Name: Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Erfahren Sie die Single-Probe-Technik für hochauflösende Massenspektrometrie-Bildgebung und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen. Diese Methode ermöglicht präzise molekulare Untersuchungen lebender Zellen und Gewebe.

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Die Autoren möchten sich bei Dr. Laskin (dem Pacific Northwest National Laboratory) für die Bereitstellung der motorisierten Bühnensteuerungssoftware und des MSI-Visualisierungsprogramms bedanken. Wir danken auch Dr. Mao (Universität von Oklahoma) für die Bereitstellung von Organproben von Mäusen und Herrn Chad E. Cunningham (Universität von Oklahoma) für die Unterstützung bei der Bearbeitung und Elektronik. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Forschungsrats des Norman Campus der University of Oklahoma, des American Society for Mass Spectrometry Research Award (gesponsert von der Waters Corporation), des Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152) und der National Institutes of Health (R01GM116116) unterstützt.

Tiernutzung und Wohlergehen sollte von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgende Protokolle überprüft und genehmigt einzuhalten. Maus-Gewebeproben wurden durch Mitarbeiter Dr. Chuanbin Mao zur Verfügung gestellt. 1. Maus Gewebeschnitten Vorbereitung <ol><li> Legen Sie eine ganze Maus Organ von Interesse (Gehirn, Niere, Leber, etc.) in der Mitte eines kleinen Plastik gut (zB 12-Well - Zellkulturplatte) und versenken in Gewebeein Verbindung bis zu etwa 10 mm Höhe. Stellen Sie sicher , dass es keine Blase in der Gewebeein Verbindung gebildet ist und dass das Organ in der gewünschten Ausrichtung platziert wird (dh sagittalen, koronalen, etc.). </li><li> Ab sofort stellen Gewebe in flüssigem Stickstoff für Flash Einfrieren. Für die langfristige Lagerung, speichern Sie die gefrorenen Proben in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Nehmen Sie das Gefriergut Maus Orgel und tauen auf -15 ° C in einem temperature gesteuert Kryoschnittmaschinen. </li><li> Sichere Gewebe auf eine Stahlbasis mit etwa 500 ul Gewebe Einbettmasse und legen auf eine Kryoschnittmaschinen sectioning montieren, so dass die gewünschte Schnitt Ausrichtung ist mit dem Messer dargestellt. </li><li> Abschnitt das Gewebe bis zu einer 12 &amp; mgr; m Dicke. Legen geschnittene Gewebescheiben auf Polycarbonat-Objektträger und lassen für 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Für die langfristige Lagerung, speichern Sie die gefrorenen Folie in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Zellkultur Hinweis: Die Zellkultur wurde in biologischen Sicherheitsschrank (Biosafety Level II) unter sterilen Bedingungen durchgeführt. HeLa-Zelllinie wurde als Modellsystem verwendet, und die Zellen wurden in komplettem Kulturmedium mit den folgenden herkömmlichen Protokollen gezüchtet: <ol><li> Warm Reagenzien (dh, Trypsin, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und Zellkulturmedium) auf 37 ° C. Hinweis: Das Zellkulturmedium enthält anorganische salts, Aminosäuren, Vitamine und andere. Eine vollständige Liste der Bestandteile, beziehen sich auf die Formulierung vom Hersteller. </li><li> Erhalten Zellprobe (zB 1 ml HeLa Zellsuspension) und fügen Sie sie in 9 ml komplette Zellkulturmedium in einem Standard - 10-cm - Zellkulturplatte. Die Anfangszellzahl beträgt etwa 0,5 x 10 6 Zellen / ml. Halten Zellen in Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2-3 Tage , bis die Wachstumsoberfläche bei 70-80% auf der Zellkulturplatte überdeckt ist. Nehmen Sie Zelle Passage-Nummer für jede nachfolgende Runde. </li><li> Führen Zelle Passagierung (dh Zell splitting) in der Zellkulturplatte. <ol><li> Absaugen Wachstumsmedium, und verwenden Sie 5 ml 1x PBS, die Zellen zu spülen. Entfernen PBS eine sterile Absaugspitze verwendet, und Inkubieren der Zellen mit 2,5 ml Trypsin (0,25%) für ~ 5 min bei 37 ° C, die Zellen von der Kulturplatte abzulösen. Anmerkung: Der tatsächliche Trypsin Behandlungszeit optimiert werden müssen entsprechend der spezifischen Trypsin product vom Hersteller bezogen. Eine unzureichende Behandlungszeit lässt die anhaftenden Zellen an der Platte, während eine übermäßige Behandlung zum Zelltod führt. </li><li> Stop Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 7,5 ml kompletten Zellkulturmedium, und dann resuspendieren gleichmäßig um die Zellen (Gesamtvolumen 10 ml). Verwenden Sie die Zellsuspension für Kultur (Schritt 2.2) oder der Zubereitung von SCMS Proben (Schritt 2.4). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Zellproben für SCMS Experimente. <ol><li> Legen Sie einzelne Mikro Abdeckung gleitet in einer 12-Well-Platte, und fügen Sie 1,8 ml Zellkulturmedium und 0,2 ml Zellsuspension in den Brunnen. </li><li> Sanft Zellen unter leichtem Schütteln der Platte, zu mischen und in einer 5% CO 2 -Umgebung bei 37 ° C für ~ 24 Stunden inkubiert. Zur medikamentösen Behandlung zu den kultivierten Zellen durchzuführen, fügen Sie eine Wirkstoff - Verbindung Lösung (zB in DMSO (Dimethylsulfoxid)) in 12-Well - Zellkulturplatte. Hinweis: Die endgültige Arzneimittelkonzentration (beispielsweise 10 nM, 100 nM, 1 uM und 10 uM) und treatment Zeit (beispielsweise 4 h) werden entsprechend dem besonderen Zweck Studien variiert. Die Zellen werden zu den Mikro Abdeckung gleitet und bereit für die CSMS Experimente (Schritt 6) angebracht ist. </li></ol></li></ol> 3. Single-Sonde Fabrication <ol><li> Legen Sie die Dual-Bohrung Quarzrohr (Innendurchmesser (ID) 127 &amp; mgr; m Außendurchmesser (OD) 500 &amp; mgr; m) in eine Laser-Mikropipette Abzieher und ziehen Sie eine Dual-Bohrung Quarz Nadel. Verwenden Sie die folgenden Parameter als Startpunkte: Wärme = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, und Pul = 250 (alle Einheiten sind Hersteller Einheiten). Achten Sie darauf, die gezogen Dual-Bohrung Quarz Nadel hat eine konische Spitze für eine optimale Sondeneigenschaften. Schneiden