In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Das übergeordnete Ziel dieser Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation ist es, Influenza-A-Virus-Kapside unter Bedingungen zu analysieren, die dem endozytären Milieu nachempfunden sind, auf das eingehende Viren beim Zelleintritt treffen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie sich Kapside des Influenza-A-Virus während des Zelleintritts zersetzen, wie z. B. die spezifische Wirkung eines leicht sauren pH-Werts auf die Kapsidstabilität. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine quantitative Analyse des Entschichtungsprozesses des Influenza-A-Virus unter definierten experimentellen Bedingungen ermöglicht.

wie die Enthüllung von Influenza-A-Viren eingeleitet wird, kann diese Methode auch auf die Untersuchung anderer Hüllviren mit verwandten Enthüllungsmechanismen angewendet werden. Das Verfahren wird von Firat Nebloglu, einem ehemaligen Studenten aus meinem Labor, vorgeführt. Nach der Vorbereitung von Stammpuffern und Reagenzien gemäß dem Textprotokoll für jede zu prüfende pH-Bedingung wird der Detergenzpuffer-Mastermix hergestellt, indem neun Milliliter eines molaren Natriumchlorids, sechs Milliliter 10 % NP40, 2,4 Milliliter des 25X-Proteaseinhibitorbestands und neun Milliliter doppelt destilliertes Wasser gemischt werden.

Pipettieren Sie dann für jede pH-Bedingung 4,4 Milliliter des Mastermixes in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bei pH-Werten über 5,8 geben Sie 0,6 Milliliter der jeweiligen pH-eingestellten 500 millimolaren Tris-Stammlösung in das Röhrchen. Für pH-Werte von 5,8 und niedriger fügen Sie 0,6 Milliliter der jeweiligen pH-eingestellten 500 millimolaren MES-Stammlösung hinzu.

Stellen Sie fünf Milliliter Pufferlösung her, die 300 millimolares Natriumchlorid, 2X Proteaseinhibitor, 60 millimolare Tris, angepasst an pH 7,4, und doppelt destilliertes Wasser enthält. Dieser dient als waschmittelfreier Kontrollgradientenpuffer. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter der 50%igen Glycerinbrühe zu fünf Millilitern der waschmittelhaltigen und waschmittelfreien Puffermischungen hinzu, wodurch sechs verschiedene 25%ige Glycerinlösungen entstehen.

Verwenden Sie pH-Streifen, um die pH-Werte zu überprüfen. Bereiten Sie eine 15%ige Glycerinlösung vor, indem Sie ein Verhältnis von drei zu sieben von 50%iger Glycerinbrühe mit destilliertem Wasser mischen. Geben Sie mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer Nadel drei Milliliter 15%ige Glycerinlösung in sechs ultraklare Zentrifugationsröhrchen.

Waschen Sie die Nadel nach jedem Schritt in doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze und eine lange Nadel, um vorsichtig 3,4 Milliliter 25%ige Glycerinlösung unter die 15%ige Glycerinschicht zu injizieren, wobei Sie darauf achten, dass die beiden Schichten nicht vermischt werden. Eine Schnittstelle zwischen beiden Schichten ist deutlich sichtbar.

Wiederholen Sie dies für alle sechs Bedingungen, um mit den jeweiligen pH-angepassten Glycerinlösungen zu testen. Verwenden Sie anschließend in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II einen Milliliter geklärte, verdünnte Allantoisflüssigkeit, die das Influenza-A-Virus enthält, um die Glyceringradienten sanft zu überlagern. Übertragen Sie die Röhrchen in Rotorbecher, balancieren Sie die gegenüberliegenden Röhrchen aus und setzen Sie sie vorsichtig in einen vorgekühlten SW-41-Ultrazentrifugationsrotor ein.

Zentrifugieren Sie 150 Minuten lang bei 2100 U/min und 12 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine saubere Pasteurpipette und einen Aspirator, um beide Glycerinschichten vorsichtig zu entfernen. Anschließend wird das Pellet mit 40 Millilitern 1X nicht reduzierendem LDS-Probenpuffer durch Auf- und Abpipettieren vollständig resuspendiert, bevor die Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird.

Um SDS-PAGE durchzuführen, erhitzen Sie alle Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Laden Sie 20 Mikroliter der gelösten Pellets auf ein vorgefertigtes Bis-Tris-Minigel und lassen Sie es eine Stunde lang bei 200 Volt in einem 1X MOPS SDS-Laufpuffer laufen. Inkubieren Sie das Gel eine Stunde lang in Fixierlösung.

Ein- bis zweimal mit Wasser abspülen und über Nacht in einer 15 Zentimeter großen Zellkulturschale mit einer ausreichenden Menge kolloidaler Coomassie-Lösung färben, während sie bei Raumtemperatur leicht geschüttelt wird. Entfärben Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser und ersetzen Sie die Flüssigkeit alle 15 bis 20 Minuten, bis der Gelhintergrund klar wird. Lagern Sie das Gel in doppelt destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius, bis es zur Bandenquantifizierung gescannt wird.

Scannen Sie schließlich das Gel mit hoher Auflösung und verwenden Sie eine kommerziell erhältliche, maßgeschneiderte Software zur Quantifizierung der Proteinbandenintensitäten. Subtrahieren Sie das Hintergrundsignal aus einem Bereich in der Nähe der jeweiligen Bänder und normalisieren Sie die Werte auf die waschmittelfreien Regelwerte. In diesem Experiment wurde X31, das aus geklärter allantoischer Flüssigkeit gewonnen wurde, einer Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation bei pH-Werten zwischen 7,4 und 5,0 unterzogen und mit SDS-PAGE analysiert.

Ohne Detergens im Gradienten werden intakte Virionen pelletiert, was sich in dem charakteristischen Muster von Banden widerspiegelt, die HA, NP und M1 im Coomassie-gefärbten Gel darstellen. Nach Zugabe von NP40 zur unteren Glycerinschicht wurde die Virushülle, einschließlich HA, NA und M2, solubilisiert und der Viruskern allein während der Ultrazentrifugation in das Pellet sedimentiert. Ab einem pH-Wert unter 6,5 geht M1 allmählich aus der Pelletfraktion verloren und erreicht ein Minimum zwischen pH 5,8 und pH 5,4.

Unterhalb eines pH-Werts von 5,8 wurden vRNPs dissoziiert und gingen somit aus dem Pellet verloren. Aus den analysierten Proteinbanden wurden zwei unterschiedliche pH-Schwellenwerte für den Abbau der M1-Schicht und die Dissoziation von vRNP-Bündeln aufgedeckt, darunter pH 6,5 bzw. pH 5,8. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass je nach Influenza-A-Virusstamm oder Mutante unterschiedliche Zerlegungseigenschaften beobachtet werden können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Erkenntnisse wie die Struktur isolierter Influenzavirus-Kapside zu gewinnen.