Name: In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation zur Analyse der Influenza-A-Virus-Kapsidzerlegung unter endosomähnlichen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht quantitative Einblicke in den Entkapselungsprozess.

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Wir danken Yohei Yamauchi und Roberta Mancini für uns mit Reagenzien bereitstellt. Das AH-Labor durch die Marie-Curie Initial Training Networks (ITN), dem European Research Council (ERC), und von der Schweizerischen National Science Foundation (Sinergia) unterstützt wurde.

1. Herstellung von Puffer und Stammlösungen <ol><li> Bereiten MNT - Puffer (20 mM MES, 30 mM Tris und 100 mM NaCl) durch Auflösen von 470 mg Tris - Hydrochlorid, 390 mg MES - ​​Hydrat und 580 mg NaCl in 80 ml ​​ddH 2 O. Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4 und bringt es auf ein Endvolumen von 100 ml mit ddH 2 O. </li><li> Bereiten Sie drei identische Lösungen von 500 mM MES - ​​Puffer durch Auflösen von 9,76 g MES - ​​Hydrat in 80 ml ​​dH 2 O je. Stellen Sie die Puffer pH 5,8, 5,4 und 5,0 jeweils durch mit konzentrierter NaOH titriert. Bringen jeder Puffer auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O. </li><li> Bereiten zwei identische Lösungen von 500 mM Tris - Puffer durch Lösen von 7,88 g Tris - Hydrochlorid in 80 ml ​​dH 2 O und jeweils den pH - Wert auf 7,4 und 6,4 jeweils durch mit konzentrierter HCI titriert. Bringen Sie den Puffer zu einem Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie 50% Glycerin - Lösung in dH 2 O und gut umrühren , bis die glycerol ist homogen vermischt. Filtern der Lösung durch eine Steritop Filtereinheit (0,22 um Porengrße) in eine Glasflasche. </li><li> Herstellung von 10% NP-40 - Lösung und 1 M NaCl in dH 2 O. </li><li> Bereiten 25x konzentrierter Protease - Inhibitor durch Auflösen von zwei Tabletten in 4 ml ddH 2 O. </li></ol> 2. Herstellung von Glycerol Gradients <ol><li> Bereiten 5 ml Detergenspuffer Master Mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x konzentrierte Proteaseinhibitor) -Lösung für jeden pH Zustand Test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0). Zu diesem Zweck mischen 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml des 25x - Protease - Inhibitor Lager, und 9 ml ddH 2 0. </li><li> Für jeden pH Zustand Pipette 4,4 ml der Master-Mix in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Für die pH-Werte über 5,8 addieren 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM Tris-Stammlösung in das Röhrchen. Für pH 5,8 und niedriger 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM MES-Stammlösung hinzufügen. </li><li> Machen 5ml Pufferlösung , enthaltend 300 mM NaCl, 2x - Protease - Inhibitor, 60 mM Tris 7,4 und ddH 2 O auf pH Dies wird als Waschmittel freie Steuerung Gradientenpuffer dienen. </li><li> Falls erforderlich, Feineinstellung der pH der Lösungen auf einen pH von 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0 durch Zugabe von konzentrierter HCl oder NaOH Lösungen, respectively. </li><li> 5 ml 50% Glycerin-Stamm bis 5 ml der Waschmittelhaltigen und waschmittelfreie Puffergemische was zu sechs verschiedenen 25% Glycerinlösungen. Überprüfen Sie die pH-Werte von pH-Indikatorstreifen verwendet wird. HINWEIS: Falls der gemessene pH-Wert signifikant von dem Sollwert abweicht, sollten die jeweiligen Lösungen wieder hergestellt werden. </li><li> Vorbereitung 15% Glycerin - Lösung von 50% Glycerin - Vorrats Mischen mit dH 2 O in einem 3: 7 - Verhältnis. </li></ol> 