Sie die Spitze gezogen, so dass es ~ 5 mm lang von unpulled Dual-Bohrung Quarzkapillarsäulen am anderen Ende links. Anmerkung: Die tatsächlichen Parameter des Lasers puller sollten optimiert werden entsprechend den spezifischen Bedingungen des Instruments. </li><li> Schneiden Sie ein ~ 80 mm Abschnitt Quarzglaskapillare (ID 40 &amp; mgr; m, OD. 105 &amp; mgr; m) als Lösungsmittel Bereitstellung Kapillare, und legen Sie sie in eine Bohrung am flachen Ende des Dual-Bohrung Quarz Nadel. </li><li> Schneiden Sie ein ~ 40 mm Abschnitt Quarzglaskapillare (ID 40 &amp; mgr; m, OD 105 &amp; mgr; m) und ein Rasiermesser rasieren ~ 5 mm der Polyimid-Beschichtung von dem mittleren Punkt. Verwenden Sie eine Propanflamme schnell zu erwärmen, und ziehen Sie die fusionierten Kapillare in einem Nano-Elektrospray-Ionisation (ESI) Emitter mit einem feinen Verjüngung. Schneiden Sie ein Nano-ESI-Emitter (~ 7-10 mm lang), und setzen Sie sie in die andere Bohrung am flachen Ende des Dual-Bohrung Quarz Nadel. Alternativ können Sie die Laser-Abzieher eine feine Verjüngung zu erzeugen. </li><li> Tragen Sie eine minimale Menge (~ 1-2 ul) UV-aushärtenden Harzes auf dem flachen Ende des Dual-Bohrung Quarz Nadel und verfestigen das Harz unter Verwendung einer LED-UV-Lampe für ~ 20 Sekunden das Lösungsmittel Bereitstellung Kapillare und die Nano- zu sichern ESI-Emitter. Die Verfahren , die einzelnen Teile in einer einzigen Sonde zu montieren sind in 1a gezeigt. </li><li> Schneiden Sie ein Standardmikroskop glass Schieber (1 &quot;x 3&quot;) in die Hälfte der Länge nach. Legen Sie die Single-Sonde auf ein Ende des Glasobjektträger, so dass die Nano-ESI-Emitter nach außen gerichtet ist. Wenden Sie das regelmäßige Epoxid , um den Körper des Einzel Sonde , so dass es auf den Glasträger (Abbildung 1b) gesichert wird. Lassen Sie über Nacht zum Härten. Paar die hergestellte Single-Sonde mit der integrierten Single-Sonde Setup (Abbildung 1c), die mit einem Massenspektrometer angebracht ist , wie in 1d dargestellt. </li></ol> 4. Bauen Sie die integrierte Einzel-Sonde MS-Setup <ol><li> Ändern Sie die Ionenquelle Trennstellenflansch des Massenspektrometers und fabrizieren den Ständer (mit einstellbarer Position und Höhe) des digitalen Stereoskop (Figuren 1e und 1f). <ol><li> Bohren Sie eine Ionenquelle Trennstellenflansch mit zwei Löchern so dass für die Befestigung eines Aluminium optischen Bord. Machen Sie eine Gleitschiene Vorrichtung und eine Höhenverstellstab (anein XY - Tisch für die Feinpositionsabstimmung), so dass das digitale Stereoskop System kann auf dem Aluminium optischen Platte (1e angebracht sein). </li></ol></li><li> Bringen Sie den modifizierten digitalen Stereo-Mikroskop, ein USB-Digital-Mikroskop, ein Miniatur-Handbuch XYZ-Bühne mit einem flexiblen Klemmhalter, die motorisierte XYZ-Stufen-System an das Aluminium optische Platine, die auf die kundenspezifische Ionenquelle Trennstellenflansch des Massenspektrometers angebracht ist (Figuren 1c und 1f). Verwenden Sie den flexiblen Klemmhalter die Glasobjektträger mit einem Single-Sonde gebunden zu beheben. </li><li> Bringen Sie die Single-Tastkopfeinstellung dem Massenspektrometer (Abbildung 1f). Stellen Sie die flexible Klemmhalter und den Miniatur-XYZ-Stativs dem Emitter des single-Sonde vor dem Einlass des Massenspektrometers zu legen. Verwenden Sie das USB-Digitalmikroskop (mit einstellbarem Betrachtungswinkel) auf der Seite der Single-Sonde, die eine gezoomte in Bild des Einzel p zu liefernRobe Spitze oder die Nano-ESI-Emitter und die digitale Stereoskop (mit einstellbarer Höhe) über dem Single-Sonde die Zellen und die Sondenspitze zu sehen. Hinweis: ausgestattet mit Umgebungs Ionisierungsquellen die entsprechenden Ionenquelle Flansch Mit dieser integrierten Single-Sondensystem kann auf alle anderen Arten von Massenspektrometern gekoppelt werden. </li></ol> 5. Ambient MSI <ol><li> Auftauen Probenabschnitt bei Raumtemperatur und legen Sie es auf den motorisierten XYZ-Stufen-System unter dem Single-Sonde. Stellen Sie die Probenposition durch die Koordinaten in der Steuersoftware zu ändern. </li><li> Die Spritze mit der Sampling - Lösungsmittel bei einer geeigneten Rate (beispielsweise 0,2 &amp; mgr; l / min), und Anwendung der Ionisationsspannung (zB 5 kV) zu pumpen. Die Auswahl des Probenahme Lösungsmittel ist flexibel, und die häufigsten sind MeOH: Wasser (9: 1) und Acetonitril. Das Totvolumen des nano-ESI-Emitter wurde geschätzt ~ 3 nl zu sein, und die Zeit zwischen dem Sonden surface Kontakt und Ionensignal Beobachtung ist in der Regel weniger als 1 sec 15. Anmerkung: Die kundenspezifische Ionenquelle Trennstellenflansch ermöglicht die Ionisationsspannung von dem Massenspektrometer zu einer leitenden Verbindung durch eine Krokodilklemme zu liefern. Die Ionisationsspannung wird dann durch eine leitfähige Vereinigung mit dem Lösungsmittel in der Kapillare und die einzelnen Sondenkanälen übertragen, und auf die Nano-ESI-Emitter angelegt, um die abgetastete Analyten zu ionisieren. Stellen Sie sicher, dass die Ionisierung Spannung abgeschaltet wird, wenn die Krokodilklemme mit dem leitenden Vereinigung zu verbinden. </li><li> Stellen Sie die Höhe der einzelsträngigen Sonde, so daß sie gerade über die Oberfläche der Probe aufliegt und in der Lage oberflächen Extraktion von Metaboliten auszuführen. Heben Sie den Z-Bühne, und verwenden Sie dann den USB-Digitalmikroskop (auf der Seite der Single-Sonde), um die Abstandsänderung zwischen der Single-Sondenspitze und Gewebeoberfläche zu überwachen. Überwachen Sie Änderungen im Massenspektrum in dieser Höhenverstellung und stoppen Aufzuging der Z-Stufe, wenn eine Änderung des Ionensignals von Lösungsmittel Hintergrund Gewebe Metaboliten beobachtet wird. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.3 dreimal für automatisierte Oberflächen Abflachung Anpassung drei verschiedenen Punkten innerhalb der Bühne Steuerprogramm einzustellen. Die Spitze der einzelsträngigen Sonde an drei Punkten auf der Probenoberfläche in einem Abstand von etwa 10 mm voneinander entfernt sind. Führen Höhenverstellung durch Drücken auf die Taste und den Abwärtspfeil, und verriegeln Sie die drei Punkte in die richtige Position unter dem &quot;Plan-Methode&quot;. </li><li> Legen Sie ggf. weitere Parameter für die über den Abschnitt von Interesse in der Probe mit diesem Programm Rasterung. Für die Maus Nierenschnitten hier dargestellt, mit einem 10,0 um / s Rasterung Geschwindigkeit und 20 &amp; mgr; m Abstand zwischen den Linien. Das motorisierte Stufen-System verfügt über eine 0,1 um minimale Inkrement Bewegung. Der Abstand zwischen der einzelnen Sondenspitze und Gewebe aus Schritt 5.3 erhalten. </li><li> Legen Sie ein Verfahren zur automatisierten Erfassung von MS-Spektren aus dem Massenspektrometer nach oben. for hohe Massenauflösung MSI auf Maus Nierenprobe, verwenden Sie die folgenden Parameter: Massenauflösung 60.000 (m / Dm), ~ 5 kV positiven Modus, 1 Micro, 150 ms max Einspritzzeit und AGC auf. Alle erfassten MS-Spektren einzelnen Zeilen des Bildes darstellen MS hatten die gleiche Anzahl von Abtastungen mit gleichförmigen Zeitabstand zwischen jeder Abtastung, die anzeigt, dass die Pixelgrößen für die erzeugten Bilder wurden gleichmäßig verteilt. </li><li> Starten Sie die MSI-Datenerfassung. Starten Sie die MS Erfassungssequenz für das Massenspektrometer und dann die Rasterung Sequenz für das XYZ-Steuerprogramm zu initiieren. <ol><li> Zum Beispiel gehen in der MS-Datenerfassungsprogramm hier genutzt, um &quot;Sequence Setup&quot;, wählen Sie &quot;Neue Sequenz&quot;, erzeugen eine Reihe von Dateien für eine neue Sequenz von 01 bis X nummeriert, wobei X die Anzahl der Zeilen für die verwendete gewünschte MS Bild genommen werden, und dann &quot;Run-Sequenz&quot; drücken. </li><li> Verwenden Sie eine selbst gemachte elektronische Gerät die Software zu ermöglichen, eine Conta zu produzierenct Schließsignal für das Massenspektrometer, um die Daten zu sammeln. Der Schaltplan wird in der zusätzlichen Abbildung (Abbildung S1) als Referenz gezeigt. </li></ol></li><li> Konstruieren Sie MS Bilder aus rohen MS-Dateien mit entsprechenden MSI-Visualisierungs-Software. Zum Beispiel, wenn das Software - Paket von Laskin Gruppe am PNNL 17 entwickelt wurde, führen Sie die folgenden Schritte aus . <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Brows Datei.&quot; Wählen Sie die erste Datei aus dem MSI-Experiment erhalten. Angeben, wo die Datei startet und endet unter &quot;Anzahl der Kanäle.&quot; Wählen Sie einen Bereich von m / z - Werte für die MS - Bildbereich unter &quot;Enter MZ Range&quot;. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; die Bildentstehungsprozess zu initiieren. Sobald die MS Bild gemacht, klicken Sie auf &quot;Bild speichern&quot; unter &quot;Symbolleiste&quot; Bilder im Computer zu speichern. </li></ol></li></ol> 6. In-situ - Live - SCMS <ol><li> Richten Sie die Single-Sondensystem, wie pro anweisenIonen für MSI. Stellen Sie das Lösungsmittel (zB MeOH / H 2 O oder Acetonitril) Strömungsrate (zB ~ 25 nl / min). </li><li> Waschen der kultivierten Zellen, die auf den Mikrodeckglasobjektträger angebracht sind, mit PBS Kulturmedien und die extrazelluläre Wirkstoffkomponenten zu entfernen. Legen Sie Zelle mit Glasträger auf den motorisierten XYZ-Stufen-System für das Experiment. Hinweis: Alternativ können Sie die frische Zellkulturmedium (ohne fötales Rinderserum), um die kultivierten Zellen zu spülen. Weniger Ionensuppression beobachtet. Darüber hinaus können Zellen für eine längere Zeit während des Experiments überstehen, wo die Umgebungstemperatur (~ 20 ° C) wesentlich niedriger als die Züchtungstemperatur (37 ° C). Die Arzneimitteltyp, Lösungskonzentration und Behandlungszeit variieren in verschiedenen Studien. </li><li> Fokus des digitalen Stereo-Mikroskop (über der Probe) auf die Spitze der Single-Sonde Zellpenetration bei der Analyse zu überwachen. Verwenden Sie das USB-Digitalmikroskop (auf der side der Single-Sonde), um die Arbeitsbedingungen der Nano-ESI-Emitter auf der Single-Sonde zu überwachen. </li><li> Verwenden Sie den motorisierten XYZ-Bühne Steuerprogramm und digitale Stereo-Mikroskop (oben Zellen), um eine Zelle von Interesse zu suchen, und positionieren genau die Single-Sondenspitze über die Probe. MS beginnen Datenerfassungs- bevor die einzelsträngige Sondenspitze in die Zelle eingeführt wird. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Parameter als Referenz für die MS-Analyse ein hochauflösendes Massenspektrometer: Massenauflösung 100.000 (m / Dm), ~ 3 kV positiven und negativen Modus, 1 Micro, 150 ms max Einspritzzeit, AGC-Modus auf. Automatische Übernahme von MS-Spektren wird durch Klicken auf &quot;Start&quot; in der MS-Datenerfassungsprogramm. </li><li> Heben Sie den motorisierten Z-Bühne durch Klicken auf das Symbol der Zellmembran und halten die Aufzeichnung der MS-Signal aus der Zelle erzeugt einzudringen. Eine Zeitverzögerung von 1-2 sec ist in der Regel zwischen der Sonde und dem Einsetzen MS Signalerfassungs beobachtet. Als die andere BestätigungZellpenetration, kann eine dramatische Veränderung der MS-Signale auf die Penetration der Zellmembran beobachtet werden. Die MS-Signale der intrazellulären Verbindungen können in der Regel für dauern ~ 15-20 Sekunden vor eine deutlich verringern. </li><li> Weiter unten der Zellenplatte die einzelnen Sondenspitze aus der Zelle zu ziehen, enthält. Es dauert in der Regel &lt;15 sec für die Ionensignale der zellulären Verbindungen um den Geräuschpegel zu nähern. Lassen Sie den Lösungsmittelfluss für ~ 3 min vollständig die Single-Sonde spülen zu. Inzwischen positionieren Sie den motorisierten System XYZ-Bühne die nächste Zelle zu lokalisieren analysiert werden. Jede Zelle erfordert Experiment ~ 3 min durchgeführt werden. </li></ol></li></ol>

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Wir haben keinen Interessenkonflikt mit der hier vorgestellten Arbeit zu erklären.

