Name: Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Erfahren Sie, wie Wnt-Signaling bei der Musterbildung der Luftwege untersucht wird. Diese Methode mit Reporter-Mäusen und Färbetechniken ermöglicht die Analyse embryonaler Gewebe zur Erforschung der Trachealentwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir erkennen die Unterstützung von Mike Muntifering und Matt Kofron mit konfokaler Bildgebung und Gail Macke mit histologischen Verfahren. Diese Arbeit wurde teilweise von der National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS) unterstützt.

Die Tiere wurden in pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Die Mäuse wurden nach Protokollen genehmigt durch CCHMC Institutional Animal Care und Use Committee (Cincinnati, OH USA) behandelt. Mäuse in diesen Studien verwendet wurden, in einem gemischten Hintergrund gehalten. 1. Ganze Berge X-Galactosidase-Färbung <ol><li> Euthanize schwangere Frau bei E11,5 bis E14,5, durch CO 2 Inhalation. Setzen Sie Tiere in CO 2 Kammer, laden Sie die Kammer mit CO 2. Pflegen Sie Tiere in der Kammer für mindestens 5 min. Führen Sie sekundäre Methode der Euthanasie durch Genickbruch. </li><li> Saubere Bauchbereich mit Ethanol (EtOH) 70% und führen Laparotomie mit einem einzigen Bauchmittelschnitt. Nutzen chirurgische Scheren und Standardmuster (gerade gesägten) Zange. </li><li> Isolieren Gebärmutterhörner Zange und einer feinen Schere verwenden und sofort setzen Gewebe in Petrischale gekühlt enthaltenden PBS-Lösung. Pflegen Gewebe auf Eis, bis Sie fortfahrenzur Isolierung von Embryonen. </li><li> Isolieren Embryonen von Gebärmutterhörner. Präparieren embryonale trachealen Lungengewebe Binokular mit. Nutzen Sie feine Spitze Pinzette und Schere zu halten und das Gebärmuttergewebe durchlöchern und concepti die Embryonen freizugeben. <ol><li> Entfernen Eihüllen bleiben. Mit Hilfe von Nadelklingen geschnitten Kopf von Embryonen und unteren Körperteil unterhalb des Zwerchfells. Finde Leber als Wahrzeichen. </li><li> Nach Isolierung des Thoraxbereich des Embryos, gehen lateralen Seiten der Körperwand, der Wirbelsäule und des Herzens unter Verwendung von Nadelklingen zu entfernen. Achten Sie darauf, während das Herz Entfernen zu vermeiden Luftröhrengewebe zu verletzen. Schließlich vorsichtig, trennen Sie die Speiseröhre aus der Luftröhre durch die Speiseröhre mit Hilfe von Nadelblätter ziehen. Pflegen Gewebe in PBS-Lösung auf Eis. </li></ol></li><li> Platz Gewebe in 4 ml Schraubdeckel Fläschchen unter Verwendung von Glas oder Transferpipetten. Fix trachealen Lungengewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30 min. Nach der Fixierungspülen Gewebe mit PBS. Während dem Spülen X-gal - Färbung - Lösung ( je 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 &amp; mgr; l 0,5 M Lager) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 &amp; mgr; l 0,5 M Lager) 2 mM MgCl 2, vorbereiten ( 20 &amp; mgr; l 1 M Lager) 0,01% NaDOC (50 &amp; mgr; l 2% Lager), 0,02% NP 4 O (100 &amp; mgr; l 2% Lager), 1 mg / ml X-gal (500 &amp; mgr; l von 20 mg / ml Brühe) und 9,13 ml Wasser destilliert, um ein Endvolumen von 10 ml zu bringen). </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden PBS und 2 ml X-gal-Färbung Lösung für das Glasfläschchen. Legen Sie Fläschchen in Fach auf Schüttler. Stain Gewebe 1 bis 2 h in X-gal-Färbelösung. Inkubieren des Gewebes in X-gal-Lösung für 4 Stunden zur weiteren Verarbeitung und Einbettung. </li><li> Die Reaktion durch Waschen Gewebe in 3% Dimethylsulfoxid-PBS. Spülen in PBS, 3-mal für jeweils 5 min waschen und lagern in 70% Ethanol. </li><li> Füllen Petrischalen mit einem 1% Agarose / PBS-Lösung. Lassen Sie Agarose erstarren. Mit Glastransferpipetten, legen Sie das Gewebe auf Agarose-coated Platten mit PBS-Lösung gefüllt. Fotografieren ganze Halterungen ein Binokular mit. Wählen Sie den entsprechenden Filter für Hell. </li><li> Um besser zu Websites von X-gal-Färbung Prozessproben für Paraffineinbettung und Schneiden unterscheiden. Prüfmuster in feinen Rasterkassetten. <ol><li> Zur Verarbeitung von Proben für die Paraffineinbettung eines automatisierten Prozessor verwenden und einen kurzen Zyklus wie folgt aufgestellt: sechs Änderungen von Alkohol: 5 min erste Änderung und 3 min pro jede verbleibende Veränderung. Drei Änderungen von Xylen: 5 min erste Änderung und 3 min nächsten zwei Änderungen. Die vorherigen Schritte werden bei 30 ° C durchgeführt wird. Schließlich führen drei Änderungen von Paraffin bei 62 ° C: 25 min, 8 min