3. Ultrazentrifugation von IAV <ol><li> 3 ml 15% Glycerin-Lösung in extrem klar Zentrifugenröhrchen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) durch eine 5 ml-Spritze und ein neeDLE (21 G, 9 cm lang). Nicht Tropfen an der Innenwand des Rohres lassen, da dies die Integrität des Gradienten stören. Wiederholen Sie dies für insgesamt sechs Zentrifugenröhrchen, eine für jede der fünf pH-Bedingungen zu testen, und eine für die Kontrollprobe. </li><li> Vorsichtig 3,4 ml 25% Glycerin-Lösung unter der Schicht 15% Glycerin durch eine 5-ml-Spritze und eine lange Nadel. Achten Sie darauf, nicht auf die beiden Schichten mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle sechs Bedingungen mit den jeweiligen pH-Wert eingestellten Glycerinlösungen zu testen. HINWEIS: Die Arbeit in der Klasse II Biosicherheitswerkbank für die folgenden Schritte. </li><li> Overlay sanft die Glycerol-Gradienten mit 30 ul geklärten Allantoisflüssigkeit enthält IAV (X31, H3N2) in 1 ml MNT-Puffer verdünnt (entspricht etwa 20-30 ug Gesamt-Virusprotein) für jeden Gradienten. </li><li> Gleichgewicht gegenüberliegenden Röhren und legen Sie sie in einen SW41 Ultrazentrifugation Rotor. Zentrifuge für 150 min bei 55.000 xg und 12 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation sorgfältigÜberstand verwerfen, dh sowohl Glycerol Schichten durch eine saubere Pasteur - Pipette und eine Saugvorrichtung verwendet. Das Pellet in 40 &amp; mgr; l (1x) nicht reduzierende Puffer LDS Probe. Es ist wichtig zu pipettieren und mehrmals über das Pellet vollständig aufzulösen. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 4. SDS-PAGE von Pelletfraktionen und Coomassie-Färbung <ol><li> Erhitzen alle Proben bei 95 ° C für 10 min. An diesem Punkt können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, bis sie durch SDS-PAGE analysiert. </li><li> Last 20 ul der gelösten Pellets auf einen vorgegossenen Gradienten (4-12%) Bis-Tris-Gel mini und laufen für 1 Stunde bei 200 V in 1x SDS MOPS Laufpuffer. </li><li> Machen Fixierungslösung mit 40% Methanol und 10% Eisessig in ddH 2 O. </li><li> Inkubieren Sie das Gel in Fixierungslösung für 1 Stunde und über Nacht in einer 15 cm Zellkulturschale mit einem ausreichenden Volumen von kolloidalem Coomassie Lösung färben, während sanftSchütteln bei Raumtemperatur. HINWEIS: Es ist wichtig, die Schale zu vermeiden, um die Verdampfung des Färbelösung zu schließen. </li><li> Entfärben des Gels in ddH 2 O. Tauschen Sie die ddH 2 O alle 15-20 min , bis das Gel Hintergrund deutlich wird. Lagern Sie das Gel in ddH 2 O bei 4 ° C bis zur Band Quantifizierung abgetastet wird. </li><li> Scannen Sie das Gel mit hoher Auflösung und verwenden im Handel erhältlich oder maßgeschneiderte Software für die Quantifizierung von Proteinbandenintensitäten. Subtrahieren des Hintergrundsignals von einem Bereich nahe den jeweiligen Bändern und normalisieren diese Werte an die detergensfreien Kontrollproben (bei pH 7,4). </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Virale Capside sind metastabile makromolekularer Komplexe. Während Zusammenbau von Virionen, die Einkapselung und Kondensieren des Virusgenoms erfordert, hängt Einleitung der nächsten Runde der Infektion auf die Demontage dieser kompakten Kapsidstruktur. Viren entwickelt haben verschiedene zelluläre Mechanismen zu nutzen , um die Beschichtung-uncoating Zyklus zu steuern, einschließlich der zellulären Rezeptoren, Chaperone, proteolytischen Enzymen, physikalische bereitgestellt Kräfte , die durch Motorproteine ​​oder Heli...

