg / ml in HBSS gelöst (+ Ca + Mg) für jede Art von Fettpolsters isoliert ist, bis zu fünf Mäusen. Wenn zum Beispiel SQ und VIS aus einem einzigen Genotyp zu isolieren, machen 10 ml, wenn Wildtyp und Mutante SQ und VIS, 20 ml zu machen. Der pH-Wert auf 7,4 und sterile Filter. Aliquote in 50-ml-Röhrchen. Nehmen Sie sich weg vom Licht. </li><li> Verwenden Sie 70% Ethanol Operationsfeld zu desinfizieren. Wischen Sie und Deckel mit einem blauen Pad. Sprühen Sie etwas Ethanol auf dem blauen Kissen. </li><li> Verwenden Sie die 22 G Nadeln ein absorbierendes Kissen auf der Styroporplatte festzunageln und schneiden mit einer Schere. Sprühen Sie das Pad mit Ethanol dann das Brett auf dem blauen Kissen gesetzt und mit einem anderen blauen Kissen abdecken, bis Dissektion beginnt. </li><li> Füllen Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit Ethanol und in einem Stand neben dem OP-Feld. Legen Sie die Schere und Pinzette in Ethanol. </li><li> Füllen Sie ein weiteres 50-ml-Röhrchen mit PBS plus 1x anti-anti für Ethanol aus chirurgischen Werkzeugen zu spülen. </li><li> In der Haube, Etikett 60-mm-Schalen für jeden Gewebetyp und füllen mit Kulturmedien auf 37 ° C erwärmt. Legen Sie die Platten neben dem OP-Bereich. </li></ol> 2. Isolierung von subkutanem (SQ) Fettpolster <ol><li> Euthanize Maus mit einer Überdosis von Isofluran und Pneumothorax. </li><li> SanftSpray-Maus mit 70% Ethanol und lag dem Rücken. Pin die Pfoten auf die Schaumplatte mit 22 G Nadeln. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des Unterleibs. die Spitze der Schnitt mit der Zange halten, nehmen Sie die Schere und die Haut vor dem Peritoneum trennen. </li><li> Sobald die Haut aus dem Peritoneum vom Abdomen auf den Thorax getrennt ist, spiegeln die Haut vom Peritoneum in Richtung des Kopfes durch entlang der Seite des Körpers seitliche Schnitte in der Haut. </li><li> Spiegeln die verbleibende Haut in den Leisten Fett vom Körper weg halten und Stift mit 22 G Nadeln an der Platte nach unten. </li><li> Wechseln Sie zu einer feinen Schere und Pinzette. Besorgen Sie sich die Leistenfettpolster mit der Zange am Ursprung in der Nähe des Peritoneum und schnippeln entfernt zwischen der Haut und Leisten- Fett in Richtung der Leiste voran Vermeidung der SQ mit der Haut zu kontaminieren. </li><li> Legen Sie die insolated Leistenfettpolster in der 60-mm-Schale bezeichnet. </li></ol> 3. Isolierung von Visceral (VIS) Fettpolster <ol><li> In ähnlicher Weise zu Schritt 2.5, schneiden Sie das Peritoneum geöffnet, um die viszerale Fettpolster und gut aus. </li><li> Bewegen Sie den Darm weg in Richtung des Thorax. </li><li> Besorgen Sie sich die VIS Fettpolster am distalen Ende und sanft nach oben ziehen. Präparieren Sie das VIS Fettpolster, während vorsichtig epididymal auszuschließen (oder des Uterus, wenn weibliche Mäuse verwendet wird) Gewebe. </li><li> Platz in der Bezeichnung Schale und wiederholen Sie den Schritt 3.3 für den verbleibenden VIS-Pad. </li></ol> 4. Collagenaseverdau von Fettpolstern <ol><li> Verschieben 60 mm-Schalen auf die Gewebekultur Kapuze und absaugen Medien. </li><li> Mince die Fettpolster mit einer gebogenen Schere fügen Sie dann zu Kollagenase-Lösung. Achten Sie darauf, die Schere und Zange zwischen Gewebetypen mit Ethanol und PBS zu spülen. </li><li> Schütteln bei 300 rpm und 37 ° C für 10-20 min, bis Gewebe verdaut werden. Es ist akzeptabel, wenn einige Stücke von SQ noch sichtbar sind. Dies wird in einem späteren Schritt zu richten. </li><li> 25 ml Kulturmedien auf die Kollagenase-Lösung die collag zu stoppenenase Behandlung und Pipette nach oben und unten 10-mal mit einer 10 ml serologische Pipette die verdaute Gewebe zu verteilen. </li><li> Der Stamm-Zellen eine 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb verwendet wird. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. </li><li> Sorgfältig Medien abdekantieren nicht das Pellet zu stören und zu 5 ml sterilem Wasser zu dem Pellet hinzu und sanft Pipetten Zellen zu suspendieren. Warten Sie 2 min Erythrozyten zu lysieren. </li><li> 25 ml Medium mit 10% FBS und Dehnungs Zellen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Dekantieren Medien und Pellet in 1 ml Kulturmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von 1: 1 Trypanblau. </li><li> Platte 1 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen. </li></ol> 5. Magnetzellseparation <ol><li> Nach etwa 4 bis 6 Stunden der Zelladhäsion, spülen die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg). Distanzieren anhaftenden Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. Verdünnen Trypsin Zellsuspension in 1 ml Trennpuffer und Spin5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen. Die Zellen in 500 &amp; mgr; l Puffer. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot und zählen Zellen eine Zählkammer. </li><li> Spin-Zellen für 5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen vollständig. Die Zellen in 90 &amp; mgr; l Puffer. In 10 ul anti-Sca1-FITC primären Antikörper. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. Vollständig entfernen Überstand. </li><li> Die Zellen in 80 ul Puffer. In 20 ul anti-FITC-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in 500 &amp; mgr; l Puffer. </li><li> Legen Sie Spalte in der Magnethalterung und spülen Säule mit 500 &amp; mgr; l Puffer. </li><li> Hinzufügen Zellsuspension zu Spalte. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren. </li><li> Sammeln Sie die unbeschriftete Sca1 - &lt;/ Sup&gt; Zellen und Säule 3-mal mit 500 &amp; mgr; l Puffer waschen. Nur neue Puffer hinzuzufügen, wenn der Behälter leer ist. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren. </li><li> Entfernen Sie Spalte aus dem Magnethalter und in einen 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ml Säulenpuffer und Sca1 + eluieren durch geliefert Kolben durch die Säule Reservoir drückt. </li><li> Spin down Zellfraktionen für 5 Minuten bei 300 x g. Die Zellen in 1 ml Kulturmedium. </li><li> Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot aus den markierten und unmarkierten Fraktionen und zählen Zellen eine Zählkammer. </li><li> Platte jede Zellfraktion in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li></ol> 6. Überprüfung der Immunomagnetische Trennung von Sca1 hohe ACSs mit Durchflusszytometrie <ol><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg) und distanzieren Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. Die Zellen in 1 ml Kulturmedien und zählen eine Zählkammer. </li><li> Erhalten&gt; 10 6 </sup&gt; Zellen in 1 ml Kulturmedien und Zentrifuge bei 300 g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.3 zwei weitere Male. </li><li> Die Zellen mit 1 ml 2% Ziegenserum + 2% BSA und Block 30 min bei RT. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Lösung blockiert. </li><li> Hinzufügen Ratte IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 &amp; mgr; g, 1: 400) oder anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 &amp; mgr; g, 1: 400), in 100 &amp; mgr; l PBS mit 2% Ziegenserum und 2% BSA + PBS bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln. </li><li> 1 ml kaltem PBS zu den Zellen. Zentrifuge 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.9 zwei weitere Male. </li><li> Die Zellen in 1 ml PBS. Pass Zellsuspensionen durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb in der Vorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in - vitro - Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS 9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Identi...

