Name: Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Markierung und Isolierung luftwegs-innervierender Nodose-Neuronen des Nervus vagus bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht hochdurchsatzfähige RNA-Sequenzierung zur Analyse neuronaler Eigenschaften.

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Unterstützt von NIH gewähren R01HL105635 zu SEJ. Die Autoren möchten sich Diego V. Bohórquez für technische Beratung danken. Wir danken auch R. Ian Cumming für die technische Unterstützung und die Durchflusszytometrie im Duke Humanimpfstoff Institut Forschung Durchflusszytometrie Shared Resource Facility-Durchführung (Durham, NC). Die Durchflusszytometrie wurde im Regional Biocontainment Laboratory an der Duke durchgeführt, die teilweise Unterstützung für den Bau von den National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) erhalten.

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Duke University genehmigt. 1. Die intranasale Verabreichung von Fast Blue Für Fast Blue, zur Verwaltung der Farbstoff mindestens 2 Tage vor der Maus euthanizing. Der Farbstoff wird für bis zu acht Wochen andauern. <ol><li> Anesthetize die Maus mit Licht Inhalationsanästhesie (2,5% Sevofluran), bis zu atmen beginnt zu verlangsamen. </li><li> Verwenden, um eine 200 &amp; mgr; l-Pipette mit Filterspitzen zu langsam 40 ul Farbstofflösung vermitteln (0,4 mM Fast Blue, 1% Dimethylsulfoxid, DMSO, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) in das Nasenloch, Pausieren gelegentlich die Maus, um sicherzustellen, Absaugen der Lösung (1A). </li><li> Halten Sie die Maus vertikal, Kopf hoch, und sanft die Brust massieren der Farbstoff breitet sich in der Lunge zu gewährleisten. </li></ol> 2. Vorbereitung auf Dissection und Analyse Tag <ol><li> Bereiten Sie 10 ml0; Ganglia Dissoziationslösung (GADS) , indem die Inhaltsstoffe kombiniert , wie in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Führen Sie die RNA-Extraktion in einem speziellen Labor-Bereich. Vor Versuchsbeginn, saubere Oberflächen mit 70% Ethanol, 10% Bleiche und RNase Dekontamination Reagens. Dazu gehört auch die RNA-Zentrifuge, alle Rohrgestelle und Pipetten. Stellen Sie sicher, es gibt nur spezielle Filterspitze Boxen für die RNA-Einsatz. Verwenden Sie dieses Gerät und Bereich nicht für die DNA-Präparation, da dies die Proben kontaminieren. </li><li> Mischen Sie frische 70% und 80% Ethanol mit RNase-freiem Wasser. Vorbereitung 1 ml pro Probe in die RNA-Extraktion verwendet werden. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Menge </td></tr><tr><td> Erweiterte DMEM / f12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (kein Vitamin A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Reagenzmischung für Ganglia Dissoziationslösung (gads). 3. Dissection Verfahren <ol><li> Füllen Sie 1,5-ml-Röhrchen mit 500 ul gads, eine für jede Versuchsprobe, eine für eine positive Sortierkontrolle und eine für eine negative Sortierkontrolle. Shop Röhrchen auf Eis im gesamten Dissektion. </li><li> Präparieren Sie die Ganglion nodosum und zwei Teilschnitte machen Dissoziation zu erleichtern, ist es dann in der Versuchsprobenröhrchen setzen. Bitte beachten Sie die folgende JoVE Protokoll für die Präparation der nodose Ganglien 16 und DRG 17. </li><li> Sezieren und teilweise nicht-markierten ganglia, wie die Spinalganglien (DRG) geschnitten, für die Sortiersteuerung. Verwenden Sie zwei Ganglien für die positive Kontrolle und zwei Ganglieine für die Negativkontrolle. </li><li> Um genügend nodose Neuronen für eine erfolgreiche Sortierung zu erhalten, kombinieren Glien von 5 Mäusen in einem experimentellen Verfahren Probenröhrchen mit gads. </li></ol> 4. Sensorische Ganglia Dissociation <ol><li> Pipette aus 500 ul gads, Ganglien in der Röhre zu verlassen. Waschen Sie Ganglien einmal mit 1 ml PBS Zugabe warten Ganglien auf den Boden des Rohres zu regeln, dann Pipette aus PBS. </li><li> 1 ml GADS und 22 &amp; mgr; l Verdauungsenzym (Kollagenase I / II und Protease - Mischung, 2,5 mg / ml in H 2 O) in jedes Röhrchen. </li><li> In 20 ul Fast Blue (5,26 mM) mit dem positiven Steuerrohr. </li><li> Setzen Sie die Röhrchen in einem Wasserbad oder Heizblock bereits bei 37 ° C eingestellt. Anmerkung: Der Zeitpunkt des ganglia Verdauung von dem Alter des Aufschlusses Enzyms abhängt. Innerhalb