Die einzelsträngige Sonde ist ein Multifunktionsgerät, das für beide MSI und SCMS-Experimente verwendet werden kann. Die Single-Sonde Setup (einschließlich Übersetzung Bühnensysteme, Mikroskope, Ionenquelle Trennstellenflansch, etc.) wird als Add-On - Komponente entwickelt , die an das bestehende Massenspektrometer flexibel angepasst werden kann. Ein schneller Austausch zwischen der Single-Sonde Setup und der herkömmlichen ESI-Ionenquelle kann innerhalb einer Minute erreicht werden. Im Prinzip die entsprechende Ionenquelle Trennstellenflansch verwendet, kann die Single-Sonde Setup auf die alle anderen Massenspektrometern angepasst werden. Zusätzlich kann die Probennahme Lösungsmittel eine Vielzahl von Reagenzien enthält, die mit dem Einzelsondenaufbau für reaktive MSI und SCMS-Experimente verwendet werden, die stark die Detektion breitere Bereiche von Biomolekülen verbessert. Neben tierischen Geweben und Zelllinien, ist die Single-Sonde ebenfalls in der Lage andere biologische Systeme wie Pflanzen analysiert. Daher kann mit dem gleichen Versuchsaufbau undähnlichen Benutzertraining kann eine Vielzahl von Studien durchgeführt werden, um ein einzelnes Instrument und durch den gleichen Benutzer, so dass für eine effiziente und vielseitige Experimente mit der minimalen Trainingszeit und Instrumentierungs Kosten erreicht werden. Die Schlüsselkomponente des Single-Sonde MS-Technik ist die Sonde selbst. Die Qualität der Single-Sonde hat einen wesentlichen Einfluss auf die Leistung, die weitgehend die Qualität der beiden MSI und SCMS Experimente bestimmt. Bei Single-Sonden Herstellung, stellen Sie sicher, dass die Kapillaren innerhalb des Dual-Bohrung Schläuche sind sicher die Möglichkeit, Lösungsmittelleck während der Versuche zu beseitigen geklebt. Es ist wichtig, eine minimale Menge an UV-härtbarem Epoxid zu verwenden, so dass die Öffnungen und Kapillaren werden nicht während der Sondenherstellung verstopft. Die Single-Sonde verwendet wurde 15 hoher räumlicher und Massenauflösung Umgebungs MSI auf biologischen Proben durchzuführen. Der große Vorteil der Umgebungs MSI überNicht-Umgebungs Verfahren ist , dass die Probenvorbereitung zumindest ohne die Notwendigkeit einer Vakuumprobennahme Umgebung gehalten wird, die die Probe 8 in einer nahezu nativen Zustand analysiert werden können. Eine der größten Hürden für die meisten anderen Umgebungs MSI Technik hat einen Mangel an räumlicher Auflösung 1 gewesen. Verglichen mit der Desorption basiert MSI Techniken (wie DESI und LAESI), die kleine Spitze Größe der einzelsträngigen Sonde ermöglicht eine robuste und effiziente Oberflächenflüssigkeit Mikroextraktion über einen kleinen Bereich durchgeführt werden, was zu einer hohen räumlichen Auflösung von 8,5 um, die zu den höchsten 15 Umgebungs MSI Techniken erreicht werden. Zusätzlich stellt die Komponenten der Probenahme Lösungsmittel Einstellen zusätzliche Flexibilität die Experimente durchzuführen. Beispielsweise, Probenahme Lösungsmittel enthalten Reagenzien (zB dikationische Verbindungen) wurden zur Durchführung reaktive MSI Experimenten verwendet, was eine signifikante Zunahme in der Anzahl der identifizierten Metaboliten per Experiment 20. Der andere Vorteil der einzelsträngigen Sonde ist die integrierte Konstruktion, die den Bedienungskomfort während der gesamten Datenerfassungsprozess bereitstellt. Da der Abstand zwischen der Spitze und der Gewebeoberfläche für die Ionensignalintensität und Stabilität sehr empfindlich ist, eine flache Gewebeschnitt zu erhalten und leitenden Oberflächenanpassung Abflachen des Abstandsvarianz zu minimieren, ist ein Schlüssel für hochwertige MSI Experimenten. Daraus folgt, dass die Single-Sonde MSI Techniken nicht geeignet sind, eine hohe räumliche MS Bilder von unebenen Oberflächen zu erhalten. Neben der Bereitstellung einer qualitativ hochwertigen Sonde zu Herstellung, das Gerät sorgfältig Tuning ist essentiell für einen erfolgreichen MSI Experiment. Unter allen Abstimmungsschritte, die Anpassung der Höhe der einzelnen Sondenspitze über dem Gewebeschnitt Oberfläche ist die kritische. Wenn die Sonde Höhenverstellung, die Pumpe das Lösungsmittel Probenahme und schalten Sie die Ionisierung Spannung, so dass nur die Lösungsmittel Hintergrund Ionensignale observ sein kanned. Dann überwacht die Änderung des Massenspektrums während sorgfältig die Sondenoberflächenabstand zu reduzieren, indem die motorisierte Z-Stufe, bis starke und stabile Ionensignale von Gewebeschnitt Anheben beobachtet werden kann; diese Sondenhöhe wird für MSI Datenerfassung während des Experiments verwendet werden. Darüber hinaus ist eine optimierte Lösungsmittelflussrate für MSI Experimente notwendig. Stellen Sie die Durchflussrate mit der optimierten Sondenhöhe. Stellen Sie sicher , dass es keine Lösungsmittel Ausbreitung auf der Gewebeoberfläche ist ( das heißt, Durchflussrate zu hoch) oder Blasenbildung innerhalb des Nano-ESI - Emitter (dh Durchfluss zu niedrig ist). Die Single-Sonde ist ein multifunktionales Gerät für die Bioanalytik. Zusätzlich zu den Experimenten MSI, ist es in der Lage nahezu in Echtzeit der Durchführung in-situ SCMS 16 detaillierte chemische Informationen vom lebenden eukaryotischen Zellen zu erläutern, was ein großer Vorteil ist , verglichen mit anderen Vakuum basierend SCMS Techniken (wie MALDI 10 und SIMS 21 </sup&gt;). Die geringe Größe der Sondenspitze bietet die Möglichkeit, in eine lebende eukaryotische Zelle eingeführt zu werden und die intrazelluläre Verbindungen zur sofortigen MS-Analyse zu extrahieren und zu ionisieren. Ebenso können die Probenahme Lösungsmittel enthalten Reagenzien (zB dikationischer Verbindungen) in den SCMS Experimenten verwendet werden, und ein breiteres Spektrum von zellulären Bestandteile können als je zuvor in einer Live - Einzelzelle nachgewiesen werden (laufende Forschung, werden Daten nicht gezeigt). Obwohl die Echtzeit-Analyse der chemischen Profile von lebenden Einzelzellen liefert, aufgrund der Zellpenetration der Membrane und Extraktion von Zellinhalt, wird die Zelle in Untersuchung nach dem Versuch getötet werden was bedeutet, daß die einzelsträngige Sonde SCMS Technik immer noch eine destruktive Methode. Darüber hinaus kann die Sondenspitze und Nano-ESI-Emitter in der Single-Sonde leicht für unerfahrene Anwender verstopft sein. Um die Wahrscheinlichkeit von Geräteverstopfung zu reduzieren, stellen Sie sicher zu berühren den Kern zu vermeiden, wenn die Single-Sondenspitze in eine cel Einfügenl. Wenn Verstopfung auftritt, kann das Gerät durch Aufheizen der verstopften Sondenspitze oder die Nano-ESI - Emitter mit einer selbstgebauten Heizwendel 16 regeneriert werden. Eine weitere Einschränkung der einzelsträngigen Sonde SCMS - Technik ist , daß nur die Klebe Zellen (dh werden die Zellen an Oberflächen befestigt) analysiert werden können aktuelle Setup. Indem jedoch die Zellmanipulationssystem in die Einzelsonde MS gerät, breiteren Zelltypen können in Zukunft untersucht werden. Ähnlich wie bei dem Experiment MSI, eine qualitativ hochwertige Sonde und ein optimiertes Lösungsmittelflussrate ist für SCMS Studien kritisch zu erhalten. Wenn das Lösungsmittel Flussrate Abstimmung wird die Single-Sondenspitze über die Probe gelegt (dh kein Kontakt mit der Zelle oder dem Kulturmedium), und stellen Sie sicher , dass es von der Sondenspitze oder Blasenbildung in der Nano-ESI kein Lösungsmittel tropft ist Emitters.

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist eine relativ neue molekulare Bildgebungstechnik, um die räumliche Verteilung der interessierenden Verbindungen auf Oberflächen zu ermöglichen. Während der MSI-Analyse werden massenspektrometrische (MS) Messungen auf der gesamten Oberfläche auf Einzelpixelbasis aufgezeichnet, um ein 2D-Bild der interessierenden Spezies zu erstellen 1. MSI-Techniken haben die Fähigkeit, eine räumlich aufgelöste Merkmalsverteilung für eine große Bandbreite von Metaboliten bereitzustellen, so dass eine viel größere Menge an Informationen aus einer Probe gewonnen werden kann als mit herkömmlichen molekularen Bildgebungsverfahren, und sie haben das Potenzial, die Analyse biologischer Proben für biologische und pharmakologische Studien erheblich zu verbessern 2. MSI kann grob in Non-Ambient- und Ambient-Ansätze unterteilt werden. Die MSI-Analysetechniken außerhalb der Umgebung, wie z. B. die matrixgestützte Laserdesorptionsionisation (MALDI) MS 3 und die Flugzeit-Sekundärionen-MS (ToF SIMS) 4, sind in der Lage, eine hohe räumliche Auflösung (etwa 5 μm bzw. 100 nm) und eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen. Diese Methoden erfordern jedoch eine umfangreiche Probenvorbereitung, wie z. B. das Aufbringen von Matrixmolekülen auf die Probenoberfläche, und eine Vakuumprobenumgebung, die Artefakte in die erhaltenen Daten einbringen könnte. Umgebungstechniken wie die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI) MS 5, die Laserablations-Elektrospray-Ionisation (LAESI) MS 6 und Nano-DESI MS 7 sind in der Lage, Proben mit wenig bis gar keiner vorherigen Vorbereitung in der Umgebungsumgebung zu MSI zu machen, wodurch MS-Bilder erzeugt werden können, die die Probe möglicherweise in ihrem ureigenen Zustand widerspiegeln. Den meisten dieser Techniken fehlt jedoch im Allgemeinen die hohe räumliche Auflösung und Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu den nicht-umgebungsbezogenen Techniken, wobei die Experimente in der Regel bei etwa 150 μm pro Pixel durchgeführt werden 8.