Stammzell - Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen 5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus - Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen 7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) 8 befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als linien negativ charakterisiert sind (Lin -) und CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. Die meisten dieser Zellen sind Sca1 +: CD24 - Adipozyten - Progenitoren, die von Adipozyten - Differenzierung in vitro geeignet sind; jedoch nur ein Bruchteil der Zellen (0,08% SVF) bildet Sca1 <soben&gt; +: CD24 + Zellen , die durchaus in der Lage vermehren und differenzieren zu Adipozyten in den in - vivo - Bedingungen 9 sind. Trotz der möglichen Einschränkung der ohne Unterscheidung CD24 + Zellen aus CD24 Sca1 + SVF mit - Zellen, Isolierung Sca1 + ASCS von Fettdepots immunomagnetischer Zelltrennung unter Verwendung ist eine effiziente und praktische Ansatz , um die zellautonome Phänotyp der primären Adipozyten Vorläuferzellen zu bestimmen. Auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes, Gewebefibrose und Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Wartung von Typ-2 - Diabetes 3 ​​spielen. Vor kurzem Tokunaga et al. zeigten , dass von Leisten- isolierten High - Zellen Sca1 (oder subkutan, SQ) und perigonadal (oder viszerale, VIS) 10 verschiedene Gen - Signaturen und ECM - Umbau in vitro C57BL6 / J Fettdepots aufweisen. MMP14 (MT1-MMP), ein prototypisches Mitglied der membran typ Matrix - Metalloproteinase (MMP) Familie vermittelt die Entwicklung von weißen Fettgewebe (WAT) durch seine kollagenolytischer Aktivität 1. Beispiele für Experimente , die mit den Zellen kann durch das folgende Protokoll sind die dreidimensionale Kultur, Differenzierung Studien, Kollagenabbau - Assays und RNA - Sequenzierung 10,11 isoliert und angereichert durchgeführt werden. Der Abbau Assays sollten mit Säure extrahierten Kollagen durchgeführt werden , um die Erhaltung der Telopeptid 11,12 zu gewährleisten. Das folgende Protokoll wird die Methoden nachweisen primären Zellen vaskuläre Stroma aus verschiedenen Fettdepots zu isolieren und zu Adipozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung von immunomagnetischer Zelltrennung zu bereichern. Die Gültigkeit der Zellsortierung mit Fluss bewertet werden Zytometrie und durch den Einsatz von Sca1-GFP - Mäuse , die GFP in Sca1 + Zellen exprimieren, angetrieben durch einen Sca1 Promotor 13.