und 5 min. </li></ol></li><li> Orient Proben zum Einbetten mit Gewebe einzubetten Boot flach auf dem Boden liegend. Sorgfältig Paraffin fügen Sie das Einbetten von Boot zu füllen. Kühlen Sie sofort auf kalte Platte Station bis Paraffin erstarrt der Einbettung. Entfernen Block vom Boot einbetten. Mit einem Mikrotom, erzeugen 6 um sexionen. Berg Abschnitte auf vorbehandelte Spangen und trockenen Folien auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde. </li><li> Backen Sie gleitet über Nacht in einem Ofen bei 56 ºC. Die Objektträger in Racks. Deparaffinisieren Träger mit drei Änderungen von 100% Xylen, jeweils 10 min. Verwenden Sie Schalen gefüllt mit 200 ml Xylen Färbung. </li><li> Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 1 min pro Schritt) zu PBS, bevor sie für 10 bis 30 sec mit Nuclear Fast Red Gegenfärbung. Spülen Sie Objektträger mit Leitungswasser dreimal für jeweils 5 min über Kernechtrot zu entfernen. </li><li> Entwässern Dias in einer abgestuften EtOH-Serie (50%, 70% und 100% EtOH) vor dem Waschen in drei Änderungen von Xylen (20 taucht jede Änderung) und Abdeckung Abrutschen mit Xylen auf Basis Eindeckmedien. </li></ol> 2. Lektin Färbung <ol><li> Präparieren E13.5 und E14.5 trachealen Lungengewebe als 1,1 bis 1,4 in Schritten beschrieben. Mit Glastransferpipetten Ort Gewebe in Schraubdeckel Fläschchen. Fix trachealen Lungengewebe mit 2 ml2% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Nach der Fixierung spülen Proben in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. </li><li> Bereiten Blocking-Puffer, in der Regel um ein Endvolumen von 10 ml Lösung. Mit 0,1 g BSA (1%) auf 8 ml PBS. Erlauben BSA aufzulösen. Fügen 0,2 ml Ziegenserum (2%) 0,03 ml von Triton X-100 (0,3%). Bringen Endvolumen auf 10 ml mit PBS. Block Proben für 1 Stunde in 0,5 ml Puffer bei Raumtemperatur blockiert. </li><li> Entfernen Blockierungspuffer eine Transferpipette und ersetzen mit Lektin Lösung, die aus 50 ug / ul Lektin, 10% Ziegenserum und PBS. Verwenden Sie 250 ul Lektinlösung pro Probe. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, das Glas Fläschchen mit Gewebe mit Aluminiumfolie zu bedecken. Nach Inkubation mit Lektin-Lösung gründlich Proben in PBS dreimal für 10 min. </li><li> Platz Explantate in Agarose-beschichteten Petrischalen genug PBS, die Proben zu decken. Fotografieren ganze Halterungen ein Fluoreszenz-Binokular mit. Wählen Sie das geeignet friate Filter zur Detektion Fluoreszenz. Lectin PNA ist in der Regel an GFP gekoppelt. </li></ol> 3. Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie <ol><li> Isolieren trachealen Lungengewebe, Transfer zum 4 ml Glas Schraubverschluss Fläschchen und fixieren über Nacht in 4% PFA. E11,5 Gewebe kann in 2% PFA fixiert werden. Shop in Methanol 100%. Die Proben können bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Entfernen Sie unter Verwendung von Methanol Transferpipette und Permeabilisierung Proben Dent Bleach mit (4 Teilen Methanol, 1 Teil DMSO und 1 Teil 30% H 2 O 2) für 2 Stunden. Hydrats Gewebe in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 100% Methanol, 75% Methanol, 50% Methanol, 25% Methanol, 100% PBS. Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur während jeder Stufe der Hydratisierung. </li><li> Block Gewebes in 0,5% Blockierungsreagenz in PBS verdünnt (siehe Materialien für Details) für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren. </li><li> Verdünnte primärer Antikörper in BlockingLösung (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) und Inkubation Proben über Nacht bei 4 ° C. Waschproben mit PBS fünfmal bei Raumtemperatur. Führen Sie jede Wäsche für 1 Stunde. </li><li> Anwenden sekundären Antikörper bei einer 1: 500-Verdünnung in 0,5% Blockierungslösung. Wählen Sie sorgfältig Sekundärantikörper Bindung zwischen Sekundärantikörper zu verhindern. über Nacht bei 4 ° C in einem dunklen Raum inkubieren. Waschproben dreimal für 20 min bei Raumtemperatur. Dehydratisieren Proben in einer abgestuften Reihe von Methanol in PBS verdünnt, wie folgt: 25% Methanol, 50% Methanol 75% Methanol, 100% Methanol, 10 min jeden Schritt. Stellen Sie sicher, dass die Proben mit Aluminiumfolie bedeckt bleiben und minimieren Belichtung: HINWEIS. Gewebe kann nun bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden, bis photographiert. </li><li> Transfer - Proben , um benutzerdefinierte Stufe Platten, entfernen Methanol und klar mit etwa 200 ul Murrays klare Lösung 19,20 (2 Teile Benzylbenzoat, 1 Teil