Einzelzellanalyse (SCA) ist ein wachsendes Gebiet, das die Fähigkeit hat, die chemische Zusammensetzung biologischer Proben auf zellulärer Ebene zu charakterisieren. SCA ermöglicht die Analyse biologischer Systeme auf einer grundlegenderen Ebene als herkömmliche Zellanalysetechniken, die ein gemitteltes Ergebnis einer Zellpopulation liefern und möglicherweise Erkenntnisse liefern, die bisher unlösbar sind 9. MS-Techniken wurden in jüngster Zeit bei SCA (als Einzelzell-Massenspektrometrie oder SCMS bezeichnet) angewendet, wobei Techniken ohne Umgebungsbedingungen wie MALDI MS 10 und ToF SIMS 11 verwendet werden, bei denen Zellen vor der Analyse vorbehandelt werden, sowie Umgebungstechniken wie LAESI MS 12 und direkte Extraktionsmethoden wie lebende Einzelzell-Video-MS 13, 14, um eine Vielzahl von Zelltypen wie Ei, Pflanze und Krebs zu analysieren. Umgebungstechniken haben den Vorteil, dass sie auf lebende Zellen angewendet werden können, was wiederum die Artefakte minimiert und zu einer besseren Darstellung der Metaboliten in den lebenden Zellen führt. Die oben beschriebenen auf direkter Extraktion basierenden Methoden führen jedoch den Probenextraktions- und Analyseprozess in zwei verschiedenen Schritten durch, was zu einer Zeitlücke während der Analyse führt, die möglicherweise die in der Probe vorhandenen Metaboliten verändern könnte. 
Die Einzelsonde, ein miniaturisiertes multifunktionales Gerät, das in der Lage ist, Umgebungs-MSI mit hoher räumlicher Auflösung an biologischen Gewebeschnitten 15 und nahezu Echtzeit-In-situ-SCMS an lebenden Einzelzellen 16 durchzuführen. Die Einzelsonde verfügt über eine integrierte Konstruktion, die aus einer gezogenen Quarzkapillare mit zwei Bohrungen besteht, die mit einem lösungsmittelliefernden Einlass gekoppelt sind, und einem Nano-ESI-Emitter aus Quarzglaskapillaren, der die Lösungsmittelabgabe und die Analytextraktion von einem einzigen Gerät aus ermöglicht. Im Umgebungs-MSI-Modus wird die Einzelsonde über dem Probengewebe platziert und es erfolgt eine Mikroextraktion an der Oberfläche, wodurch ein gerastertes MS-Bild mit hoher räumlicher Auflösung erstellt werden kann. Insbesondere ist die konische Spitze der Einzelsonde klein genug, um in lebende eukaryotische Zellen für die In-situ-SCMS-Analyse eingeführt zu werden, bei der der Metabolitennachweis weniger als zwei Sekunden zwischen dem Einführen der Sonde und dem MS-Nachweis dauert, so dass chemische Informationen nahezu in Echtzeit erfasst werden können. Im Folgenden finden Sie die Protokolle zur Herstellung des Geräts mit einer Sonde und zur Durchführung des Umgebungs-MSI- und des SCMS-Modus unter Verwendung der MS-Techniken mit einer Sonde.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>Quarzrohr mit doppelter Bohrung, 1.120' &rsquo; &mal; 0,005" &mal; 12"</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc., Millville, NJ&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten-Laserabzieher&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato, Kalifornien;</td><td>Modell P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglaskapillare, ID: 40&nbsp; &Mikro; m, AD: 110&nbsp; &Mikro; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>UV-härtendes Harz&nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA</td><td>Artikel-Nr. 006.030</td><td></td></tr><tr><td>LED-UV-Lampe</td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharz</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>Art.-Nr. 20945</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Mikrofilter</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Mikrounion&nbsp;</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (Glas)</td><td>C & Eine wissenschaftliche Premiere, Manassas, VA&nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Spritze&nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Massenspektrometer</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 Software</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Stage Control</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Contact Closure device</td></tr><tr><td>USB-6009 Multifunktions-Datenerfassungsgerät</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS Relais</td><td>Panasonic, Kadoma, Japan&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>Logikgatter 50 Ohm Line-Treiber</td><td>Texas Instruments, Dallas, TX&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ein-Sonden-Setup</td></tr><tr><td>Motorisierter Lineartisch und Controller (3 Sätze)</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>Miniatur-XYZ-Tisch</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Translations-XY-Tisch</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 und PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL Ionenquellen-Grenzflächenflansch</td><td>Neues Objektiv, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Stereomikroskop, 250X - 2.000X</td><td>Shenzhen D& F Co., Shenzhen, China</td><td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>USB Digitalfotografie Mikroskop&nbsp;</td><td>DX.com, HongKong, China</td><td>S02 25~500X&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Chemyx Inc., Stafford, TX&nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Steckbrett aus massivem Aluminium, 8" x 8" x 1/2"</td> <td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>Flexibler Klemmhalter</td><td>Siskiyou, Grants Pass, ODER&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Methol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zellkultur</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7,4)</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten&nbsp;</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasche</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Brille, rund, Nr. 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tissue imaging</td></tr><tr><td>Cyro-Cut Mikrotom</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, Optimale Schnitttemperatur (OCT)&nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (Polycarbonat)</td><td>Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendungen der einzel-sonde: mass spectrometry imaging und einzelzellanalyse unter umgebungsbedingungen

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Massenspektrometrie (MSI) und in-situ Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) Analyse unter Umgebungsbedingungen sind zwei aufstrebende Bereiche mit großem Potenzial für die detaillierte Massenspektrometrie (MS) Analyse von Biomolekülen aus biologischen Proben. Die Einzelsonde, ein miniaturisiertes Gerät mit integrierten Probenahme- und Ionisationsfunktionen, ist in der Lage, sowohl Umgebungs-MSI- als auch In-situ-SCMS-Analysen durchzuführen. Bei der Umgebungs-MSI verwendet die Einzelsonde die Oberflächenmikroextraktion, um kontinuierlich eine MS-Analyse der Probe durchzuführen, und diese Technik ermöglicht die Erstellung von MS-Bildern mit hoher räumlicher Auflösung (8,5 μm) aus biologischen Proben wie Maus-, Gehirn- und Nierenschnitten. Ambient MSI hat den Vorteil, dass vor der Analyse wenig bis gar keine Probenvorbereitung erforderlich ist, was die Menge potenzieller Artefakte bei der Datenerfassung reduziert und eine repräsentativere Analyse der Probe ermöglicht. Für die In-situ-SCMS kann die Einzelsondenspitze aufgrund der geringen Größe der Probenahmespitze (< 10 μm) direkt in lebende eukaryotische Zellen wie HeLa-Zellen eingeführt werden, und diese Technik ist in der Lage, eine Vielzahl von Metaboliten in einzelnen Zellen nahezu in Echtzeit zu detektieren. SCMS ermöglicht eine höhere Sensitivität und Genauigkeit chemischer Informationen auf Einzelzellebene, was unser Verständnis biologischer Prozesse auf einer grundlegenderen Ebene als bisher verbessern könnte. Das Gerät mit einer Sonde kann potenziell mit einer Vielzahl von Massenspektrometern gekoppelt werden, um ein breites Spektrum von MSI- und SCMS-Studien zu ermöglichen.

