Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein mikroskaliges Probenahmegerät, die Single-Probe, zu entwickeln, um lebende Einzelzellen mittels Massenspektrometrie unter Umgebungsbedingungen zu analysieren. Und um umgebungsmassenspektrometrische Bildgebung von biologischen Geweben mit hoher räumlicher Auflösung durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in biologischen und pharmazeutischen Studien zu beantworten.

Zum Beispiel, welche Moleküle in lebenden Einzelzellen vorhanden sind und wie sie im Gewebe verteilt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich bei der Einzelsonde um ein multifunktionales Gerät handelt, das sowohl für die Analyse lebender Einzelzellen als auch für hochauflösende Bildgebungsexperimente der Umgebungsmassenspektrometrie verwendet werden kann. Obwohl diese Methode einzelne Zellen und Gewebe analysieren kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen eine mikroskalige Probenahme wünschenswert ist, wie z. B. die Sparanalyse von Chemikalien und lebenden Mikrokolonien und Biofilmen.

Das Verfahren wird mit mir von Wei Rao, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Platzieren Sie ein ganzes Mausorgan von Interesse in der Mitte einer kleinen Plastikmulde. Tauchen Sie das Organ bis zu einer Höhe von ca. 10 mm in eine Gewebeeinbettungsmasse ein.

Legen Sie das Taschentuch sofort in flüssigen Stickstoff zum Schockfrosten. Um den Gewebeschnitt der Maus vorzubereiten, nehmen Sie das gefrorene Mausorgan und tauen Sie es in einem temperaturkontrollierten Kryo-Mikrotom auf 15 Grad Celsius auf. Befestigen Sie das Gewebe auf einer Stahlbasis mit ca. 500 Mikrolitern Gewebeeinbettmasse und legen Sie es auf eine Kryo-Mikrotom-Schnitthalterung, so dass dem Messer die gewünschte Schnittausrichtung präsentiert wird.

Schneiden Sie das Gewebe auf eine Dicke von 12 Mikrometern. Legen Sie dann die geschnittenen Gewebescheiben auf Polycarbonat-Objektträger und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Entnehmen Sie eine Zellprobe, z. B. 1 Milliliter HeLa-Zellsuspension, und geben Sie sie in 9 ml vollständiges Zellkulturmedium in einer standardmäßigen 10-cm-Zellkulturplatte.

Halten Sie die Zellen zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in Kultur, bis die Wachstumsfläche bei 70-80 % auf der Zellkulturplatte bedeckt ist. Führen Sie die Zellpassage in der Zellkulturplatte durch. Aspirieren Sie dazu das Wachstumsmedium und spülen Sie die Zellen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Entfernen Sie das PBS mit einer sterilen Aspirationsspitze und inkubieren Sie die Zellen mit 2,5 ml Trypsin für etwa 5 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen von der Kulturplatte zu lösen. Stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie 7,5 ml vollständiges Zellkulturmedium hinzufügen und die Zellen dann gleichmäßig resuspendieren. Um die Zellproben für ein Einzelzell-Massenspektrometrie-Experiment (SCMS) vorzubereiten, legen Sie zunächst einzelne Mikroabdeckungsobjektträger in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte.

Geben Sie dann 1,8 ml Zellkulturmedium und 0,2 ml Zellsuspension in die Vertiefung. Mischen Sie die Zellen vorsichtig unter leichtem Rühren der Platte, bevor Sie sie etwa 24 Stunden lang in einer Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um eine medikamentöse Behandlung der kultivierten Zellen durchzuführen, geben Sie eine Wirkstofflösung in die 12-Well-Zellkulturplatte.

Legen Sie den Quarzschlauch mit doppelter Bohrung in einen Laser-Mikropipettenabzieher und ziehen Sie eine Quarznadel mit doppelter Bohrung. Stellen Sie als Ausgangspunkt die Hitze auf 400, das Filament auf drei, die Geschwindigkeit auf 80, die Verzögerung auf 150 und den Zug auf 250 ein. Schneiden Sie die Zugspitze so ab, dass am anderen Ende noch etwa 5 mm ungezogene Quarzkapillare mit doppelter Bohrung übrig sind.