Benzylalkohol) sofort befErz-Bildgebung. Fotografieren Sie mit einem konfokalen Mikroskop. Verarbeitung und Analyse von Bild Imaging-Software. </li></ol> 4. Zellproliferation <ol><li> Injizieren E11.5 trächtigen Mäusen intraperitoneal mit einer Lösung von BrdU in einer Konzentration von 100 ug BrdU / g Körpergewicht. Sacrifice weiblich, wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben und isolieren Embryonen bei E12,5 oder E13.5. Mit Messerklingen, die Verbrauchs Köpfe und unteren Teil des Körpers unterhalb Brusthöhle. </li><li> Legen Sie thorakalen Gewebe in 4 ml Fläschchen Kappe schrauben und reparieren in 1 ml 4% PFA über Nacht. Waschproben mit PBS zweimal für 5 min und entwässern Proben durch eine Ethanolreihe in destilliertem Wasser bis zu 70% Ethanol verdünnt, wie folgt: 30%, 50% und 70% Ethanol, 5 min jeden Schritt. <ol><li> Prüfmuster in mittlerer Größe Bildschirm-Kassetten. Prozess Gewebe für Paraffineinbettung mit und automatisierten Prozessor. Stellen Sie einen Zyklus wie folgt zusammen: sechs Änderungen von Alkohol für jeweils 8 min, drei Änderungen von Xylen für 6 min jeweils drei cHanges von Paraffin, 25 min, 9 min und 8 min. </li></ol></li><li> Einbetten in Paraffin, das Gewebe in gewünschte Position auszurichten 6 um quer zu erzeugen oder Längsschnitte, wie in Abschnitt 1. Platz Abschnitte auf Folien beschrieben und ermöglichen Gewebe haften auf Folie wärmer Satz bei 42 ° C für 1 Stunde gleiten. </li><li> Backen Sie Dias, auf ihren Seiten, über Nacht in einem Ofen bei 56 ° C. Die Objektträger in Kunststoff-Racks. De-Paraffin säubern Folien durch Eintauchen in drei Änderungen von 100% Xylene, 10 min pro Wechsel. Verwenden 200 ml Xylol vollständig zu Folien unterzutauchen. Rehydrieren Folien unter Verwendung von abgestuften Serie EtOH (100%, 70%, 50% und 30%, 5 min pro Schritt unter Rühren) zu PBS (5 min). </li><li> Führen Antigen-Retrieval 10 mM Citratpuffer, pH 6 Zu 100 ml Citratpuffer Mischung 18 ml 0,1 M Citrat-Citronensäure-monohydrat und 82 ml 0,1 M Natrium herzustellen. <ol><li> Platz Proben in Kunststoff Färbetrog gefüllt mit Antigen-Retrieval-Lösung und Mikrowelle für 6,5 min bei hoher Leistung. In distilled Wasser Glasküvette für verdampfte-Citrat-Puffer und reheat bei 40% Leistung für 6 min zu kompensieren. </li><li> Füllen Sie Coplin Glas mit Wasser nach oben, und aufwärmen wieder bei 40% Leistung für 6 min. Mikrowelle Zeiten können auf Mikrowelle benutzt variieren. </li><li> Erlauben Folien für 20 min bei Raumtemperatur vor dem Waschen Folien in destilliertem Wasser für 1 min, gefolgt von PBS für 5 Minuten abkühlen lassen. Nach dem PBS waschen Blockobjektträger für 2 Stunden in TBS Blockierungslösung (2,425 g Tris-Base und 8,765 g NaCl verdünnt in 1 l destilliertem Wasser) 10% Eselserum und 1% BSA enthält. </li></ol></li><li> Hinzufügen primären Antikörpern, verdünnt in Blockierlösung (TBS, enthaltend 10% Eselserum und 1% BSA). BrdU (Mitose-Marker), Nkx2.1 (Atemwege Epithel), Sox9 (Zellen, die wird Anlass zu Knorpel geben) und αSMA (glatte Muskelzellen). Inkubiere Objektträger über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie Overlay-Methode Antikörper zu erhalten. Bewerben 180 ul Antikörper an eine Dichtung und befestigen Sie dann Schieber als ob DeckglasKlingeln. </li><li> Trennen Dichtung durch Schieber in destilliertes Wasser getaucht wird. Nach dem Entfernen der Dichtung, nicht gebundenen primären Antikörper waschen von sechs 5 min wäscht Durchführung mit TBS 0,1% Tween-20 enthält. <ol><li> Inkubiere Objektträger mit Antikörper Sekundär verdünnten Lösung bei einer Verdünnung von 1 in Blockierungs: 200, 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wählen Sekundärantikörper sorgfältig unerwünschte Bindung zwischen ihnen zu verhindern. Entfernen ungebundenen sekundären Antikörper, indem es drei 5 Minuten Waschungen mit TBS, das 0,1% Tween. </li><li> Waschen Sie Folien in 0,1 M Tris-Base zweimal für 5 min und dann 0,05 M Tris-Base zweimal für 5 min. Die Objektträger können in 0,05 M Tris-Base gelassen werden, während coversliping mit Montage Medien mit oder ohne DAPI (1,5 ug / ml). Shop Dias in Dia-Ordner bei 4 ° C und vor Licht schützen, indem Ordner mit Aluminiumfolie abdecken. </li></ol></li><li> Visualisieren Färbung und Fotografie unter Verwendung eines automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Graf markierte Zellen und Gesamt Zellen pro Feld fotografiert bei20X und 40X, um zu bestimmen Verhältnisse von Zellen zu Gesamtzellen vermehren. </li></ol>