<table><tbody><tr><td>Typ 3 Kollagenase</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS004182</td><td>Gewebeverdauung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Kulturmedium mit hohem Glukosegehalt</td></tr><tr><td>Pen/Strepto/Glutamin (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Medienantibiotikum</td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Medienantimykotikum</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; m cell Sieb</td></tr><tr><td>60 mm Platten</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Große</td></tr><tr><td>Schere</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Feine, gebogene Spitze</td></tr><tr><td>Große Pinzette</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" Nadeln</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1,5" Nadeln</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS Trennsäulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 Mikrokügelchen-Kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Ab und Anti-FITC Mikrokügelchen 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS Laufpuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Blaue Chux-Pads</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Saugeinlagen</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Styroporplatte</td><td></td><td></td><td>Verwendung aus 50 ml Tuben</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a Anti-Maus Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2a Anti-Maus F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Rundbodenrohr</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Für Kollagenase-Lösung</td></tr><tr><td>Typ I Kollagen (2,7 mg/ml in 37 mm Essigsäure</td><td>Im Haus zubereiten12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td> Im <td>Haus</td> <td>zubereiten</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Carbonsäure, Succinimidylester, gemischte Isomere</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0,89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetische trennung von fett depot-spezifische sca1<sup&gt; hoch</sup&gt; fettgewebe gewonnene stammzellen (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Die Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASCs) ist eine wichtige Methode auf dem Gebiet der Fettgewebsbiologie, der Adipogenese und des Umbaus der extrazellulären Matrix (ECM). In vivo bietet eine EZM-reiche Umgebung, die aus fibrillären Kollagenen besteht, eine strukturelle Unterstützung für das Fettgewebe während des Fortschreitens und der Rückbildung von Fettleibigkeit. Der physiologische EZM-Umbau, der durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) vermittelt wird, spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Größe und Funktion des Fettgewebes1,2. Der Verlust des physiologischen kollagennolytischen EZM-Umbaus kann zu einer übermäßigen Kollagenakkumulation (Gewebefibrose), einer Makrophageninfiltration und schließlich zu einem Verlust der metabolischen Homöostase einschließlich Insulinresistenz führen3,4. Wenn eine phänotypische Veränderung des Fettgewebes in gengesteuerten Mausmodellen beobachtet wird, ist die Isolierung primärer ASCs aus Fettdepots für in vitro-Studien ein wirksamer Ansatz, um die Rolle des spezifischen Gens bei der Regulation der Funktion von ASCs zu definieren. Im Folgenden definieren wir eine immunomagnetische Trennung von Sca1-hohen ASCs.

Anreicherung von Sca1 hohe ASCS aus verschiedenen Fettpolster. Die vaskuläre Stromazellen aus SQ Fett Anzeige Fibroblasten-ähnliche isoliert, gestreckt Zellform unabhängig von Sca1 Expressionsniveau (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, VIS (EWAT-derived) Sca1 hoch und Sca1 niedrigen Zellen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Zellform. Wie SQ (iWAT abgeleitete) Sca1 ho...

Wir stellen die Techniken vor, die zur Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus inguinalen (subkutanen) und perigonadalen (viszeralen) Fettgewebsdepots der Maus erforderlich sind, um ihre Genexpression und kollagenolytische Aktivität zu beurteilen. Diese Methode umfasst die Anreicherung von Sca1-Stammzellen (ASCs) mithohem Fettgehalt durch immunomagnetische Zelltrennung.