Schneiden Sie einen 80 mm langen Abschnitt einer Quarzglaskapillare als lösemittelliefernde Kapillare ab. Führen Sie dann die Kapillare in eine Bohrung am flachen Ende der Quarznadel mit zwei Bohrungen ein. Verwenden Sie die Flamme, um eine Quarzglaskapillare als nanoESI-Emitter zu ziehen, schneiden Sie sie auf eine Länge von 7-10 mm und führen Sie sie in die andere Bohrung am flachen Ende der Quarznadel mit zwei Bohrungen ein.

Tragen Sie eine minimale Menge UV-härtendes Harz auf das flache Ende der Quarznadel mit zwei Bohrungen auf. Verfestigen Sie das Harz mit einer LED-UV-Lampe für ca. 20 Sekunden, um die lösemittelliefernde Kapillare und den nanoESI-Strahler zu sichern. Schneiden Sie als Nächstes einen Standard-Objektträger aus Mikroskopglas der Länge nach in zwei Hälften.

Platzieren Sie dann die Einzelsonde auf einem Ende des Objektträgers, so dass der nanoESI-Emitter nach außen zeigt. Tragen Sie das normale Epoxidharz auf den Körper der Einzelsonde auf, so dass es auf dem Objektträger befestigt ist, bevor Sie es über Nacht zum Aushärten stehen lassen. Dieses System umfasst einen kundenspezifischen Ionenquellen-Schnittstellenflansch des Massenspektrometers und eine optische Aluminiumplatine, die mit einem USB-Digitalmikroskop, einem manuellen Miniatur-XYZ-Translationstisch und dem motorisierten XYZ-Translationstischsystem verbunden ist.

Modifizieren Sie den Flansch der Ionenquellenschnittstelle des Massenspektrometers und stellen Sie das Stativ des digitalen Stereomikroskops her, wie im Textprotokoll beschrieben. Befestigen Sie das modifizierte digitale Stereomikroskop, ein USB-Digitalmikroskop, einen manuellen Miniatur-XYZ-Translationstisch mit flexiblem Klemmhalter und das motorisierte XYZ-Translationstischsystem an der optischen Aluminiumplatine. Verwenden Sie den flexiblen Klemmhalter, um den Glasschlitten zu befestigen, der mit einer Einzelsonde befestigt ist.

Befestigen Sie dann den Einzelsondenaufbau an das Massenspektrometer. Stellen Sie den flexiblen Klemmhalter und den Miniatur-XYZ-Tisch so ein, dass der Emitter der Einzelsonde vor dem Einlass des Massenspektrometers platziert wird. Tauen Sie den Probenabschnitt bei Raumtemperatur auf und legen Sie ihn auf das motorisierte XYZ-Translationstischsystem unter der Einzelsonde.

Passen Sie die Probenposition an, indem Sie die Koordinaten in der Steuerungssoftware ändern. Verwenden Sie eine Spritze, um das Probenahmelösungsmittel mit einer angemessenen Geschwindigkeit zu pumpen. Und dann legen Sie die Ionisationsspannung an.

Die Höhe der Einzelsonde ist so einzustellen, dass sie knapp über der Oberfläche der Probe aufliegt und eine Oberflächenextraktion von Metaboliten durchführen kann. Heben Sie den Z-Tisch vorsichtig an und verwenden Sie dann das USB-Digitalmikroskop, um die Abstandsänderung zwischen der Einzelsondenspitze und der Gewebeoberfläche zu überwachen. Legen Sie die Parameter für das Rastern des interessierenden Abschnitts innerhalb des Beispiels fest.

Verwenden Sie für die hier vorgestellten Mausnierenschnitte eine Rastergeschwindigkeit von 10 Mikrometer pro Sekunde und einen Abstand von 20 Mikrometern zwischen den Zeilen. Legen Sie die Parameter für das Rastern des interessierenden Abschnitts innerhalb des Beispiels fest. Verwenden Sie für die hier vorgestellten Mausnierenschnitte eine Rastergeschwindigkeit von 10,0 Mikrometer pro Sekunde und einen Abstand von 20 Mikrometern zwischen den Zeilen.

Aufbau einer Methode zur automatisierten Erfassung von MS-Spektren aus dem Massenspektrometer. Für eine MSI mit hoher Massenauflösung an einer Mausnierenprobe verwenden Sie eine Massenauflösung von 60.000, einen positiven 5-kV-Modus, 1 Mikroscan, eine maximale Injektionszeit von 150 Millisekunden und eine automatische Verstärkungsregelung. Initiieren Sie die MSI-Datenerfassung, und erstellen Sie dann MS-Images aus MS-Rohdateien, wie im Textprotokoll beschrieben.

