Gleichzeitige Detektion von c-Fos Aktivierung von mesolimbischen und mesocorticalen Dopamine Belohnung Seiten Nach Naive Zucker und Fett Verschlucken in Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, zu bestimmen, ob die VTA und ihre wichtigsten mesotelenzephatischen DA-Projektionszonen nach der Aufnahme von Maisöl, Glukose, Fruktose oder Saccharinlösungen eine koordinierte und gleichzeitige c-Fos-Aktivierung aufweisen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, wie z. B. die Motivation, und herauszufinden, ob mehrere Gehirnstellen als Reaktion auf schmackhafte Reize koordiniert aktiviert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die etablierten Verhaltensassays, zellulären Aktivierungstechniken und die statistischen Analysen kombiniert.

Um das Gerät einzurichten, verwenden Sie ein kalibriertes Zentrifugenröhrchen mit einem Räuberstopfen und ein Metall-Sipper-Rohr mit einem 45-Grad-Winkel, um eine genaue Messung der der Ratte präsentierten Lösung zu ermöglichen. Befestigen Sie es mit einer gespannten Metallfeder am Heimkäfig, um die Sichtbarkeit der Kalibrierung zu ermöglichen. Beschränken Sie drei bis fünf Tage vor dem Training die Futterrationen an die Ratte, um ihr Körpergewicht auf 85% ihres ursprünglichen Gewichts zu reduzieren, um die Motivation zum Verzehr der Lösung zu erhöhen.

In der Zwischenzeit geben Sie dem Tier vier Tage lang über eine einstündige Sitzung 10 Milliliter Vortrainingslösung mit einem Saccharin von 0,2 %, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass die Ratte die nachfolgende Testlösung mit kurzer Latenz beprobt. Wiegen Sie den Schlauch vor und nach jeder Sitzung, um die Einlassmessung zu erhalten. Führen Sie dann am fünften Tag einen Aufnahmetest für Untergruppen durch, die eine der sechs Lösungen erhalten.

Stellen Sie sicher, dass die Ratten die Lösung mit kurzer Latenz beproben, und schließen Sie die Probanden von der Studie aus, wenn diese Anforderung nicht erfüllt ist. Um das Gewebe vorzubereiten, entfernen Sie nach dem Opfern des Tieres schnell das Gehirn aus dem Schädel. Verwenden Sie die Rongeure, um den Knochen vorsichtig zu knacken und aus dem Gehirn zu entfernen, beginnend von hinten nach vorne.

Arbeiten Sie im Bereich unterhalb des Kleinhirns und stellen Sie sicher, dass sich die Rongeure zwischen dem Knochen und der meningealen Pia mater befinden. Sobald die Oberseite und die Seiten des Schädels entfernt sind, heben Sie das Gehirn mit einem kleinen Spatel von seiner Basis ab und schneiden Sie die Hirnnerven mit einer kleinen Schere ab. Fixieren Sie dann das Gehirn über Nacht bei vier Grad Celsius in 4%iger Paraformaldehydlösung.

Legen Sie das Gehirn am nächsten Tag in die Saccharoselösung bei Raumtemperatur, bis es sich am Boden des Behälters absetzt. Entfernen Sie danach den Riechkolben. Entfernen Sie anschließend das Kleinhirn und die Pons.

Montieren Sie dann das Gehirn koronal, wobei der kaudale Teil auf dem Stadium des Mikrotoms befestigt ist, und schneiden Sie koronale Schnitte von 40 Mirometern. Behandeln Sie bei diesem Verfahren die Schnitte eine Stunde lang mit fünf Millilitern 5 % normalem Ziegenserum und 0,2 % Triton x-100 in PBS. Als nächstes inkubieren Sie die behandelten Abschnitte mit Primärantikörpern 36 Stunden lang bei vier Grad Celsius in den Vertiefungen, die einen Milliliter PBS enthalten.

Spülen Sie die Abschnitte nach 36 Stunden dreimal für jeweils 10 Minuten mit fünf Millilitern PBS aus. Inkubieren Sie dann die Abschnitte mit Sekundärantikörpern zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in den Vertiefungen, die einen Milliliter PBS enthalten. Spülen Sie die Abschnitte anschließend dreimal für jeweils 10 Minuten in fünf Millilitern PBS aus.

Inkubieren Sie anschließend die gespülten Abschnitte zwei Stunden lang in einer handelsüblichen Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Mischung. Spülen Sie die Abschnitte nach zwei Stunden dreimal in fünf Millilitern PBS, jeweils zehn Minuten lang. Anschließend werden die Abschnitte fünf bis zehn Minuten lang in Gegenwart von Wasserstoffperoxid mit DAB umgesetzt.

Danach markieren Sie die VTA-Abschnitte doppelt, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper in fünf Millilitern PBS inkubieren. Spülen Sie die Abschnitte am nächsten Tag dreimal in fünf Millilitern PBS aus, jeweils zehn Minuten lang. Anschließend werden die Abschnitte mit Sekundärantikörpern in fünf Millilitern PBS bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubiert.

Spülen Sie die Abschnitte nach zwei Stunden dreimal in fünf Millilitern PBS, jeweils zehn Minuten lang. Um den Antikörper mit einem Sekundärantikörper-Peroxidase-Komplex sichtbar zu machen, reagieren Sie fünf bis zehn Minuten lang mit einer Kombination aus DAB und einer 0,3%igen Nickelsulfatlösung. Zählen Sie die Zellen, indem Sie auf das Softwaresymbol doppelklicken.

Gehen Sie zur Menüleiste, klicken Sie auf Erfassung und dann auf Live Image. Bringen Sie danach den interessierenden Bereich in den Fokus und klicken Sie auf den Bildschirm, um einen Referenzpunkt festzulegen. Wechseln Sie als Nächstes zur Rastersymbolleiste und klicken Sie auf Raster anzeigen und auf Rasterbeschriftungen verwenden.

Umreißen Sie den interessierenden Bereich mit einer vorgegebenen Spur. Zählen Sie dann alle Zellen in jedem interessierenden Bereich und wählen Sie in der linken Seitenleiste Plus aus, um die Anzahl der c-Fos-Zellen zu registrieren. Betrachten Sie eine Zelle als positiv für c-Fos, wenn ein definierter dunkelroter Kreis beobachtet wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Site, und stellen Sie sicher, dass die Inter-Rater-Zuverlässigkeit der beiden nicht informierten Bewerter für jeden Abschnitt in jeder Region von Interesse immer über 0,8 liegt. Zählen Sie anschließend die c-Fos-positiven Neuronen in den interessierenden Regionen. Es ist zu beschreiben, ob die c-Fos-Immunreaktivität in den TH-positiven und TH-negativen Zellen in der VTA vorhanden ist.

Dieses Bild zeigt, dass die Fett- oder Zuckeraufnahme die c-Fos-Aktivierung in der gesamten Amygdala sowie in den basolateralen und zentralkortiko-medialen Amygdala-Subbereichen unterschiedlich erhöht. In diesem Bild wurde eine tatsächliche Amygdala c-Fos-Aktivierung bei Tieren beobachtet, die der Aufnahme von Maisöl, Glukose und Fruktose ausgesetzt waren. Die C-Fos-Aktivierung in der VTA wurde auch bei Tieren beobachtet, die Maisöl und Wasser ausgesetzt waren.

Schwarze Pfeile zeigen die repräsentativen, doppelt beschrifteten, TH c-Fos-positiven Zellen an, während graue Pfeile die repräsentativen c-Fos-Zellen anzeigen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine genaue Methodik, Speicherung und Zählung zu befolgen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.