Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss synaptischer Inputs der neuronalen Prozessierung durch mikroiontophoretische Injektionen von neuroaktiven Substanzen bei wachen Tieren zu manipulieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfunktionalitäten mithilfe sensorischer Systeme zu entwirren, wie z. B. die Rolle von Neurotransmittern und ihre Interaktion mit sensorischen Reizen und Kodierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Manipulation lokaler synatischer Eingaben auf der Registerkarte und die Untersuchung neuronaler modulatorischer Systeme ermöglicht, ohne von der Anästhesie beeinflusst zu werden.

Obwohl dieser Verlorene hier in gefesselten Mäusen war, kann er auch bei anderen Säugetieren wie Fledermäusen, Ratten oder Meerschweinchen verwendet werden. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die Wolframdrähte zum Schneiden in ein speziell angefertigtes Ausrichtungswerkzeug. Befestigen Sie die losen Enden der Drähte vorsichtig mit Klebeband und schneiden Sie sie auf die gewünschte Länge ab.

Ziehen Sie anschließend vorsichtig am Klebeband, um die Wolframdrähte vom Ausrichtungswerkzeug zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass alle Drähte am Klebeband befestigt bleiben. Rollen Sie dann das Klebeband auf eine polierte Messingspindel und halten Sie die Drähte fest gegen die Spindel, damit eine gute elektrische Verbindung besteht.

Schließen Sie danach die Spindel an einen Motor mit 5 U/min in der Workstation an. Der Spindelzugang ist um 45 Grad relativ zur Oberfläche der Ätzlösung abgewinkelt. Tauchen Sie anschließend ein Drittel der Drähte in die Lösung.

Tauchen Sie anschließend eine Kohlestabelektrode in das Ätzbad, um den Stromkreis zu schließen. Schalten Sie die Workstation so ein, dass sich die Spindel zu drehen beginnt, und stellen Sie dann den Strom, der durch die Elektroden und die Ätzlösung fließt, auf 250 Milliampere ein. Stoppen Sie das Ätzen der Spitze, wenn der Strom auf 200 Milliampere abfällt, um die Drahtspitzen in sehr feine Punkte zu ätzen.

Lege nun einen Draht in eine Kapillare aus Borosilikatglas, dessen unteres Ende mit Modelliermasse blockiert ist. Halten Sie die Pipette mit einer Heizspirale und einem hängenden Kolben. Befestigen Sie den glasbedeckten Draht an einem Objektträger, bevor Sie ihn unter das Mikroskop legen.

Setze die Spitze an und berühre deine Borobead im Fokus. Dann die Perle erhitzen, bis sie leicht schmilzt. Führen Sie danach etwa 10 bis 15 Mikrometer der Drahtspitze ein und schalten Sie die Heizpotentiometer aus.

Wenn die Perle abgekühlt ist, entferne das Glas von der Spitze der Elektrode, um das Wolfram freizulegen. Um eine Spitze von etwa 15 Millimetern zu erhalten, stellen Sie die Polarisation auf die entsprechenden Parameter ein. Ziehen Sie an der Kapillare, um zwei Pipetten mit abgetrennter Spitze zu erhalten.

Montieren Sie eine Polpipette mit Modelliermasse auf einen Objektträger und brechen Sie die Spitze mit einer feinen Schere, einer Pinzette oder der flachen Seite eines Skalpells. Passen Sie den Winkel zwischen der Elektrode und dem Mehrzylinder leicht an, um eine bessere Haftung und ein dünneres Ensemble zu erhalten. Richten Sie die Wolframelektrode unter dem Mikroskop vorsichtig über der mehrläufigen Spitze aus.

Senken Sie nach dem Ausrichten die Elektrode ab, bis sie den Mehrzylinder berührt. Passen Sie die Nut zwischen den beiden oberen Zylindern an und schieben Sie dann die Spitze der Elektrode, bis sie 15 bis 20 Mikrometer aus der Spitze des Mehrfachzylinders herausragt. Tragen Sie nun einen kleinen Tropfen lichthärtenden Kleber auf das Wolfram und das Multi-Barrel-Ensemble in etwa 5 Millimetern Abstand von deren Spitzen auf.

Achten Sie darauf, dass der Kleber nicht an die Spitzen gelangt, um eine Verstopfung der Kanäle mit mehreren Zylindern zu vermeiden, und härten Sie den Kleber mit einer Blaulicht-LED-Lampe aus. Legen Sie nun das betäubte Tier auf eine Heizdecke, um seine Temperatur bei 38 Grad Celsius zu halten, und stabilisieren Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohrstangen und einem Beißstab. Tragen Sie dann Augengel auf, um die Augen zu schützen. Rasieren Sie anschließend die Kopfhaut und tragen Sie Povidon-Jod auf, um die Haut zu desinfizieren. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen und das Perastium zurückzuziehen, das den peridalen und den rostraleren Teil der Hinterhauptknochen bedeckt.

Tragen Sie anschließend eine dünne Schicht lichthärtenden Klebstoff auf den Schädel und die Basis des Kopfstifts auf. Warten Sie 10 Sekunden und platzieren Sie den Kopfstift über dem rostralen Bereich der Scheitelknochen entlang der Mittellinie. Verwenden Sie eine blaue Lichtquelle, um den Klebstoff 20 Sekunden lang auszuhärten, um eine effektive Haftfestigkeit zu erzielen.

Bohren Sie anschließend mit einem kleinen Bohrer zwei Löcher um und hinter der Basis des Kopfpfostens. Platzieren Sie eine Uhrenschraube in einem Bohrloch, die als zusätzlicher Kontaktpunkt zwischen dem Schädel und dem Kopftisch dient. Machen Sie eineinhalb Umdrehungen, um die Schrauben fest zu halten, und testen Sie mit einer Pinzette, ob sie nicht locker sind.