<ol><li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li>
<li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+for+the+first+breath%3A+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li>
<li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+the+foregut+tube%3A+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2%2F2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li>
<li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li>
<li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li>
<li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BEndodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li>
<li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li>
<li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc%2C+BMP4%2C+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li>
<li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+%28OP%29+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin%2FMrtf-B+and+Fgf10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li>
<li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal%2Fdistal+cell+fate+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li>
<li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li>
<li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+in+large+insect+brains%3A+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+%28Shh%29+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li>
<li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;Die Autoren haben nichts zu offenbaren.&quot;

Veranstaltungen der Morphogenese der Atemwege zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, insbesondere die für die Strukturierung der leitenden Atemwege erforderlichen Prozesse. Frühere Studien haben ex vivo - Techniken verwendet , wobei die Entwicklung Explantate kultiviert werden an der Luft-Flüssigkeit - Zwischenphasen - oder eingebettet in Matrigel 21,22. Diese Studien haben gezeigt, wie Wachstumsfaktoren, die Strukturierung der Entwicklungs Trachea und die Bildung von Trachealknorpels be...

Respirationstrakt Entwicklung wird durch embryonaler Tag 9 (E9) mit dem Auftreten von Nkx2.1 - positiven Zellen in der Bauch endodermalen foregut 1,2 eingeleitet. Ösophagus-Trachealtubus Trennung wird durch E11.5 lösen , wenn die Rohre als getrennte Einheiten unterschieden werden kann, die jeweils 3 durch mesenchymale Gewebe umgeben. Wnt - Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle in der Spezifikation des Respirationstraktes wie Deletion Wnt2 und Wnt2b durch die splanchnic Mesenchym und Löschung von β-Catenin von der endodermalen respiratorischen Epithels exprimiert wird in Lunge agenesis 4,5 führen. Unsere früheren Studien festgestellt , dass das Löschen von Wls, einer Ladung Rezeptor vermittelnde Sekretion aller Wnt - Liganden, von den endodermaler Atemwege führt zu Lungenhypoplasie, Mängel bei der pulmonalen Gefäßentwicklung und Fehl Strukturierung der trachealen Mesenchyms 6,7. Diese Daten unterstützen die Bedeutung der epithelial-mesenchymalen cross sprechen bei der Zelldifferenzierung und der Beschreibung , wie es auch in anderen Studien 8,9 gezeigt wurde. Die Untersuchung der frühesten Stadien der Lungenentwicklung stützt sich auf genetische, in vitro und ex vivo - Techniken , die uns besser erlaubt haben , Mechanismen zu verstehen , Atem Identität Fahr 16.10. Ganze Lunge Explantatkulturen am Luft Flüssigkeit Interphase wurden in frühen Stadien der Lungenverzweigungs Morphogenese 10,17,18 die Effekte der Wachstumsfaktoren zu untersuchen weithin verwendet. Während dieses Verfahren als Auslesen von morphologischen Veränderungen verwendet wird, wie beispielsweise Verzweigungs Morphogenese und Genexpressionsmodulation, ist es für das Studium der frühen Stadien des Entwicklungsprozesses begrenzt, da die Kultur selbst nicht die Entwicklung der Vaskulatur 17 unterstützt. Entwicklung Trachealknorpels erfordert längere Inkubationszeiten, die nicht mit dieser Kultur-Technik kompatibel sind. Um Analyze die Rolle der Wnt-Signal während der Atemwege Bildung haben wir Standardtechniken angepasst auf die Bedürfnisse unserer embryonalen Studien zu erfüllen. Wir haben Volumina geändert, Färbungszeiten, Bearbeitungs Radfahren für Paraffineinbettung und den Zeitpunkt für die Reinigung der Tracheal-Lungengewebe. Das Hauptziel der Techniken in der vorliegenden Studie beschrieben Optimierung war die frühesten Stadien der trachealen Entwicklung bei Mäusen zu analysieren, die von E11 bis E14,5 stattfinden. Unter Verwendung der Reportermäuse Linie Axin2LacZ wir genau bestimmten Stellen von Wnt / β-Catenin - Aktivität in der Entwicklung von trachealen Mesenchym. Wir haben auch Lektin Färbeverfahren für ganze Berg Luftröhrengewebe angepasst. So konnten wir mesenchymalen Verdichtungen zu visualisieren und zu Websites, vorherzusagen, wo Chondrogenese stattfinden wird. Die Färbung der ganze Berg und Abschnitte von embryonalem Gewebe erhalten von WlsShhCre Mäuse, gepaart mit erweiterten Mikroskopietechniken, erlaubt uns , die Rolle der Wnt - Liganden durch die tra produziert zu enthüllenCheal Epithel in trachealen Musterung.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , Kaninchen</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, Kaninchen</td></tr><tr><td>Anti Glatte Muskulatur Aktin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, Maus</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, Meerschweinchen</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, Maus</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, Schaf</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, Maus</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Lebenstechnologien</td><td></td><td>Alexa Fluor Molekulare Sonden</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Bestandteil des TSA-Kits #2&nbsp; &nbsp; &nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc Kassetten Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsiekassetten</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Erhältlich in verschiedenen Farben</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&nbsp; Kernechtrot 0,1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat dreibasisches Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Mikromesser</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 keramikbeschichtet</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Weitfeldmikroskop</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokalmikroskopie. Einstellungen:NikonA1 plus Kamera, Scanner: Galvano, Detektor:DU4. Optik Plan Apo lambda 10X. Modalität: Weitfeld-Fluoreszenzlaser konfokal.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Automatisiertes Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr></tbody></table>

studieren wnt signaling während patterning of conducting airways

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt-Signalwege spielen eine entscheidende Rolle während der Entwicklung der Atemwege. Die Definition präziser Mechanismen der Differenzierung und Morphogenese, die durch den Wnt-Signalweg gesteuert werden, ist erforderlich, um zu verstehen, wie Gewebe während der normalen Entwicklung strukturiert sind. Dieses Wissen ist auch entscheidend für die Bestimmung der Ätiologie von Geburtsfehlern wie Lungenhypoplasie und Tracheobronchomalazie. Die Analyse der frühesten Entwicklungsstadien der Atemwege stellt eine Herausforderung dar, da die begrenzte Menge an Gewebe die Durchführung von Standardprotokollen verhindert, die besser für postnatale Studien geeignet sind. In diesem Artikel diskutieren wir Methoden zur Untersuchung der Zelldifferenzierung und -proliferation in den Atemwegen. Wir beschreiben Techniken wie die Färbung des gesamten Passepartouts, die Verarbeitung des Gewebes für die konfokale Mikroskopie und die Immunfluoreszenz in Paraffinschnitten, die bei der Entwicklung der trachealen Lunge angewendet werden. Wir diskutieren auch Methoden zur Untersuchung der Differenzierung des trachealen Mesenchyms, insbesondere der Knorpelbildung. Die in der vorliegenden Arbeit diskutierten Ansätze und Techniken umgehen die Begrenzung des Materials bei der Arbeit mit embryonalem Gewebe und ermöglichen ein besseres Verständnis des Strukturierungsprozesses bei der Entwicklung leitender Atemwege.

Wnt / β-Catenin-Aktivität Ganze Berge Lac-Z - Färbung wurde in Tracheal-Lungengewebe von Embryonen aus Reporter Axin2 Lac -Z Mäuse 11 getrennt nachgewiesen werden . Seiten der Färbung zeigen Wnt / β-Catenin-Aktivität. Analyse von Abschnitten ganze Berg Färbung bestimmt, dass Wnt / β-Catenin-Aktivität im Mesenchym der Trachea vorhanden war und in Mesenchym der peripheren Regionen der En...