Die Single-Sonde wurde für die Umgebungs MSI Analyse der aufgeschnittene Mausnierengewebe 15 erfolgreich eingesetzt. Die Vorrichtung verwendet den Mechanismus der Oberflächenflüssigkeit Mikroextraktion (1a), die hocheffiziente Analyten Extraktion aus einem kleinen Bereich, was zu reichlich Ionensignale Intensitäten in den MSI Ergebnisse. Zum Beispiel haben die Signalintensitäten von mehr als 10 7 seit einigen reichlich Metaboliten (Abbildung 2a) erreicht. Eine große Anzahl von Metaboliten wurden in dieser Weise erfasst wird , einschließlich einer Anzahl von Sphingomyelin (SM) und Phosphatidylcholin (PC) -Spezies wie [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z), [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z) und [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Diese Verbindungen wurden mit hoher Massenauflösung und Massengenauigkeit identifiziert, wenn gekoppelt toa hochauflösenden Massenspektrometer. So wurde beispielsweise die Identifikation mit weniger als 4 ppm m / z Massengenauigkeit (dh die Differenz zwischen den beobachteten und theoretischen Werte) für jeden Metaboliten (2b) in hier dargestellten Ergebnisse erzielt. Darüber hinaus analysiert Tandem MS (dh, MS / MS) wurden auch für sicherer Identifizierung von Spezies von Interesse durchgeführt. 15 Aufgrund der Fähigkeit , kann eine effiziente Flüssigkeitsmikroextraktion der Durchführung auf einer kleinen Fläche, die Single-Sondenvorrichtung verwendet werden , 15 eine hohe räumliche Auflösung MSI Experimente unter Umgebungsbedingungen durchzuführen. Zum Beispiel haben detaillierte MS Bilder von Maus - Nierenschnitten erhalten wurden , die räumliche Verteilung von ausgewählten Metaboliten darstellt (Abbildung 2c). Die räumliche Auflösung des MS Bild wurde bestimmt 8,5 um, werden im Anschluss an die weit verbreitete Metrik, um die Transiti des Habens. auf Punkt einer scharfen Funktion innerhalb einer 20-80% Intensitätsänderung des MS - Signals bestimmt 18 Im Fall von Phospholipid [PC (38: 5 + Na)] + auf der Maus Nierenschnitt, das Feature Übergang zwischen der inneren Medulla und die äußere Medulla erfolgt über einen Zyklus in der Chronogramm ist eine Intensitätsänderung von mehr als 20-80% Bereich zeigt. Basierend auf der Probenbewegungsgeschwindigkeit (10,0 &amp; mgr; m / s) und MS Datenerfassungsrate (0,85 sec / Spektrum), die Probe in einer MS Bewegungsdistanz Zyklus scannen (8,5 &amp; mgr; m), dh die MSI - räumliche Auflösung, kann berechnet werden (Abbildung 2d). Diese räumliche Auflösung gehört zu den höchsten noch für Umgebungs MSI Techniken auf biologische Proben durchgeführt erreicht. Für SCMS war die Single-Sonde der Lage , die Analyse der einzelnen Live - HeLa - Zellen 16 zu erreichen. Die Spitze Größe der Single-Sonde ist in der Regel weniger als 10 &amp; mgr; m (Abbure 3a), die direkt in vielen Typen von eukaryontischen Zellen eingeführt werden , die klein genug ist, dessen Durchmesser von ~ 10 um, für die Extraktion und MS - Analyse. Der Einführvorgang der einzelsträngigen Sondenspitze in eine Zelle kann visuell unter Verwendung eines digitalen Stereo - Mikroskop beobachtet werden (Abbildung 3b), und die Zellmembran Penetration kann durch die schnelle und signifikante Änderung der Massenspektren von PBS (oder frische Zellkultur bestätigt werden mittel) an intrazelluläre Verbindungen (Figuren 3c und 3d). Die Experimente können in sowohl positive als auch negative Ionen Modi durchgeführt werden, um breitere Typen von molekularen Spezies erkennen. Beispielsweise 18 verschiedenen Lipidarten wurden im positiven Modus identifiziert, einschließlich der Sphingomyeline (SM) und Phosphatidylcholine (PC), während Adenosin - Phosphaten (AMP, ADP und ATP) wurden im Negativ - Ionen - Modus (Fig 3c und d) nachgewiesen. Die Zeitverzögerung zwischen der Single-Sonde Einfügung into einer Zelle und der Signalerfassungs betrug typischerweise weniger als zwei Sekunden, eine nahezu Echtzeit-Erkennung von zellulären Metaboliten ermöglicht. SCMS wurde auch auf Experimenten angewendet , wo Zellen , die mit Antikrebsmitteln behandelt wurden (beispielsweise OSW-1, Paclitaxel und Doxorubicin) 19]. Die entsprechenden Arzneimittel können bei einer Reihe von Konzentrationen (dh 10 nM, 100 nM, 1 uM und 10 uM) in HeLa - Zellen nach 4-stündiger Behandlung nachgewiesen werden in DMSO (Dimethylsulfoxid), die unbehandelten Zellen unter Verwendung (Hinzufügen DMSO nur ) als die Kontrollen. Die MS - Signale von Drogen waren nicht innerhalb der extrazellulären PBS oder der Kontrolle (Abbildung 3e), wurden aber in den einzelnen Zellen , die die Single-Sonde MS - Technik nachgewiesen werden (Ergebnisse nur 100 nM Behandlung sind in Abbildung 3f gezeigt). Weil die Zellen mit PBS (oder frisches Zellkulturmedium) gespült wurden extrazellulären Verbindungen und Verunreinigungen zu entfernen, die Detektion von endogenen Metaboliten (zB Zelllipiden einerd Adenosin - Phosphate) und exogene Verbindungen (zB Krebsmedikamente) anzeigt , daß die einzelsträngige Sonde MS Technik intrazellulären Verbindungen zu analysieren , verwendet werden können. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Herstellung und Einrichtung der einzelnen Sonde für Umgebungs MSI und SCMS Analyse a . ) Herstellung Verfahren der Einzelsonde. B) Foto eines gefertigten Einzel Sonde an einem Glasträger. C) Fotografie des Single- mit einem Massenspektrometer. d) Schematische Darstellung der Einzel Tastkopfeinstellung gekoppelt mit einem Massenspektrometer angebracht Tastkopfeinstellung. Während eines Experiments wird das Probenahme Lösungsmittel kontinuierlich aus der Spritze vorgesehen, die Ionisierung Spannung an die leitfähige Vereinigung von dem Massenspektrometer zugeführt wird, zwei digitale Mikroskopen verwendet Probe Platzierung zu überwachen, die motorisierte XYZ-StativsSystem wird verwendet , Probe Bewegung zu steuern, und ein Massenspektrometer für die Analyse. e) Foto des individualisierten digitalen Stereoskop - System f . ) Foto zeigt die digitale Stereoskop zu der Ionenquelle Trennstellenflansch durch einen optischen Platte angebracht verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Ergebnisse einer Umgebungs MSI Studie einer Maus Nierenschnitt mit hoher räumlicher und Massenauflösung. A) Eine repräsentative Massenspektrum aus der Single-Sonde MSI. Die maximale Intensität der nachgewiesenen Metaboliten können mit ihren Massengenauigkeit. C 3,39 x 10 7 (willkürliche Einheiten). B) Eine Auswahl der nachgewiesenen Metaboliten angegeben erreichen)MS Bilder von [PC (32: 0) + H] + und [PC (34: 1) + Na] + von einem Maus - Nierenschnitt bei 8,5 um räumliche Auflösung gemacht. PC: Phosphatidylcholin. Maßstabsbalken: 2 mm; 0,20 mm (kleines Bild) d) Bestimmung der räumlichen Auflösung des MS Bild für. [PC (38: 5) + Na] + (angepasst mit Genehmigung aus Lit. 15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Ergebnisse einer Umgebungs SCMS Analyse der Arzneimittel - behandelten HeLa - Zellen mit hoher Massenauflösung. A) Vergrößerte-in Fotografie der Single-Sondenspitze eine typische Größe von &lt;10 &amp; mgr; m im Durchmesser zeigt. B) Foto an dem Punkt gemessen von Single-Sonde Einsetzen in eine HeLa-Zelle. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m.c) Eine typische positive Ionenmodus - Massenspektrum mit den Identifikationen einer Anzahl von PC (Phosphatidylcholin) -Spezies. d) Eine repräsentative Liste von Metaboliten aus SCMS Analyse von HeLa - Zellen nachgewiesen sowohl in den positiven und negativen Ionenmodus. ef) Massenspektren für die Kontrolle und behandelt (100 nM OSW-1) Zellen (mit Genehmigung aus Lit. 16 angepasst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung S1. Schaltplan der elektronischen Vorrichtung verwendet , um Kontaktschließsignal zu erzeugen , für Massenspektrometer Daten zu sammeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">um diesen Wert anzuzeigen oder herunterzuladen.</a>

Hier präsentieren wir Protokolle zur Durchführung sowohl der Umgebungsmassenspektrometrie-Bildgebung (MSI) von Geweben als auch der In-situ-Live-Einzelzell-MS (SCMS)-Analyse mit der Einzelsonde, einem miniaturisierten multifunktionalen Gerät für die MS-Analyse.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein mikroskaliges Probenahmeinstrument, die Einzelsonde, zu entwickeln, um lebende Einzelzellen mittels Massenspektrometrie unter Umgebungsbedingungen zu analysieren, sowie die bildgebende Massenspektrometrie biologischer Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung unter Umgebungsbedingungen durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in biologischen und pharmazeutischen Untersuchungen zu beantworten.Beispielsweise, welche Moleküle in lebenden Einzelzellen vorhanden sind und wie sie in Geweben verteilt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Einzelsonde ein multifunktionales Gerät ist, das sowohl für die Analyse lebender Einzelzellen als auch für hochauflösende Massenspektrometrie-Bildgebungsversuche unter Umgebungsbedingungen verwendet werden kann. Obwohl diese Methode Einzelzellen und Gewebe analysieren kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, bei denen eine mikroskalige Probenahme wünschenswert ist, wie beispielsweise die Sparsuche von Chemikalien sowie lebende Mikrokolonien und Biofilme.Bei der Demonstration des Verfahrens wird mir Wei Rao, ein Postdoktorand aus meinem Labor, assistieren. Legen Sie ein ganzes, interessierendes Mausorgan in die Mitte einer kleinen Kunststoffmulde. Tauchen Sie das Organ so weit in Einbettungsmaterial für Gewebe ein, dass es bis zu einer Höhe von etwa 10 mm bedeckt ist.Stellen Sie die Gewebeproben unverzüglich in flüssigen Stickstoff, um sie schnell einzufrieren. Um den Mausgewebeschnitt vorzubereiten, nehmen Sie das gefrorene Mausorgan und tauen es in einem temperaturgeregelten Kryotom auf 15 Grad Celsius auf. Befestigen Sie das Gewebe mit etwa 500 Mikrolitern Einbettungsmittel für Gewebe auf einer Stahlunterlage und platzieren Sie es auf der Schneidhalterung des Kryotoms, sodass die gewünschte Schneidorientierung zur Klinge zeigt.Schneiden Sie das Gewebe auf eine Dicke von 12&nbsp;Mikrometern. Anschließend werden die geschnittenen Gewebeschnitte auf Polycarbonat-Mikroskopobjektträger gegeben und 30&nbsp;Minuten bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Gewinnen Sie eine Zellprobe, beispielsweise 1&nbsp;Milliliter HeLa-Zellsuspension, und geben Sie diese in 9&nbsp;mL vollständiges Zellkulturmedium in einer standardmäßigen 10-cm-Zellkulturplatte. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für zwei bis drei Tage, bis die Wachstumsfläche der Zellkulturplatte zu 70–80 % bedeckt ist. Führen Sie das Passagieren der Zellen in der Zellkulturplatte durch. Aspirieren Sie hierzu das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 5 mL 1x Phosphatgepufferter Salzlösung.Entfernen Sie das PBS mit einer sterilen Aspirationsspitze und inkubieren Sie die Zellen für etwa 5 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 2,5 mL Trypsin, um die Zellen von der Kulturplatte zu lösen. Beenden Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 7,5 mL komplettem Zellkulturmedium und resuspendieren Sie die Zellen anschließend gleichmäßig. Um die Zellproben für ein Einzelzell-Massenspektrometrie- oder SCMS-Experiment vorzubereiten, legen Sie zunächst einzelne Mikro-Deckgläser in die Vertiefungen einer 12-Loch-Platte.Anschießend 1,8 mL Zellkulturmedium und 0,2 mL Zellsuspension in die Vertiefung geben. Die Zellen vorsichtig durch sanftes Schwenken der Platte vermischen, bevor sie für etwa 24 Stunden in einer 5 % CO2-Umgebung bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Um eine Behandlung der kultivierten Zellen mit einem Wirkstoff durchzuführen, eine Lösung der Wirkstoffverbindung in die 12-Loch-Zellkulturplatte geben.Platzieren Sie das Doppelkanal-Quarzrohr in einen Laser-Mikropipettenzug, und ziehen Sie eine Doppelkanal-Quarznadel. Als Ausgangswerte stellen Sie die Hitze auf 400, den Glühfaden auf drei, die Geschwindigkeit auf 80, die Verzögerung auf 150 und den Zug auf 250 ein. Schneiden Sie die Zugs Spitze ab, sodass am anderen Ende etwa 5 mm unzugelassenes Doppelkanal-Quarzkapillar übrig bleibt.Schneiden Sie einen 80 mm langen Abschnitt aus Fused-Silica-Kapillare als lösungsmittelversorgende Kapillare zu. Führen Sie anschließend die Kapillare in eine Bohrung am flachen Ende der Doppelbohrungs-Quarznadel ein. Ziehen Sie mithilfe einer Flamme eine Fused-Silica-Kapillare als nanoESI-Emittler und schneiden Sie sie auf eine Länge von 7–10 mm zu; führen Sie sie in die andere Bohrung am flachen Ende der Doppelbohrungs-Quarznadel ein.Tragen Sie eine minimale Menge UV-Harz auf das flache Ende der Dual-Bore-Quarznadel auf. Härten Sie das Harz mithilfe einer LED-UV-Lampe etwa 20 Sekunden lang aus, um die lösungsmittelversorgende Kapillare und den nanoESI-Emittierer zu befestigen. Schneiden Sie als Nächstes einen Standard-Mikroskop-Glasobjektträger längs in zwei Hälften.Danach wird die Einzelsonde an einem Ende des Objektträgers so platziert, dass der nanoESI-Emitter nach außen zeigt. Tragen Sie den normalen Epoxidharz auf den Körper der Einzelsonde auf, um sie auf dem Objektträger zu befestigen, und lassen Sie sie über Nacht zum Aushärten stehen. Dieses System umfasst eine kundenspezifische Ionenquellen-Schnittstellenflansch des Massenspektrometers sowie eine Aluminium-Optikplatte, die mit einem USB-Digitalmikroskop, einer manuellen Miniatur-X-Y-Z-Verstellstufe und einem motorisierten X-Y-Z-Verstellsystem ausgestattet ist.Modifizieren Sie den Ionenquellen-Schnittstellenflansch