Influenza - A - Virus (IAV) ist ein umhülltes Virus und gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Seine Gene codiert sind auf einem segmentierten, Negativ-sense und einzelsträngige RNA-Genom. Beim Menschen verursacht IAV Infektionen der Atemwege, die 1 für die globale Pandemien saisonalen Epidemien und trägt das Potential auftreten. Nach Bindung an Sialinsäure-Reste auf der Zelloberfläche 2 wird IAV internalisiert von Clathrin-abhängige Endozytose und Clathrin-unabhängige Wege 3-8. Das saure Milieu (pH &lt;5,5) in den endozytischen Vakuolen löst eine große Konformationsänderung des IAV - Spike - Glykoprotein - Hämagglutinin (HA), die in Fusion des viralen Ergebnisse und die späten endosomalen Membran 9. Sobald die IAV Kapsid (hier auch als virale &quot;Kern&quot; bezeichnet) wurde von späten Endosomen (LEs) entkommen, es in das Cytosol unbeschichtet wird durch den Transport der viralen Ribonukleoproteine ​​gefolgt (vRNPs) in den Kern - die Seite of Virus - Replikation und Transkription 13.10. Vor der Säureaktivierung von HA erfährt das Virus eine allmähliche Abnahme der pH - Wert im endozytischen System, das den Kern für seine spätere Demontage 14-16 Primzahlen. In dieser &quot;Priming&quot; die M2 - Ionenkanäle in der viralen Membran Schritt vermitteln den Zustrom von Protonen und K +10,14,16. Die Veränderung der Ionenkonzentration in dem Virus Innenraum stört die Wechselwirkungen durch das virale Matrix - Protein aufbauen M1 und dem acht vRNP Bündel und erleichtert IAV uncoating im Zytoplasma folgende Membranfusion 10,14-17. Direkte und quantitative Analyse des Priming-Schritt wurde durch die Tatsache erschwert, dass Endosomen schwer experimentell zuzugreifen. Der Eingabeprozess ist außerdem stark nichtsynchron. Zusätzlich Endpunktassays, wie qRT-PCR von freigesetzten viralen RNA oder Infektiosität Messungen bieten nicht ein genaues Bild über die biochemischen Zustand des viralen capsid zu einem bestimmten Schritt des Eintrages. Während Störung von Endosomen durch siRNA oder medikamentöse Behandlung wesentlich zum Verständnis der IAV Eintrag beigetragen hat 18-20, Feinabstimmung ist schwierig und anfällig für unspezifische Nebenwirkungen in der streng kontrollierten endosome Reifung Programm. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine bisher entwickelten in vitro - Protokoll auf der Verwendung von Geschwindigkeits Gradientenzentrifugation 17 basierend angepasst. Im Gegensatz zu anderen Versuchen , 21,22, 23,24, die auf Kombinationen von proteolytischen Spaltung und Detergens - Behandlung meist auf Basis wurden von EM - Analyse verfolgt, ermöglicht dieser Ansatz eine leicht quantifizierbar Ergebnis. Zentrifugation durch verschiedene Gradientenschichten ermöglicht die sedimentierenden Teilchen ausgesetzt werden und reagieren mit den Bedingungen in einer kontrollierten Weise zu verändern. In dem vorgestellten Protokoll IAV abgeleitet von geklärten Allantoisflüssigkeit oder gereinigter Viruspartikel werden in einer zweischichtigen Glycerin sedimentiertGradienten in dem die untere Schicht enthält den nicht-ionischen Detergens NP-40 (Abbildung 1). Da das Virus das zweite, Waschmittel enthaltende Schicht ein, so werden die viralen Lipidhülle und Hüll-Glycoproteine ​​sanft löslich gemacht und hinter sich gelassen. Der Kern, der sich aus den acht vRNP Bündels und durch eine Matrixschicht, Sedimenten als eine stabile Struktur, in der Pelletfraktion umgeben. Virale Kernproteine, wie beispielsweise M1 und vRNP assoziiertes Nukleoprotein (NP), können in dem Pellet durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung identifiziert werden. Insbesondere Vorteil handelsüblichen Gradientengelen unter und Färbung mit dem hochempfindlichen kolloidalen Coomassie 25, ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Erfassung von sogar kleinen Mengen der viralen Core-assoziierten Proteinen. Dies stellt die Grundlage für die Prüfung, ob verschiedene Bedingungen wie pH-Wert, Salzkonzentration und mutmaßliche uncoating Faktoren haben Auswirkungen auf das Sedimentationsverhalten von Kernkomponenten und Kern stabil<html> keit. Zu diesem Zweck nur die untere, waschmittelhaltigen Schicht in dem Glycerol-Gradient wird durch die Einführung des Faktors oder der Zustand von Interesse modifiziert. Die Technik ist besonders wertvoll, die Wirkung von verschiedenen pH - Werten und Salzkonzentrationen auf die Integrität des IAV Kern 16 in die Untersuchung. Zwischenschritte des IAV uncoating könnte einschließlich Dissoziation der Matrixschicht anschließend bei leicht sauren pH (&lt;6,5) bei einem pH von 5,5 vRNP Dissoziation überwacht und unteren 16,17 (Abbildung 1). Der letztere