Die Verwendung von Reporter - Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und in - vivo - Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen.

Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Das übergeordnete Ziel der Färbeprozeduren besteht darin, die Rolle des Wnt-Signalwegs in den frühen Entwicklungsstadien der oberen Atemwege an embryonalem Gewebe genetisch veränderter Mausmodelle zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Pulmobiologie zu beantworten, beispielsweise wie die Stützstrukturen der Leitungsbahnen angeordnet werden.Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen es uns, die Zellproliferation oder den Prozess der mesenchymalen Kondensationen zu untersuchen, die Schlüsselereignisse bei der Bildung des Tracheaknorpels darstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie an geringen Mengen von Gewebe angewendet werden kann. Dazu gehören Lungen-Explantate sowie aus E11-Embryonen isolierte Tracheen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in diesem Verfahren sind, aufgrund der Größe der Probe sowie der begrenzten Menge an verfügbarem Gewebe Schwierigkeiten haben. Man muss sich im Umgang mit embryonalen Geweben sicher fühlen, was erreicht wird, indem man während der gesamten Schritte aufmerksam bleibt und sicherstellt, dass von Schritt zu Schritt dieselbe Menge an Gewebe zur Verfügung steht. Nach der Tötung eines trächtigen weiblichen Mäuses zwischen E11,5 und E14,5 und Durchführung einer Laparotomie gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie eine Pinzette und feine Schere, um die Uterushörner zu isolieren, und legen Sie das Gewebe unverzüglich in eine Petrischale mit gekühlter PBS-Lösung.Danach die Schale auf Eis stellen. Um die Embryonen aus den Uterushörnern zu isolieren, das Uterusgewebe mit feiner Pinzette festhalten. Anschließend mit einer Schere das Uterusgewebe und den Embryonalverbund anstechen, wodurch die Embryonen freigesetzt werden.Entfernen Sie anschließend alle verbleibenden embryonalen Membranen. Schneiden Sie dann unter dem Stereomikroskop mit Nadelskalpellen den Kopf sowie den unteren Körperabschnitt unterhalb des Zwerchfells ab, und identifizieren Sie die Leber als Orientierungspunkt. Entfernen Sie mithilfe der Nadelskalpellen die seitlichen Teile der Körperwand, die Wirbelsäule und das Herz.Unter Vorsicht darauf zu achten, das Tracheagewebe nicht zu verletzen. Um das embryonale Trachea-Lungengewebe zu präparieren, trennen Sie die Speiseröhre vorsichtig von der Luftröhre, indem Sie mit Nadelspitzen die Speiseröhre wegziehen. Legen Sie das Gewebe in PBS auf Eis, bevor Sie es mit Glas- oder Transferpipetten in Vials aus Glas mit Vier-Millimeter-Schraubverschluss überführen.Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd oder PFA in PBS hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Spülen Sie das Gewebe anschließend mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS von den Proben geben Sie zwei Millimeter X-gal-Anfärbungslösung hinzu und inkubieren eine bis zwei Stunden lang oder vier Stunden für eine weitere Verarbeitung und Einbettung.Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Gewebe dreimal für jeweils fünf Minuten mit 3 % DMSO in PBS waschen. Anschließend lagern Sie das Gewebe in 70 % Ethanol. Nach der Verarbeitung der Proben gemäß dem schriftlichen Protokoll mithilfe eines automatisierten Geräts zur Paraffineinbettung orientieren Sie die Proben so, dass das Gewebe flach auf dem Boden eines Einbettungsbootes liegt.Paraffin vorsichtig hinzufügen, um das Einbettungsboot zu füllen, und sofort auf die Kühlplatte der Einbettungsstation stellen, bis das Paraffin erstarrt. Danach den Block aus dem Einbettungsboot entfernen und mit einem Mikrotom sechs Mikrometer dicke Schnitte anfertigen. Anschließend die Schnitte auf