Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die die Atemwege innervierenden Nodose-Neuronen des Vagusnervs zu markieren und zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der peripheren Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise: Welche identifizierbaren Eigenschaften besitzen die Atemwege innervierende Neuronen?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine robuste und hochdurchsatzfähige Methode zur gezielten Anreicherung und Isolierung spezifischer neuronaler Populationen bietet. Nach der Gewinnung der sensorischen Ganglien pipettieren Sie 500 µL der Gangliendissoziationslösung aus jedem Röhrchen ab, ohne die Ganglien zu stören. Geben Sie anschließend je ein Milliliter PBS zu jeder Probe hinzu und warten Sie, bis sich die Ganglien am Boden der Röhrchen abgesetzt haben.

Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie ein Milliliter Ganglien-Dissociationslösung, ergänzt mit Verdauungsenzym, zu den Neuronen hinzu, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern Fast Blue zur positiven Kontrollprobe. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für die je nach Alter des Verdauungsenzyms geeignete Zeit. Schütteln und klopfen Sie die Proben alle 15 Minuten kurz an, um sicherzustellen, dass die Ganglien von der Verdauungslösung bedeckt sind.

Während die Nervenzellen verdaut werden, langsam und vorsichtig 400 Mikroliter frisch zubereitete 12%-Dichtelösung über 400 Mikroliter 28%-Dichtelösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Probe geben. Es sollten zwei deutlich unterscheidbare Schichten sichtbar sein, wobei eine dunkler als die andere ist. Danach 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen zur Sortierung beschriften, jeweils ein Fast-Blau-positives und ein Fast-Blau-negatives Röhrchen pro Sortierprobe.

Am Ende der Verdauungszeit verwerfen Sie das Verdauungsenzym und waschen die Ganglien zwei Mal mit je einem Milliliter PBS, wie gerade gezeigt. Nach dem zweiten Waschschritt geben Sie 200 Mikroliter frische Gangliendissoziationslösung zu jedem Röhrchen hinzu. Anschließend pipettieren Sie die Ganglien mehrmals mit einer 200-Mikroliter-Pipette, die auf ein Volumen von 100 Mikrolitern eingestellt ist, auf und ab, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren, und achten dabei darauf, Blasenbildung zu vermeiden.

Wenn keine intakten Gewebestücke mehr sichtbar sind, pipettieren Sie die dissoziierte Zellsuspension unter festem Halten eines 70-Mikrometer-Zellsiebs mit einer Hand in die Mitte des Siebs. Spülen Sie anschließend das Dissoziationröhrchen mit 100 Mikrolitern frischer Ganglien-Dissoziationlösung aus, um zusätzliche Zellen zu gewinnen. Filtrieren Sie die Spülflüssigkeit durch das Sieb und aspirieren Sie mit einer neuen Pipettenspitze jegliche verbleibende zellhaltige Flüssigkeit von der Unterseite des Siebs, um sie der Zellsuspension hinzuzufügen.

Überlagern Sie nun vorsichtig alle 300 Mikroliter der Zellen auf die zuvor vorbereitete Dichtegradientenlösung. Sammeln Sie die Ganglien-Zellen durch Zentrifugation. Während die Zellen zentrifugiert werden, geben Sie 300 Mikroliter frisch zubereiteter Lysepufferlösung in das Sammelröhrchen für die Fast-Blue-positiven Zellen und 600 Mikroliter Lysepufferlösung in das Sammelröhrchen für die negativen Zellen, um sicherzustellen, dass die Umhüllungsflüssigkeit aus dem Sortiergerät den Lysepuffer nicht wesentlich verdünnt.

Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation vorsichtig die oberen 700 Mikroliter der Lösung, die den Großteil des Zelldebrises enthält. Anschließend mischen Sie 700 Mikroliter frische Ganglien-Dissociationslösung mit den verbleibenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut, um sie zu pelletieren, und entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend in 200 bis 300 Mikrolitern Sortier-Langendissociationslösung mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, die auf 200 Mikroliter eingestellt ist. Stellen Sie die Zellen bis zur Sortierung auf Eis. Nach der Reinigung der Ganglienzellen mittels FACS werden die Neuronen durch Vortexen für eine Minute in Puffer zur Zelllyse homogenisiert.

Mischen Sie die Zellen anschließend mehrmals mit einem Volumen 70 %igem Ethanol und überführen Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe in eine Säule für die Mikrozentrifuge. Zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 8.000 × g in einer Mikrozentrifuge und entsorgen Sie den Durchlauf. Wenn die gesamte Probe die Säule passiert hat, isolieren Sie die RNA gemäß Standardprotokollen zur RNA-Reinigung.

Anschließend verwenden Sie ein mikrofluidisches Elektrophorese-System, um die RNA-Qualität gemäß den Herstellerspezifikationen zu überprüfen. In diesen Diagrammen sind die negativen und positiven Fast-Blue-Kontrollen zur Einstellung der Sortiertore dargestellt. Die dissoziierten, mit Fast Blue markierten Nodosazellen können dann in Fast-Blue-positive und Fast-Blue-negative Populationen sortiert werden.

Die Sortier-Effizienz für diese Methode liegt zwischen 73 und 85 %, wobei durchschnittlich etwa 1.500 oder weniger Fast-Blau-positive und nahezu 60.000 Fast-Blau-negative Zellen gesammelt werden. Wie an diesem repräsentativen Beispiel beobachtet, können die durch mikrofluidische Elektrophorese erzielten 18S- und 28S-Peaks anschließend zur Berechnung der RNA-Integritätszahl verwendet werden, um die Qualität der extrahierten RNA zu bestimmen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von viereinhalb Stunden abgeschlossen werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Schritte zügig durchzuführen und frisch zubereitete Lösungen für die RNA-Extraktion zu verwenden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die neuronale Kultivierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche funktionellen Eigenschaften für die die Atemwege innervierenden Neuronen einzigartig sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der peripheren Neurobiologie den Weg, um die besonderen Eigenschaften einer spezifischen Population von Atemwegsinnervierenden Neuronen im Nodosus-Ganglion des Vagusnervs zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie spezifische Neuronen des Ganglion nodosum markiert und dissoziiert werden können, um anschließend für die RNA-Sequenzierung zu verwenden oder für funktionelle Untersuchungen zu platzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 2-Mercaptoethanol äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die Arbeit unter einem Abzug eingehalten werden sollten, wenn diese Verbindung verwendet wird.