Schritt wurde durch die Anwesenheit von hohen K + -Konzentration in der Glycerinschicht verstärkt, einen späten endozytotischen Umgebung widerspiegelt 16. Somit ist, wie das Virus, und der Kern durch den Gradienten sedimentiert erfahren sie einen wechselnden Milieu, das nachahmt Bedingungen in Endosomen. Das Ergebnis war eine schrittweise Demontage des viralen Kern in vitro als Ergänzung Ergebnisse abgeleitet von der Zellbiologie - Assays. t &quot;&gt; Das hier dargestellte Verfahren hat sich schnell aktiviert und hoch reproduzierbare Analyse von IAV (X31 und A / WSN / 33) und IBV (B / Lee / 40) durch sauren pH - Wert ausgelöst uncoating und K +16,17 sowie Demontage zu erhöhen von Paramyxovirus Kerne bei alkalischen pH - Exposition 17. Es ist denkbar, dass der Ansatz kann auch auf andere umhüllte Viren angepasst werden Einblicke in die biochemischen Eigenschaften des viralen Kapsids Struktur und Kapsid Demontage während Zelleintritt zu gewinnen.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, EDTA-freie Proteasehemmer-Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>Die Stammlösung kann bei 2 bis 8 Grad gelagert werden; C für 1 bis 2 Wochen</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin wasserfrei BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Lange Injektionsnadel (21&nbsp; G, 9 cm, abgeschrägt oder stumpf Ende)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES</td> hydrat <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Jetzt kommerziell erhältlich als IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini-Gele, 10 μl; Wells, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-Probenpuffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH-Indikatorstreifen, pH 4,0-7,0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Kolloidale Coomassie Färbung</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Chlorid</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Filtereinheit</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, Ultrazentrifugenrotorsatz</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, Ultraklare Zentrifugenröhrchen, 13,2&nbsp; ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman-Schar</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Influenza-A-Virus (H3N2), in Eiern gezüchtet, geklärte Allantoisflüssigkeit</td><td>Virapur</td><td></td><td>Frisch aufgetaut auf 4 > C</td></tr></tbody></table>

in - vitro - zerlegung von influenza - a - virus kapside durch gradientenzentrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Säure-ausgelöste molekulare Prozesse kontrollieren den Zelleintritt vieler Viren, die durch das endozytäre System eindringen, genau. Im Falle des Influenza-A-Virus (IAV) wird die Virusfusion mit der endosomalen Membran sowie der anschließende Abbau des viralen Kapsids, die sogenannte Entschichtung, durch die ionischen Bedingungen in den endozytären Vesikeln bestimmt. Die frühen Schritte im Lebenszyklus des Virus sind schwer zu untersuchen, da experimentell kein direkter Zugang zu Endosomen möglich ist, was einen In-vitro-Ansatz erforderlich macht. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf der Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation von gereinigten Virionen durch einen zweischichtigen Glyceringradienten basiert und eine Analyse des IAV-Kerns und seiner Stabilität ermöglicht. Der Gradient enthält in seiner unteren Schicht ein nichtionisches Detergens (NP-40), um die Virusmembran durch Solubilisierung zu entfernen, während das Virus nach unten sedimentiert. Bei neutralem pH-Wert werden die Viruskerne als stabile Strukturen pelletiert. Die Hauptkernkomponenten, das Matrixprotein (M1) und die viralen Ribonukleoproteine (vRNPs), können in der Pelletfraktion mittels SDS-PAGE eindeutig identifiziert werden. Durch Senkung des pH-Werts auf 6,0 oder niedriger in der unteren Schicht wird M1 selektiv aus dem Pellet entfernt, gefolgt von der Freisetzung von vRNPs unter saureren Bedingungen. Virale Proteinbanden auf Coomassie-gefärbten Gelen können einer densitometrischen Quantifizierung unterzogen werden, um Zwischenzustände der IAV-Demontage zu überwachen. Neben dem pH-Wert können auch andere Faktoren, die die Stabilität des Viruskerns beeinflussen, wie z. B. die Salzkonzentration und mutmaßliche Faktoren für die virale Enthüllung, bewertet werden, indem einfach die detergenzienhaltige Glycerinschicht entsprechend modifiziert wird. Zusammengenommen ermöglicht die vorgestellte Technik eine hochgradig reproduzierbare und quantitative Analyse der viralen Enthüllung in vitro. Es kann auf andere behüllte Viren angewendet werden, die komplexe Entschichtungsprozesse durchlaufen.