Richten Sie das System mit einer Sonde gemäß den Anweisungen für MSI ein und stellen Sie die Lösungsmitteldurchflussrate ein. Waschen Sie die kultivierten Zellen, die an den Microcover-Glasobjektträgern befestigt sind, mit PBS, um Kulturmedien und extrazelluläre Arzneimittelkomponenten zu entfernen. Legen Sie dann den zellhaltigen Objektträger für das Experiment auf das motorisierte XYZ-Translationstischsystem.

Fokussieren Sie das digitale Stereomikroskop über der Probe auf die Spitze der Einzelsonde, um die Zellpenetration während der Analyse zu überwachen. Verwenden Sie das USB-Digitalmikroskop an der Seite der Einzelsonde, um die Arbeitsbedingungen des nanoESI-Emitters auf der Einzelsonde zu überwachen. Verwenden Sie das motorisierte XYZ-Tischsteuerungsprogramm und das digitale Stereomikroskop, um eine Zelle von Interesse zu lokalisieren und die Einzelsondenspitze präzise über der Probe zu positionieren.

Starten Sie die MS-Datenerfassung, bevor die Einzelsondenspitze in die Zelle eingeführt wird. Senken Sie die zellhaltige Platte nach unten, um die Einzelsondenspitze aus der Zelle zu ziehen. Lassen Sie das Lösungsmittel schließlich etwa drei Minuten lang fließen, um die Einzelsonde vollständig zu spülen.

Die umgebungsmassenspektrometrische Bildgebung von Nierenschnitten von Mäusen wurde durchgeführt, und eine große Anzahl von Molekülen, die auf der Gewebeoberfläche vorhanden sind, kann nachgewiesen werden. Die räumliche Verteilung und die relative Häufigkeit mehrerer Moleküle auf der Gewebeoberfläche wurden aufgetragen. Eine räumliche Auflösung von 8,5 Mikrometern wurde durch die Beobachtung scharfer Übergänge von Merkmalen in den Massenspektrometriedaten erreicht.

Die Herstellung der Einzelsonde mit einer scharfen Spitze und offenen Kanälen ist für die Einzelzellanalyse von entscheidender Bedeutung. Mikroskope werden benötigt, um die Zielzellen zu lokalisieren und den Prozess der Zellpenetration zu überwachen. Die Signaländerung von Massenspektren liefert auch zusätzliche Informationen, um die Zellpenetration zu bestätigen.

Eine große Anzahl von Molekülen wurde aus lebenden Einzelzellen nachgewiesen. Bei der Verwendung für Studien zu Krebsmedikamenten werden Kontrollzellexperimente verwendet, um den Unterschied zwischen der Behandlung von Krebsmedikamenten zu zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Einzelsonde hergestellt wird und wie dieses Gerät für die massenspektrometrische Analyse von Einzelzell- und Umgebungsmassenspektrometrie-Bildgebung von biologischen Geweben verwendet wird.

Im Allgemeinen könnten Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da detaillierte Anweisungen erforderlich sind, um das Gerät mit einer Sonde herzustellen, das gesamte System einzurichten und die Instrumente zu bedienen. Einmal gemeistert, kann die Einzelzellanalyse kontinuierlich für viele Zellen durchgeführt werden. Und jede Analyse dauert weniger als drei Minuten.

Der Abschluss eines MS-Bildgebungsexperiments in der Umgebung kann je nach Probengröße, räumlicher Auflösung und verwendetem Massenspektrometer einige Stunden dauern. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Herstellung einer hochwertigen Einzelsonde der wichtigste Schritt ist. Darüber hinaus sind die Abstimmung und der Betrieb des Instruments entscheidend für die erfolgreiche Durchführung eines Experiments.

Andere Methoden können nach ähnlichen Verfahren wie den hier vorgestellten entwickelt werden. So können beispielsweise Reagenzien in das Lösungsmittel der Probe gegeben und eine reaktive Einzelzellanalyse sowie MSI bei Umgebungsbedingungen durchgeführt werden, um den Nachweis von Molekülen aus Proben zu verbessern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher sowohl in der Einzelzellanalyse als auch in der massenspektrometrischen Bildgebung unter Umgebungsbedingungen.

Diese Technik kann potenziell für die zellbiologische Forschung, pharmakologische Studien und klinische Tests verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit scharfen Quarzkapillaren und UV-härtendem Epoxidharz gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer UV-Schutzbrille getroffen werden sollten.