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Sca1-positive mesenchymale Stammzellen aus verschiedenen Mausfettgeweben zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass adiposengewebestammzellen aus unterschiedlichen Fettdepots mittels immunmagnetischer Säulenchromatographie effektiv angereichert werden können, um anschließende Experimente durchzuführen. In der Regel haben Forscher, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Stärke und Dauer der kollagenasevermittelten Gewebeverdauung optimiert werden muss, um eine ausreichende Anzahl an Zellen für die Sortierung zu erhalten.Um die subkutanen Fettgewebe zu isolieren, platzieren Sie die Maus zunächst in Rückenlage auf einer Schaum-Präparationsplatte und besprühen Sie das Tier mit 70 %igem Ethanol. Nachdem Sie die Pfoten an der Platte befestigt haben, führen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des unteren Bauchbereichs durch. Greifen Sie dann mit einer Pinzette die obere Schnittstelle und trennen Sie mit einer Schere die Haut und das Peritoneum vom Bauch bis zum Thorax ab.Erstellen Sie seitliche Schnitte in der Haut entlang der Körperseite, und klappen Sie die Haut vom Peritoneum in Richtung Kopf zurück. Ziehen Sie dann die restliche Haut zurück, halten Sie das inguinale Fettgewebe vom Körper weg und befestigen Sie die Haut mit 22-Gauge-Nadeln am Brett. Greifen Sie anschließend mit der Pinzette einen inguinalen Fettpolster an seiner Ursprungsstelle nahe dem Peritoneum, und schneiden Sie mit feiner Schere zwischen Haut und inguinalen Fettgewebe entlang in Richtung Leiste, wobei Sie vermeiden, dass das subkutane Fettgewebe mit Haut kontaminiert wird.Danach das isolierte Leistenfettgewebe in eine mit SQ gekennzeichnete 60-Millimeter-Schale mit Kulturmedium bei 37 Grad Celsius geben und das Leistenfettgewebe von der anderen Seite des Tieres auf die gleiche Weise entnehmen. Um die viszeralen Fettgewebe zu isolieren, wird das Peritoneum durchtrennt, um das viszerale Fettgewebe und den Darm freizulegen. Anschließend wird der Darm zur Brusthöhle hin beiseitegeschoben.Greifen Sie das viszerale Fettgewebe am distalen Ende an, ziehen Sie vorsichtig am Fettgewebe und dissezieren Sie es aus, wobei Sie darauf achten, das Nebenhoden-Gewebe auszuschließen. Legen Sie dann das Fettgewebe in eine mit VIS beschriftete 60-Millimeter-Schale, die Kulturmedium mit 37 Grad Celsius enthält. Sobald alle Fettgewebe gesammelt wurden, bringen Sie die Schalen in eine Zellkulturhaube und aspirieren Sie das Medium. Verwenden Sie gebogene Scheren, um die Polster zu zerkleinern. Geben Sie anschließend die Fettstücke in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen, die frisch zubereiteten Kollagenase enthalten. Schütteln Sie die Röhrchen danach 10 bis 20 Minuten lang bei 300 U/min und 37 Grad Celsius, bis die Gewebe verdaut sind.Einige Stücke des subkutanen Fettgewebes können noch sichtbar sein. Geben Sie 20 Milliliter Kulturmedium zur Kollagenase-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen, und aspirieren und dispensieren Sie die Gewebesuspension mithilfe einer 10-Milliliter-Serologiepipette zehnmal, um die verdauten Gewebe vollständig zu dissoziieren. Filtern Sie die Zellen durch Zellseihen mit 100 Mikrometer Porengröße und zentrifugieren Sie das Gewebe.Danach das Medium vorsichtig abgießen, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellets nicht aufzuwirbeln, und beide Zellgruppen vorsichtig in fünf Milliliter steriler Wasser resuspendieren. Zwei Minuten warten, bis die Erythrozyten lysiert sind. Anschließend die Reaktion in jedem Gefäß mit 25 Milliliter Medium, das mit FBS angereichert ist, stoppen.Filtern Sie beide Adipozytenpopulationen durch neue Zellfilter mit 100 Mikron, zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die Pellets in ein bis drei Milliliter Medium. Nach der Zellzählung mittels Trypanblau-Ausschluss werden je eine Million subkutaner Fettgewebszellen und viszeraler Zellen separat in einzelne Vertiefungen einer sechswelligen Zellkulturplatte gegeben. Nach dem Trypsinieren der Zellen verdünnen Sie das Trypsin mit einem Milliliter Separationspuffer und zentrifugieren anschließend die Kulturplatten.Wir suspendieren die Zellen in 500 µL pro Röhrchen Separationspuffer und zentrifugieren die Zellen erneut. Nun resuspendieren wir die Zellen in 90 µL pro Röhrchen Separationspuffer und geben 10 µL anti-Sca1 FITC Primärantikörper zur Zellsuspension hinzu. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius im Dunkeln waschen wir die Zellen mit je einem Milliliter Separationspuffer pro Röhrchen.Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen in 80 Mikrolitern Separationspuffer pro Zellsuspension resuspendiert. Anschließend 20 Mikroliter Anti-FITC-Mikroperlen in jedes Loch geben und die Platten 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt, inkubieren. Am Ende der Inkubation werden die Zellen mit einem Milliliter Separationspuffer gewaschen und pro Röhrchen in 500 Mikrolitern frischem Puffer resuspendiert.Platzieren Sie nun eine Säule im magnetischen Halter und waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern Trennpuffer. Überführen Sie die Zellen aus der subkutanen Fettgewebekultur auf die Säule, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden, und sammeln Sie die nicht markierten Sca1-negativen Zellen in einem 15-Milliliter-Konischglas. Nachdem alle Zellen durchgelaufen sind, waschen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern Trennpuffer.Überführen Sie dann die Säule vom Magneten in ein neues 15-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie ein Milliliter frischen Trennpuffer durch die Säule, um die Sca1-positiven Zellen zu eluieren. Zentrifugieren Sie abschließend sowohl die Sca1-positiven als auch die Sca1-negativen Zellfraktionen und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Kulturmedium. Bestimmen Sie anschließend die Anzahl der Zellen in jeder Fraktion und geben Sie die Fraktionen in einzelne Vertiefungen einer neuen sechswelligen Zellkulturplatte.Aus subkutanem Fett isolierte vaskuläre Stromazellen weisen eine fibroblastenähnliche, gestreckte Zellform auf, unabhängig von ihrem Sca1-Expressionsniveau. Wie aus subkutanem inguinalen Fett stammende Sca1-hohe Zellen zeigen auch aus viszeralem epididymalem Fett stammende Sca1-hohe Zellen eine gestreckte, fibroblastenähnliche Zellform. Dagegen weisen VIS Sca1-niedrige Zellen eine epitheloidähnliche Form auf.Sca1-hohe Zellen, die aus isolierten Sca1-GFP-Mäusen gewonnen wurden, lassen sich in der Gewebekultur leicht als GFP-positive Zellen identifizieren. Tatsächlich wird bei Analyse mittels Durchflusszytometrie bestätigt, dass die meisten GFP-positiven Zellen Sca1-Proteine auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wie durch anti-Sca1-Antikörper nachgewiesen. In Kombination mit Echtzeit-PCR-Analysen kann die unterschiedliche Expression der kollagenolytischen Matrix-Metalloproteinasen zwischen aus inguinalen und epididymalen Fettgeweben stammenden Sca1-hohen, fettgewebsabgeleiteten Stammzellen gezeigt werden.Weiterhin wird eine deutlich erhöhte Kollagen-Remodeling-Aktivität, vermittelt durch viszerale Sca1-high aus Fettgewebe stammende Stammzellen, beobachtet, wenn Fluorescein-markierte Typ-I-Kollagen-Gele zur Beurteilung der perizellulären Abbaualtivität verwendet werden. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Zellisolierung aus dem Fettgewebe bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ein sauberes und geordnetes chirurgisches Feld aufrechtzuerhalten, um eine effiziente Isolierung der Fettgewebslappen sicherzustellen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie ein Kollagenabbau-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur von fettgewebsstämmigen Stammzellen vermittelten Gewebeumgestaltung zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Adipositas- und Matrixbiologie den Weg, um die Rolle fettgewebsstämmiger Stammzellen bei der Umgestaltung und Funktion von Fettgewebe bei Mäusen und Menschen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Sca1-positive Zellen aus Fettgewebsdepots gewonnen und angereichert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von fluoreszenzmarkierten Stammzellen (ADSCs) aus Fettzellen (ADSCs) aus dem periaortalen Bogenfettgewebe von Mäusen. Nach der Isolierung werden die NCADSCs nachgewiesen, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert und anschließend auf einer Platte kultiviert, wodurch die Zellproliferation gefördert wird.

Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus periaortalem Fettgewebe der Maus

Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

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Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

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Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

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Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

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Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch &gt;90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.

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Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1

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