Wie bereits diskutiert, in Endosomen Grundierung erforderlich, um die IAV Kern uncoating kompetent zu machen. Protonierung des Kerns schwächt Wechselwirkung von M1 und vRNPs (zusammengesetzt aus den viralen RNA, NP und die Polymerase-Komplex PB1 / PB2 / PA). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn ankommende Virus zu einem pH-Wert von 6,5 ausgesetzt (oder niedriger) in frühen Endosomen (EBS) und wird fortgesetzt, bis die Virus-Sicherungen bei etwa pH 5,0 in LEs. <p class="jove_content"...

Die Demontage von Influenza-A-Viruskernen während des Viruseintritts in Wirtszellen ist ein mehrstufiger Prozess. Wir beschreiben eine in vitro Methode, um die frühen Stadien der viralen Enthüllung zu analysieren. Bei diesem Ansatz wird die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation verwendet, um die Schritte, die die Entschichtung unter definierten Bedingungen einleiten, biochemisch zu zerlegen.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Das übergeordnete Ziel dieser Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation besteht darin, Influenza-A-Virus-Kapside unter Bedingungen zu analysieren, die dem endozytotischen Milieu ähneln, dem eindringende Viren während des Zelleintritts begegnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Desassemblierung von Influenza-A-Virus-Kapsiden während des Zelleintritts zu beantworten, beispielsweise den spezifischen Effekt eines leicht sauren pH-Werts auf die Kapsidstabilität. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine quantitative Analyse des Uncoating-Prozesses von Influenza-A-Viren unter definierten experimentellen Bedingungen ermöglicht.Neben der Aufklärung darüber, wie die Entmäntelung des Influenza-A-Virus eingeleitet wird, kann diese Methode auch zur Untersuchung anderer umhüllter Viren mit verwandten Entmäntelungsmechanismen angewandt werden. Die Durchführung der Methode demonstriert Firat Nebloglu, ein ehemaliger Student aus meinem Labor. Nachdem die Puffer- und Reagenzvorräte gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, bereiten Sie für jede zu testende pH-Bedingung eine Detegentpuffer-Master-Mischung vor, indem Sie neun Milliliter 1-molarer Natriumchloridlösung, sechs Milliliter 10 % NP40, 2,4 Milliliter der 25fach konzentrierten Proteaseinhibitor-Stocklösung und neun Milliliter zweifach destilliertes Wasser miteinander vermischt. Dann pipettieren Sie für jede pH-Bedingung 4,4 Milliliter der Master-Mix-Lösung in ein 50-Milliliter-Konischglas. Für pH-Werte über 5,8 geben Sie 0,6 Milliliter der jeweiligen pH-adjustierten 500 Millimolaren Tris-Stammlösung in das Gefäß. Für pH-Werte von 5,8 und darunter fügen Sie 0,6 Milliliter der jeweiligen pH-adjustierten 500 Millimolaren MES-Stammlösung hinzu.Stellen Sie fünf Milliliter Pufferlösung her, die 300 Millimolar Natriumchlorid, 2X Proteaseinhibitor, 60 Millimolar Tris, angepasst auf pH 7,4, und doppelt destilliertes Wasser enthält. Dies dient als pufferfreie Kontrollpufferlösung ohne Tensid. Geben Sie anschließend fünf Milliliter der 50 %igen Glycerol-Standardlösung zu je fünf Milliliter der Puffermischungen mit und ohne Tensid, wodurch sechs verschiedene 25 %ige Glycerollösungen entstehen.Verwenden Sie pH-Streifen, um die pH-Werte zu überprüfen. Bereiten Sie eine 15 %ige Glycerinlösung vor, indem Sie ein Mischverhältnis von drei zu sieben aus der 50 %igen Glycerin-Standardlösung mit destilliertem Wasser ansetzen. Geben Sie mithilfe einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer Nadel jeweils drei Milliliter der 15 %igen Glycerinlösung in sechs ultrareine Zentrifugenröhrchen.Spülen Sie die Nadel nach jedem Schritt mit doppelt destilliertem Wasser aus. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze und eine lange Nadel, um vorsichtig 3,4 Milliliter einer 25 %igen Glycerinlösung unter die 15 %ige Glycerinschicht zu injizieren, wobei darauf geachtet werden muss, dass beide Schichten nicht vermischt werden. Eine Grenzfläche zwischen den beiden Schichten ist deutlich sichtbar.Wiederholen Sie dies für alle sechs Bedingungen, um sie mit den jeweiligen pH-adjustierten Glycerinlösungen zu testen. Verwenden Sie anschließend in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse II ein Milliliter geklärte, verdünnte Allantoisflüssigkeit, die Influenza-A-Virus enthält, um die Glycerin-Gradienten vorsichtig zu überlagern. Überführen Sie die Röhrchen in Rotorkübel, balancieren Sie gegenüberliegende Röhrchen aus und platzieren Sie sie sorgfältig in einen vorgekühlten SW-41-Ultrazentrifugationsrotor.Zentrifugieren Sie bei 2100 U/min und 12 Grad Celsius für 150 Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig beide Glycerolschichten mit einer sauberen Pasteurpipette und einem Aspirator. Suspendieren Sie dann das Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vollständig in 40 Milliliter 1X nicht-reduzierendem LDS-Probenpuffer, bevor Sie die Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Um die SDS-PAGE durchzuführen, erhitzen Sie alle Proben 10 Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Geben Sie 20 Mikroliter der aufgelösten Pellets auf ein vorgefertigtes Gradienten-Bis-Tris-Mini-Gel und laufen Sie eine Stunde lang bei 200 Volt in 1X MOPS-SDS-Laufpuffer. Inkubieren Sie das Gel eine Stunde lang in der Fixierungslösung.Ein- bis zweimal mit Wasser spülen und über Nacht in einer 15 cm Zellkultur-Schale mit ausreichendem Volumen an kolloidaler Coomassie-Lösung unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur einfärben. Das Gel in doppelt destilliertem Wasser entfärben, wobei die Flüssigkeit alle 15 bis 20 Minuten erneuert wird, bis der Hintergrund des Gels klar ist. Das Gel in doppelt destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius aufbewahren, bis es zur Bandenquantifizierung gescannt wird.Scannen Sie schließlich das Gel mit hoher Auflösung und verwenden Sie handelsübliche, speziell angefertigte Software zur Quantifizierung der Intensitäten der Proteinbänder. Subtrahieren Sie das Hintergrundsignal eines Bereichs nahe den jeweiligen Banden und normalisieren Sie die Werte relativ zu den wertangaben der kontrollprobe ohne tensid. In diesem experiment wurde x31, gewonnen aus geklärter allantoisflüssigkeit, einer geschwindigkeitsgradientenzentrifugation bei ph-werten zwischen 7,4 und 5,0 unterzogen und mittels sds-page analysiert.Ohne Tensid im Gradienten werden intakte Virionen abgeschichtet, was sich im charakteristischen Bandenmuster der Coomassie-gefärbten Gelelektrophorese widerspiegelt, das HA, NP und M1 darstellt. Durch Zugabe von NP40 zur unteren Glycerolschicht wurden die virale Hülle einschließlich HA, NA und M2 solubilisiert, und allein der virale Kern sedimentierte während der Ultrazentrifugation im Pellet. Beginnend bei einem pH-Wert unterhalb von 6,5 geht M1 schrittweise aus der Pelletfraktion verloren und erreicht ein Minimum zwischen pH 5,8 und pH 5,4.Unterhalb von pH 5,8 wurden vRNPs dissoziiert und gingen somit im Überstand verloren. Aus den analysierten Proteinbanden ergaben sich zwei unterschiedliche pH-Schwellenwerte für die Disassemblierung der M1-Schicht bzw. die Dissoziation von vRNP-Bündeln, nämlich pH 6,5 und pH 5,8. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass je nach Influenza-A-Virusstamm oder Mutante unterschiedliche Disassembliereigenschaften beobachtet werden können.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Erkenntnisse, beispielsweise über die Struktur isolierter Influenzavirus-Kapside, zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer...

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren...

Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Lernen Sie die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation zur Analyse der Influenza-A-Virus-Kapsidzerlegung unter endosomähnlichen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht quantitative Einblicke in den Entkapselungsprozess.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

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