Objektträger aufbringen.Und legen Sie die Schnitte eine Stunde lang auf eine erwärmte Objektplatte bei 42 Grad Celsius. Backen Sie die Objektträger über Nacht in einem Ofen bei 56 Grad Celsius. Entfernen Sie dann das Paraffin aus den Proben, indem Sie die gebackenen Objektträger in Gestelle geben und sie dreimal nacheinander für jeweils 10 Minuten in Färbewannen mit jeweils 200 Milliliter 100 % Xylol überführen.Verwenden Sie eine abgestufte Ethanolreihe, um die Objektträger jeweils eine Minute lang zu rehydrieren. Färben Sie die Proben anschließend mit Nuclear Fast Red für 10 bis 30 Sekunden als Gegengefärbung. Spülen Sie die Objektträger danach dreimal je fünf Minuten mit Leitungswasser ab.Um die Objektträger zu dehydrieren, verwenden Sie eine abgestufte Ethanolreihe, bevor Sie die Proben dreimal mit Xylol waschen. Anschließend montieren Sie die Proben mit einem Xylol-basierten Eindeckmedium und Deckgläsern. Für die Lektinfärbung überführen Sie die Proben nach Fixierung des Lungen- und Trachealgewebes und Herstellung des Blockierpuffers gemäß dem Textprotokoll in 0,5 Milliliter Blockierpuffer und inkubieren sie eine Stunde bei Raumtemperatur.Entfernen Sie mit einer Transferpipette den Blockierpuffer und ersetzen Sie ihn durch 250 µL Lektinlösung pro Probe. Bedecken Sie die Glasgefäße anschließend mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag spülen Sie die Proben mit PBS und geben die Explantate in mit Agarose beschichtete Petrischalen, die so viel PBS enthalten, dass die Proben bedeckt sind.Verwenden Sie dann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop, um die Ganzpräparate zu fotografieren. Um eine Immunfluoreszenz-Färbung an Ganzpräparaten durchzuführen, entfernen Sie nach der Fixierung der Proben gemäß dem Textprotokoll das Methanol mit einer Transferpipette und geben anschließend konzentrierte Bleichlauge hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe zwei Stunden lang, um die Proben permeabilisierbar zu machen. Hydratisieren Sie das Gewebe durch Inkubation bei Raumtemperatur jeweils zehn Minuten pro Schritt, indem Sie eine abgestufte Reihe von in PBS verdünntem Methanol verwenden.Nach der Blockierung des Gewebes gemäß dem Textprotokoll primäre Antikörper und Blockierungslösung hinzufügen und die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nachdem die Proben mit PBS gewaschen wurden, eine Verdünnung von 1 zu 500 sekundärer Antikörper in PBS hinzufügen und die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Am folgenden Tag die Proben nach dreimaligem Waschen je 20 Minuten in PBS mit einer abgestuften Methanolreihe in PBS dehydrieren, wobei jeder Schritt 10 Minuten dauert.Überführen Sie die Proben in maßgefertigte Objektträgerplatten. Entfernen Sie das Methanol. Verwenden Sie anschließend 200 Mikroliter Murray's Clear-Lösung, um die Proben zu klären.Bild sofort mit einem konfokalen Mikroskop aufnehmen. Nach der Injektion trächtiger Mäuse im Stadium E11.5 mit BrdU und der Isolierung der Embryonen zu den Zeitpunkten E12.5 oder E13.5 gemäß dem Textprotokoll die embryonalen Köpfe sowie die unteren Körperteile unterhalb der Brusthöhle mit Messerklingen entfernen. Das Brustgewebe in Vials mit Vier-Milliliter-Schraubverschluss geben und ein Milliliter 4 % PFA hinzufügen.Nach dem Einbetten, Schneiden und Rehydratisieren der Proben gemäß dem Textprotokoll die Objektträger in Coplin-Becher geben und mit 10 mm Zitratpuffer, pH 6, auffüllen. Die Proben sechs Minuten und dreißig Sekunden lang bei hoher Leistung in der Mikrowelle erhitzen, dann das verdunstete Zitratpuffer mit destilliertem Wasser ersetzen und erneut erhitzen. Nach dem Abkühlen, Waschen und Blockieren der Objektträger gemäß dem Textprotokoll 180 µL primäre Antikörper, in Blockierungslösung verdünnt, auf eine Dichtung geben und den