Führen Sie dann die Spitze des silbernen Erdungskabels in das dritte Loch ein und stellen Sie sicher, dass es die Dura berührt. Trage einen kleinen Tropfen wasserfesten Cyanacrylatkleber auf, um den Draht an den Schädel zu binden. Tragen Sie anschließend lichthärtendes Komposit auf, um die Verbindung des Kopfpfostens mit dem Schädel zu verstärken, indem Sie die Basis des Kopfpfostens, den unteren Teil des Silberdrahtes und die Schrauben abdecken.

Achten Sie darauf, nicht über Lambda hinaus zu erweitern, um den Zugriff während der Aufnahme zu ermöglichen und das Komposit mit einer Blaulichtquelle auszuhärten. Ziehe dann den Muskel im Nacken in der Nähe seines Ansatzes am Schädel zurück. Bohren Sie mit einem kleinen Trepan ein rundes Fenster direkt unter der Lambda-Naht und lateral der Mittellinie, um den Colliculus inferior freizulegen.

Legen Sie bei diesem Verfahren den Körper des Tieres in eine speziell angefertigte, mit Schaumstoff gepolsterte Rückhaltevorrichtung. Befestigen Sie den Kopfpfosten an einer Halterung, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist. Dies ist ein guter Zeitpunkt, um dem Tier eine flüssige Belohnung zu geben.

Decken Sie dann den Körper des Tieres mit einer Baumwolldecke ab und befestigen Sie sie locker mit einem Plastikhalbzylinder und Klebeband. Verwenden Sie eine Spritze mit einer flexiblen Spitze, um die Fässer mit den ausgewählten Medikamenten zu füllen. Setzen Sie die mehrläufige Elektrode mit dem Mikromanipulator auf ihre Halterung.

Legen Sie als Nächstes einen uncodierten Silberdraht in jeden Zylinder, so dass ein Ende die Lösung berührt und das andere Ende zugänglich ist. Verbinden Sie dann diese Enden mit dem Mikroiontophoresegerät. Verbinden Sie danach den Pluspol mit dem Ende der Wolframelektrode und den Erdungsanschluss mit dem Silberdraht, der die Dura kontaktiert.

Bewegen Sie anschließend die mehrläufige Elektrode, bis die Spitze die Oberfläche des Gehirns berührt. Tragen Sie warme, sterile Kochsalzlösung auf, um das Austrocknen des Hirngewebes zu verhindern. Wenden Sie an diesem Punkt einen Retentionsstrom an, um ein Austreten des Arzneimittels aus der Zylinderspitze zu verhindern, während Sie nach Aktivität in einer einzelnen Einheit suchen.

Aufzeichnung der neuronalen Aktivität und der iontophoretischen Anwendung von Gabazin. Hier ist der Frequenzgangbereich von vier aufgezeichneten Neuronen im Colliculus inferior vor und während der mikroiontophoretischen Injektion von Gabazin dargestellt. Die schwarzen Kreuze zeigen an, dass Frequenzen, die als seltene und sich wiederholende Klänge dargestellt werden, ausgewählt wurden.

Hier sind die akkumulierten Peristimulus-Zeit-Histogramme der neuronalen Reaktion auf alle Frequenzen und Intensitäten, die präsentiert werden, um den Reaktionsbereich vor und während der Injektion von Gabazin zu konstruieren. Die schwarzen Balken zeigen die Klangdauer an. Hier sind die Punktraster der Spike-Reaktion auf ein Frequenzpaar, das in Rot als selten und in Blau als repetitiver Stimulus vor und während der Anwendung von Gabazin dargestellt wird.

Der schattierte Hintergrund zeigt die Dauer des Stimulus an. Diese Punkt-Raster zeigen die Reaktionen an, wenn die relativen Wahrscheinlichkeiten der Parafrequenzen vertauscht wurden. Dieses Diagramm zeigt die Reaktionen einzelner Neuronen auf sieben Frequenzpaare, die vor und während der Gabe von Gabazin als seltener und repetitiver Klang dargestellt werden.

Und dieses Diagramm zeigt die SSA-Indizes der neuronalen Reaktion auf seltene und sich wiederholende Geräusche, die vor und während der Anwendung von Gabazin gemessen wurden. Sobald die beschriebene Prozedur beherrscht ist, ermöglicht sie die Anpassung der spezifischen Parameter entsprechend der neuronalen Struktur und dem Typ des interessierenden Neurons. Beim Versuch, Tieraufnahmen mit Kopfstützen durchzuführen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Aufzeichnungszeiten durch den Grad der Gewöhnung des Tieres bestimmt und begrenzt werden, aber ein wichtiger Vorteil ist, dass mehrere Aufzeichnungsschnitte an demselben Tier über mehrere Tage durchgeführt werden können, wodurch die Anzahl der verwendeten Tiere minimiert wird.

Durch die Durchführung der Mikroiontophorese mit Huckepack-Elektroden können andere Verfahren, wie z.B. die Injektion von neuronalen Transistoren, kombiniert werden, um zusätzliche Fragen wie die Quelle der Eingaben und das Projektionsziel von Neuronen innerhalb der Aufnahmestelle zu beantworten. Ein kritischer Punkt bei der Arbeit mit den wachen Tieren ist ihr Wohlbefinden, also überschreiten Sie niemals die in Ihrem Protokoll genehmigte Rückrufzeit und überwachen Sie bitte ständig, um Anzeichen von Unwohlsein zu überprüfen. Wenn dies der Fall ist, müssen Sie die Aufzeichnung sofort beenden.