Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungstechnik besteht darin, Schwankungen der luminalen SR-Calciumspiegel in Reaktion auf calciummobilisierende Agentien spezifisch in vaskulären glatten Muskelzellen zu überwachen. Diese Methode kann hilfreich sein, um den zellulären Calciumkreislauf auf direktere Weise aufzuklären. Beispielsweise ist es sehr wichtig, die Beziehung zwischen unserem Calciumtransport im sarkoplasmatischen Retikulum und dem ER-Stress zu kennen.

Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir das Kalzium direkt im Lumen des sarkoplasmatischen Retikulums messen können, anstatt es aus indirekten Messungen von Veränderungen im Zytoplasma extrapolieren zu müssen. Diese Technik wird Gabriela Ziomek demonstrieren, die Doktorandin in meinem Labor ist. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine 1:25-Verdünnung des Protein-Gemischs in DMEM herstellen.

Als Nächstes überführen Sie 200 Mikroliter der Proteinmischung DMEM in jede 35-Millimeter-Glasbodenkulturplatte, um den inneren Glasboden vollständig zu bedecken. Lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Sicherheitswerkbank stehen. In der Zwischenzeit erwärmen Sie DMEM mit 10 Prozent NCS in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius.

Anschließend das DMEM mit einer Glaspipette aus dem Kulturkolben entfernen. Danach den Kolbenboden mit warmer steriler PBS spülen, um Rückstände des DMEM zu entfernen. Um die kultivierten glatten Muskelzellen vom Kolbenboden zu lösen, den Kolben kurz mit einem Milliliter Trypsin spülen und dieses anschließend entfernen.

Fügen Sie dann einen weiteren Milliliter Trypsin hinzu. Schwenken Sie das Kolben etwa 30 bis 60 Sekunden lang, um sicherzustellen, dass das Enzym den gesamten Boden des Kolbens benetzt, bevor Sie es entfernen. Sobald die Zellen mit Trypsin gelöst wurden, geben Sie frisches DMEM mit 10 Prozent NCS zum Kolben, um die Trypsinreaktion zu stoppen.

Überführen Sie die resultierende Zellsuspension aus dem Kolben in ein sauberes, beschriftetes 50-Milliliter-Konischglas. Geben Sie anschließend ein Milliliter frisches DMEM mit 10 Prozent NCS auf jede vorzubereitende Platte. Danach wird das Gefäß mit der Zellsuspension vorsichtig mehrmals umgestülpt, um eventuell entstandene Zellpellets aufzulösen.

Pipettieren Sie das gewünschte Volumen der vorsichtig gemischten Zellsuspension in jede Platte. Schwenken Sie anschließend jede Platte gründlich im oder gegen den Uhrzeigersinn, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Glasboden zu gewährleisten. Es ist notwendig, ausreichend Zellen in die Platte zu geben, um sicherzustellen, dass sie innerhalb der nächsten 48 Stunden eine ausreichend hohe Konfluenz erreichen, um eine effektive Bildgebung zu ermöglichen.

Nachdem dem Medium und der Zellsuspension zu jeder Platte hinzugefügt wurden, inkubieren Sie die Platten für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid, damit die Zellen sich ordnungsgemäß an den Glasboden anheften können. Überprüfen Sie die Platten im Mikroskop in Abständen von jeweils fünfzehn Minuten, bis die Zellen deutlich angeheftet sind. Danach holen Sie das Adenavirus-D-1-SR-Aliquot aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und transportieren es in einem mobilen Eisbad zur biologischen Sicherheitswerkbank.

Pipettieren Sie die gewünschte Dosis gekühltes D one SR in jede Platte und inkubieren Sie die infizierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag ergänzen Sie die Zellen mit einem Milliliter frischem DMEM plus zehn Prozent NCS. Anschließend inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.

Nach der Übernacht-Inkubation entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte. Spülen Sie die Kulturplatte dreimal mit je einem Milliliter warmem physiologischem HEPES-PSS-Puffer. Fügen Sie anschließend unmittelbar vor der Aufzeichnung ein Milliliter frischen, warmen HEPES-PSS-Puffer hinzu.

Führen Sie die anfängliche Bildgebung mithilfe der FRET-SE-Anwendung durch, indem Sie die zugehörige Software des konfokalen Mikroskops öffnen. Sobald die Anwendung geöffnet ist, klicken Sie auf den Reiter „Setup“, um die gewünschten experimentellen Einstellungen anzupassen. Ändern Sie manuell die Kanaleinstellungen, sodass die Zellen nacheinander mit 440 Nanometern für Donor und FRET sowie mit 513 Nanometern für Akzeptor angeregt werden.

Danach die Emissionswellenlängen bei 488 Nanometern für den Donor und 535 Nanometern für FRET und Akzeptor einstellen. Anschließend die Lichtintensität bei 15 Prozent Transmission mit einer Anregungsbelichtungszeit von 150 Millisekunden für die Zellen und 10 Sekunden zwischen den Belichtungen einstellen. Danach die Platte auf dem Mikroskopständer stabilisieren.