Objektträger darauflegen, als ob ein Deckglas angebracht würde.Am folgenden Tag die Objektträger in destilliertem Wasser eintauchen, um die Dichtung zu lösen. Anschließend die Objektträger sechsmal je fünf Minuten mit TBS, ergänzt mit 0,1 % Tween 20, waschen. Nach der Inkubation der Objektträger mit sekundären Antikörpern die Objektträger zweimal je fünf Minuten mit 0,1 molarer Tris-Basis waschen, gefolgt von zwei weiteren Wäschen mit 0,05 molarer Tris-Basis.Die Objektträger während des Hinzufügens des Eindeckmediums, mit oder ohne DAPI, in 05 molarer Tris-Basis belassen. Danach ein Deckglas aufsetzen. Abschließend die Proben mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop aufnehmen und gemäß dem Textprotokoll analysieren. In dieser Abbildung von ganzmontierten Tracheal-Lungengewebe, isoliert von Reporter- und zwei lacZ-Mäusen, wurde die lacZ-Färbung im Mesenchym der Trachea sowie in den peripheren Bereichen der sich entwickelnden Lungen nachgewiesen, was auf Wnt-beta-Catenin-Aktivität hinweist.In diesem Experiment wurden Trachea-Lungengewebe von E12,5 bis E14,5 mit PNA-Lektin gefärbt. Bei Kontrolltieren wurde Fluoreszenz als periodische Bänder im Mesenchym nachgewiesen, wo sich Knorpel bildet. Der fehlende Nachweis bei Wntless sonic hedgehog Cree-Embryonen zeigt jedoch, dass die Wnt-Signalübertragung für mesenchymale Verdichtungen notwendig ist.Im Ganzpräparat des Trachealgewebes von E11,5-Embryonen ist die Expression von SOX9 auf das Mesenchym beschränkt und erscheint als durchgehender Streifen, während im sich entwickelnden Lungengewebe SOX9 am Rand des respiratorischen Epithels nachgewiesen wird. Wie hier gezeigt, ist NKX2.1 auf das Epithel der Trachea beschränkt. Die Verhinderung der Sekretion von Wnt-Liganden aus dem Epithel verringert die Expression von SOX9 im Mesenchym, hat jedoch keinen Einfluss auf die SOX9-Expression im peripheren Lungene­pithel.Die Färbung für Alpha-Smooth-Muscle-Aktin wird in geringem Maße im Trachealgewebe nachgewiesen, ist jedoch im Larynx und Magen deutlich sichtbar. Schließlich zeigt – wie in dieser Abbildung dargestellt – die In-vivo-Markierung von Trachealgewebe mit BrdU, SOX9 und Alpha-Smooth-Muscle-Aktin, dass SOX9-gefärbte Zellen eine höhere Proliferationsrate aufweisen als Alpha-Smooth-Muscle-Aktin-gefärbte Zellen. Im Trachealgewebe von Wntless Sonic Hedgehog Cre-Tieren kehrt sich das Proliferationsmuster um.Wenn man diese Techniken einmal beherrscht, können die meisten korrekt durchgeführt innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Auswählen des sekundären Antikörpers die Herkunft des primären Antikörpers zu berücksichtigen. Dies ist bei allen Immunfärbungen wichtig, besonders jedoch, wenn mehr als ein primärer Antikörper verwendet wird.Nach der X-Galactosidase-Färbung können zusätzliche Techniken wie die In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um weitere Informationen zu erhalten und zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise ob ein bestimmtes Gen von Interesse während der Wnt-Signalgebung exprimiert wird. Die hier vorgestellten Techniken sind für Forscher nützlich, die an stillen Musterbildungsmechanismen interessiert sind, die durch die Wnt-Signalgebung oder andere wichtige Signalwege in der Entwicklung vermittelt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Differenzierungsprozesse während der Entwicklung der Atemwege untersucht.Und gewinnen außerdem ein besseres Verständnis für die Rolle der Wnt-Signalübertragung bei der Musterbildung der leitenden Atemwege. Vergessen Sie nicht, bei der Arbeit mit Paraformaldehyd und Benzylbenzoat die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, wie das Tragen von Handschuhen, das Ansetzen von Lösungen im Abzug und die Entsorgung von Abfalllösungen gemäß den örtlichen Gesetzen und Vorschriften.