des Massenspektrometers und fertigen Sie den Standfuß des digitalen Stereomikroskops wie im Textprotokoll beschrieben an. Befestigen Sie das modifizierte digitale Stereomikroskop, ein USB-Digitalmikroskop, eine manuelle Miniatur-X-Y-Z-Verfahrbühne mit flexibler Klemmhalterung sowie das motorisierte X-Y-Z-Verfahrbühnensystem auf der Aluminium-Optikplatte. Verwenden Sie die flexible Klemmhalterung, um den Objektträger, an dem eine Einzelsonde befestigt ist, zu fixieren.Dann befestigen Sie die Einzelprobenanordnung am Massenspektrometer. Stellen Sie mithilfe des flexiblen Klemmhalters und des miniaturisierten XYZ-Stages den Emitter der Einzelprobenanordnung vor dem Einlass des Massenspektrometers positionsgenau ein. Tauen Sie den Probenabschnitt bei Raumtemperatur auf, und platzieren Sie ihn auf dem motorisierten XYZ-Verfahrsystem unterhalb der Einzelprobenanordnung.Passen Sie die Probenposition an, indem Sie die Koordinaten in der Steuersoftware ändern. Verwenden Sie eine Spritze, um das Probennahmelösungsmittel mit einer geeigneten Rate zu pumpen. Anschließend wird die Ionisierungsspannung angelegt.Stellen Sie die Höhe der Einzelsonde so ein, dass sie knapp über der Oberfläche der Probe liegt und eine Oberflächenextraktion von Metaboliten durchführen kann. Heben Sie vorsichtig die Z-Ebene an und verwenden Sie dann das USB-Digitalmikroskop, um die Abstandsänderung zwischen der Spitze der Einzelsonde und der Gewebeoberfläche zu überwachen. Legen Sie die Parameter für das Rastern über den Bereich von Interesse innerhalb der Probe fest.Verwenden Sie für die hier gezeigten Maus-Nieren-Schnitte eine Rastergeschwindigkeit von 10 Mikrometern pro Sekunde und einen Abstand von 20 Mikrometern zwischen den Linien. Legen Sie die Parameter für das Rastern über den gewünschten Bereich der Probe fest. Für die hier gezeigten Maus-Nieren-Schnitte verwenden Sie eine Rastergeschwindigkeit von 10,0 Mikrometern pro Sekunde und einen Abstand von 20 Mikrometern zwischen den Linien.Richten Sie eine Methode zur automatisierten Erfassung von MS-Spektren aus dem Massenspektrometer ein. Verwenden Sie für die hochauflösende Massenspektrometrie-Bildgebung an einer Mausniere eine Massenauflösung von 60.000, einen 5-kV-Positivmodus, 1 Mikroskan, eine maximale Injektionszeit von 150 Millisekunden und schalten Sie die automatische Verstärkungsregelung ein. Starten Sie die MSI-Datenerfassung und erstellen Sie anschließend MS-Bilder aus den rohen MS-Dateien, wie im Textprotokoll beschrieben.Richten Sie das Einzelsonden-System gemäß den Anweisungen für MSI ein und stellen Sie die Lösungsmittelflussrate ein. Waschen Sie die auf den Mikrodeckgläsern kultivierten Zellen mit PBS, um das Kulturmedium und extrazelluläre Wirkstoffbestandteile zu entfernen. Anschließend bringen Sie das Zellen enthaltende Deckglas auf das motorisierte XYZ-Translationsstagesystem für das Experiment. Richten Sie das digitale Stereomikroskop über der Probe auf die Spitze der Einzelsonde aus, um die Zellpenetration während der Analyse zu überwachen. Nutzen Sie das USB-Digitalmikroskop an der Seite der Einzelsonde, um die Arbeitsbedingungen des nanoESI-Emitters an der Einzelsonde zu überwachen. Verwenden Sie das motorisierte XYZ-Bühnensteuerungsprogramm und das digitale Stereomikroskop, um eine Zelle von Interesse zu lokalisieren und die Spitze der Einzelsonde präzise über der Probe zu positionieren.Beginnen Sie die MS-Datenaufnahme, bevor die Einzelsonde in die Zelle eingeführt wird. Senken Sie die Platte mit den Zellen ab, um die Einzelsonde aus der Zelle herauszuziehen. Lassen Sie abschließend das Lösungsmittel etwa drei Minuten lang fließen, um die Einzelsonde vollständig zu spülen.Die Umgebungs-Massenspektrometrie-Bildgebung von Mause Nierenschnitten wurde durchgeführt, und eine große Anzahl von Molekülen, die auf der Oberfläche des Gewebes vorhanden sind, konnte nachgewiesen werden. Die räumliche Verteilung und relative Häufigkeit mehrerer Moleküle auf der Gewebeoberfläche wurde dargestellt. Eine räumliche Auflösung von 8,5 Mikrometern wurde durch die Beobachtung scharfer Übergänge von Merkmalen innerhalb der Massenspektrometrie-Daten erreicht.Die Herstellung der Einzelsonde mit einer scharfen Spitze und offenen Kanälen ist entscheidend für die Einzelzellanalyse. Mikroskope sind erforderlich, um die Zielzellen zu lokalisieren und den Zellpenetrationsprozess zu überwachen. Die Signaländerung aus den Massenspektren liefert zudem zusätzliche Informationen, um die Zellpenetration zu bestätigen.Es wurden eine große Anzahl von Molekülen aus lebenden Einzelzellen nachgewiesen. Bei der Anwendung in Studien zu Krebsmedikamenten dienen Kontrollzellenversuche dazu, die Unterschiede der Behandlung mit Krebsmedikamenten aufzuzeigen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Einzelsonde hergestellt wird und wie dieses Gerät für die Massenspektrometrie-Analyse einzelner Zellen sowie für die Umgebungs-Massenspektrometrie-Bildgebung biologischer Gewebe verwendet wird.Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da detaillierte Anweisungen erforderlich sind, um die Einzelsonden-Vorrichtung herzustellen, das gesamte System einzurichten und die Instrumente zu bedienen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Einzelzellanalyse kontinuierlich an vielen Zellen durchgeführt werden. Jede Analyse dauert weniger als drei Minuten.Das Abschließen eines MS-Bildgebungs-Experiments unter Umgebungsbedingungen kann einige Stunden dauern, abhängig von der Probengröße, der räumlichen Auflösung und dem verwendeten Massenspektrometer. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Herstellung einer hochwertigen Einzelsonde der entscheidende Schritt ist. Außerdem sind die Abstimmung und Bedienung des Instruments entscheidend, um das Experiment erfolgreich durchzuführen.Andere Methoden können durch die Anwendung ähnlicher Verfahren wie der hier vorgestellten entwickelt werden. Beispielsweise können Reagenzien zum Probenlösungsmittel hinzugefügt werden, um reaktive Einzelzellanalysen und die massenspektrometrische Bildgebung unter Umgebungsbedingungen (ambient MSI) durchzuführen, wodurch die Detektion von Molekülen aus Proben verbessert wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Einzelzellanalyse und massenspektrometrische Bildgebung unter Umgebungsbedingungen.Diese Technik kann möglicherweise für die Zellbiologie-Forschung, pharmakologische Studien und klinische Tests verwendet werden. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit scharfen Quarzkapillaren und UV-härtendem Epoxidharz gefährlich sein kann, und achten Sie stets auf Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und UV-Schutzbrille, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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