Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die atemwegs-innervierenden Nodose-Neuronen des Vagusnervs zu markieren und zu isolieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der peripheren Neurobiologie zu beantworten. Welche identifizierenden Eigenschaften besitzen zum Beispiel, die die Atemwege innervieren?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine robuste Methode mit hohem Durchsatz für das Targeting und die Isolierung spezifischer neuronaler Populationen bietet. Nach der Entnahme der sensorischen Ganglien aspirieren Sie 500 Mikroliter Gangliendissoziationslösung aus jedem Röhrchen, ohne die Ganglien zu stören. Fügen Sie als Nächstes jeder Probe einen Milliliter PBS hinzu und warten Sie, bis sich die Ganglien am Boden der Röhrchen abgesetzt haben.

Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie einen Milliliter Gangliendissoziationslösung, die mit Verdauungsenzym ergänzt ist, zu den Neuronen, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern Fast Blue in das Positivkontrollröhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für die Zeit, die auf dem Alter des Verdauungsenzyms basiert. Schütteln und schnippen Sie die Schläuche alle 15 Minuten kurz, um sicherzustellen, dass die Ganglien mit der Aufschlusslösung bedeckt sind.

Während die Nervenzellen verdaut werden, fügen Sie langsam und vorsichtig 400 Mikroliter frisch zubereitete Lösung mit 12 % Dichte über 400 Mikroliter Lösung mit 28 % Dichte in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Probe hinzu. Es sollten zwei unterschiedliche Schichten sichtbar sein, von denen eine dunkler ist als die andere. Beschriften Sie anschließend 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen für die Sortierung, einschließlich eines positiven und eines negativen Fast Blue-Röhrchens pro Sortierprobe.

Am Ende der Verdauungsphase verwerfen Sie das Verdauungsenzym und waschen die Ganglien zweimal mit einem Milliliter PBS, wie gerade gezeigt. Nach der zweiten Wäsche geben Sie 200 Mikroliter frische Gangliendissoziationslösung in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf einem Volumen von 100 Mikrolitern die Ganglien mehrmals auf und ab, um die Zellen in eine einzige Zellsuspension zu dissoziieren, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden.

Wenn keine intakten Gewebestücke sichtbar sind, halten Sie ein 70-Mikron-Zellsieb fest in einer Hand und pipettieren Sie die dissoziierte Zelllösung in die Mitte des Siebs. Waschen Sie dann das Dissoziationsröhrchen mit 100 Mikrolitern frischer Gangliendissoziationslösung, um zusätzliche Zellen zu sammeln. Feilen Sie die Wäsche durch das Sieb und verwenden Sie eine neue Pipettenspitze, um alle verbleibenden zellhaltigen Lösungen auf der Unterseite des Siebs abzusaugen und der Zellsuspension hinzuzufügen.

Schichten Sie nun vorsichtig alle 300 Mikroliter der Zellen auf den zuvor vorbereiteten Dichtegradienten. Und sammeln Sie die Ganglienzellen durch Zentrifugation. Während sich die Zellen drehen, geben Sie 300 Mikroliter frisch zubereiteten Lysepuffer in das positive Sammelröhrchen von Fast Blue und 600 Mikroliter Lysepuffer in das negative Sammelröhrchen, um sicherzustellen, dass die Sortierscheidenflüssigkeit den Lysepuffer nicht signifikant verdünnt.

Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation vorsichtig die oberen 700 Mikroliter der Lösung, die den Großteil der Zelltrümmer enthalten. Mischen Sie dann 700 Mikroliter frische Gangliendissoziationslösung mit den restlichen Zellen. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand vorsichtig entsorgt.

Anschließend werden die Zellen in 200 bis 300 Mikrolitern Sortierganglien-Dissoziationslösung mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf 200 Mikroliter resuspendiert. Und legen Sie die Zellen auf Eis, bis sie zum Sortieren bereit sind. Nach der Reinigung der Ganglienzellen durch FACS homogenisieren Sie die Neuronen in einem Lysepuffer für eine Minute mit Vortexing.

Mischen Sie anschließend die Zellen mehrmals mit einem Volumen 70%Ethanol und geben Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe in eine Spin-Säule. Zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 8.000 x g in einer Mikrozentrifuge und verwerfen Sie den Durchfluss. Wenn die gesamte Probe durch die Spin-Säule geleitet wurde, extrahieren Sie die RNA gemäß den Standard-RNA-Aufreinigungsprotokollen.

Verwenden Sie dann ein mikrofluidisches Elektrophoresesystem, um die RNA-Qualität gemäß den Herstellerangaben zu testen. In diesen Diagrammen sind die negativen und positiven Fast Blue-Regler dargestellt, die zum Festlegen der Sortiergatter verwendet werden. Die dissoziierten Fast Blue Labeled Nodose-Zellen können dann in Fast Blue positive und Fast Blue negative Populationen sortiert werden.

Die Sortiereffizienz für dieses Verfahren beträgt 73 bis 85 %, wobei durchschnittlich etwa 1.500 oder weniger Fast Blue positive und fast 60.000 Fast Blue negative Zellen gesammelt werden. Wie bei dieser repräsentativen Probe beobachtet, können die durch mikrofluidische Elektrophorese erreichten 18S- und 28S-Peaks dann zur Berechnung der RNA-Integritätszahl verwendet werden, um die Qualität der extrahierten RNA zu bestimmen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in viereinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte schnell zu durchlaufen und frisch zubereitete Lösungen für die RNA-Extraktion zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die neuronale Kultivierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche funktionellen Eigenschaften sind für atemwegsinnervierende Neuronen einzigartig? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der peripheren Neurobiologie, um die einzigartigen Eigenschaften einer spezifischen atemwegs-innervierenden Population von Neuronen in den Nodose-Ganglien des Vagusnervs zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bestimmte Neuronen der Nodose-Ganglien markiert und dissoziiert, die dann für die RNA-Sequenzierung oder für funktionelle Studien plattiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 2-Mercaptoethanol äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Verwendung dieser Verbindung immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einer chemischen Haube getroffen werden sollten.