Verwenden Sie die Live-Taste, um die Bildauflösung zu überprüfen. Passen Sie die Einstellungen weiter an, um die gewünschte Auflösung zu erreichen. Nehmen Sie unter der Registerkarte „Setup“ mithilfe der Schaltfläche „Bild aufnehmen“ ein Bild der Probe auf.

Wechseln Sie nun zum Auswertungs-Tab und wählen Sie die geeignete Methode zur Berechnung der FRET-Effizienzen für die durchgeführten Experimente aus. Methode drei, die eine ratiometrische Berechnung verwendet, wird für Experimente mit Cameleons wie dem D-one-SR-Indikator empfohlen. Danach wechseln Sie zum Diagramm-Tab, um die aufgezeichneten Intensitätswerte in einem Diagramm zu betrachten.

Falls gewünscht, zeichnen Sie eine ROI im Bildbetrachter, um die entsprechende durchschnittliche Intensität dieses interessierenden Bereichs im Diagramm zu beobachten. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung, um die Daten mindestens drei Minuten lang zu sammeln, um sicherzustellen, dass vor der Zugabe des Substanzmittels ein stabiles Grundsignal vorliegt. Führen Sie anschließend ein Calcium-bewegendes Mittel zu, um damit das SR-Calcium zu reduzieren, indem es direkt in die Platte in der Nähe des aufgezeichneten interessierenden Bereichs appliziert wird.

Setzen Sie die Aufnahme über eine gewünschte Dauer nach der Behandlung fort. Danach erfassen Sie die ratiometrischen FRET-Serienbilder mit einem konfokalen inversen Mikroskop unter Verwendung der FRET-SE-Anwendung. In diesem Schritt spülen Sie die Kulturplatten mit primären glatten Muskelzellen der Rattenaorta dreimal mit je einem Milliliter warmem physiologischem HEPES-PSS-Puffer aus.

Anschließend mischen Sie den Indikator mit einem Milliliter warmem HEPES-PSS und geben ihn auf die Kulturplatten. Inkubieren Sie die glatten Muskelzellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem Indikator. Nach einer Stunde entfernen Sie den Indikator von der Kulturplatte und waschen dreimal mit je einem Milliliter warmem physiologischem HEPES-PSS-Puffer.

Danach unmittelbar vor der Aufnahme ein Milliliter frischen, warmen HEPES-PSS-Puffer hinzufügen. Serienaufnahmen mit dem konfokalen inversen Mikroskop aufnehmen. Anschließend das Calcium-verändernde Agens als Hilfsmittel zur Depletion des SR-Calciums zugeben und die Aufnahme über den gewünschten Zeitraum nach der Behandlung fortsetzen.

Abgebildet sind repräsentative Aufnahmen einer glatten Muskelzelle, die mit dem D-one-SR-Indikator unter Verwendung von CFP-, FRET- und YFP-Bandpassfiltern transfiziert wurde. Diese Abbildung zeigt Echtzeit-Pseudofarbaufnahmen kultivierter glatter Muskelzellen der Rattenaorta, die mit D-one-SR transfiziert wurden. Die Behandlung mit zwei Mikromolar Thapsigargin zeigte eine Abnahme der Signalintensität, was auf einen signifikanten Rückgang des SR-Calciumgehalts infolge der durch Thapsigargin induzierten Calciumfreisetzung hindeutet. Und dieser Graph zeigt die repräsentative Kurve für das normalisierte D-one-SR-Verhältnis in kultivierten glatten Muskelzellen, die mit zwei Mikromolar Thapsigargin behandelt wurden, und bestätigt einen signifikanten Abfall des SR-Calciums.

Hier sind repräsentative Aufnahmen von kultivierten glatten Muskelzellen der Rattenaorta, die mit einem zytoplasmatischen Kalziumindikator beladen und mit zwei Mikromolar Thapsigargin behandelt wurden. Wie gezeigt, verursacht Thapsigargin einen signifikanten Anstieg der Signalintensität im Zytoplasma aufgrund der Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum. Und dieser Graph zeigt eine repräsentative Kurve für das normalisierte Fluo-vier-AM-Verhältnis in den kultivierten glatten Muskelzellen, die mit zwei Mikromolar Thapsigargin behandelt wurden. Der dargestellte Anstieg des Kalziumsignals wird als proportional zur Menge an aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetztem Kalzium angesehen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von etwa 48 Stunden von Anfang bis Ende durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen in den beschriebenen Bedingungen zu halten, um ihre Vitalität vor der Transfektion mit dem Kalziumindikator sicherzustellen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie kultivierte Zellen vorbereitet werden, um die Messung der luminalen SR-Kalziumkonzentrationen mithilfe des D-one-SR-Indikators zu ermöglichen.