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

Primäre Zilien beeinflussen verschiedene Signalwege. Die Cochlea von Säugetieren ist ideal für die Untersuchung der Signalübertragung der planaren Zellpolarität (PCP). Die Dysfunktion der Zilien beeinflusst das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterung und die Ausrichtung der Haarzellen, die Messwerte des PCP. Unser Ziel ist es, die PCP-Signalübertragung in der Cochlea der Maus mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren.

Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Ein Protokoll für die Kultur und Manipulation von embryonalem Gewebe der Maus auf einem mikrofluidischen Chip wird bereitgestellt. Durch die Anwendung von Impulsen von Signalwegmodulatoren kann dieses System verwendet werden, um Signalschwingungen für die funktionelle Untersuchung der Maussomitogenese extern zu steuern.

Ein mikrofluidischer Ansatz zur funktionellen Untersuchung von Signalschwingungen, die die Somitogenese steuern

Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro  zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.

Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Dieser Artikel beschreibt in vivo und in vitro Methoden zur Charakterisierung der thymusabsetzenden Vorläuferzellen durch die Analyse der Kinetik der Erzeugung, des Phänotyps und der Anzahl ihrer T-Zell-Nachkommen.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Erfahren Sie, wie Wnt-Signaling bei der Musterbildung der Luftwege untersucht wird. Diese Methode mit Reporter-Mäusen und Färbetechniken ermöglicht die Analyse embryonaler Gewebe zur Erforschung der Trachealentwicklung.

Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways

Weitere Videos entdecken