von 1 Monat nach der Verdauung Enzym löst, verdauen für 30 Minuten innerhalb von 2 - 6 Monate für 45 min verdauen. Wenn das Enzym über 6 Monate alt ist, verdauen Ganglien foder 60 min. </li><li> Alle 15 min schütteln Röhrchen kurz und schnippen sie Ganglien, um sicherzustellen, werden von der Lösung bedeckt. </li><li> Während Ganglien verdaut werden, Dichtegradienten mit einer Partikellösung (kolloidalen Silicapartikel, beschichtet mit Polyvinylpyrrolidon) herzustellen. <ol><li> Mischen Sie 12% Partikellösung in Gads, 500 &amp; mgr; l pro Probe. </li><li> Mischen Sie 28% Partikellösung in Gads, 500 &amp; mgr; l pro Probe. </li><li> Langsam und vorsichtig für jede Probe 400 ul 12% Dichte Lösung oben auf 400 &amp; mgr; l 28% Dichte Lösung in einem frischen 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. Sie nicht zulassen, dass die beiden Schichten zu vermischen. Zwei verschiedene Schichten sollte in dem Röhrchen sichtbar sein; ein dunkler als der andere. </li></ol></li><li> Während Ganglien verdaut werden, beschriften neue 1,5-ml-Sammelröhrchen für die Sortierung (ein Fast Blue positive und eine Fast Blue negativen Röhrchen pro Sortier Probe). Je nach den Anforderungen Sortieranlage müssen diese Rohre haben abnehmbaren Deckel, um nicht zu interferierene mit dem Zellsortierer. </li><li> Nach der entsprechenden Verdauungszeit, entfernen gads mit Verdauungsenzym und waschen Ganglien zweimal mit 1 ml PBS. In 200 ml frisches gads in jedes Röhrchen. </li><li> Verwenden Sie eine 200 ul-Pipette auf 100 &amp; mgr; l Volumen und Pipette Ganglien nach oben und unten mehrmals Zellen auseinander zu brechen. Wiederholen, bis kein intaktes Stück Gewebe zu sehen ist. Vermeiden Blasen in der Lösung. </li><li> Pass dissoziierten Zellen durch eine 70 um Zelle Sieb. </li><li> Fügen Sie weitere 100 ul gads auf die ursprüngliche Dissoziation Röhre alle verbleibenden Streu Zellen links zu holen und die zusätzliche Lösung durch die Zelle Sieb passieren. Unter Verwendung einer neuen Pipettenspitze sammeln jegliches verbleibende zellhaltigen Flüssigkeit, die durch das Sieb passiert hat und auf das Netz geklammert. Das Endvolumen der in GADS suspendierten Zellen beträgt 300 &amp; mgr; l. </li><li> die 300 &amp; mgr; l der Zellen auf der Oberseite der bisherigen Dichtegradienten sorgfältig Schicht. Vermeiden Blasen und Mischen von cells mit den Dichteschichten. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 2900 xg bei RT. </li><li> Während Zellen in der Zentrifuge sind, Lyse-Puffer (1 ml pro Versuchsprobe) mischen wie folgt: 10 &amp; mgr; l 2-Mercaptoethanol in 1 ml Puffer RLT (von RNA-Extraktions-Kits). <ol><li> In 300 ul Lysepuffer Fast Blue positive Sammelröhrchen und 600 &amp; mgr; l Fast Blue negativen Sammelröhrchen (Röhrchen aus Schritt markiert 4.7). Dieses Volumen hängt von der Anzahl der Zellen zu erwarten gesammelt werden. Für &lt;2.000 Zellen, fügen Sie 300 ul für&gt; 7.000 Zellen 600 ul hinzufügen. Dadurch wird die Sortier Hüllflüssigkeit gewährleisten nicht wesentlich den Lysepuffer verdünnt. </li></ol></li><li> Sobald Zentrifugation abgeschlossen ist, sorgfältig entfernen und die oberen 700 ul Schicht verwerfen. Diese Schicht enthält die Mehrheit der Zelltrümmer, die sonst mit Zellsortierung stören. </li><li> In 700 ul frisch gads auf die verbleibende Zelle enthaltende Lösung und pipettierente nach oben und unten mehrmals zu mischen. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 2900 xg Zellen zu pelletieren. </li><li> Während Zellen in der Zentrifuge befinden, Mischungs GADs (500 ul pro Probe) das Sortieren durch Zugabe von 5 ul DNase (10 mg / ml) zu 1 ml GADS. </li><li> Sobald Zentrifugation durchgeführt wird, sorgfältig entfernen und Überstand verwerfen, das Zellpellet zu verlassen. </li><li> Re-suspend Zellpellet in 200 bis 300 &amp; mgr; l Sortierung gads durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 1000 ul Pipette auf 200 &amp; mgr; l mehrmals. Legen Sie Proben auf Eis. Zellen sind nun bereit, sortiert werden. </li></ol> 5. Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung Hinweis: Dieser Abschnitt operative Kenntnisse in einer FACS-Sorter oder die Hilfe von Fachpersonal erfordert. <ol><li> 1 &amp; mgr; l Propidiumjodid (PI) Stammlösung (50 ug / ml) zu jeder Probe für die Lebensfähigkeit der Zellen zu testen. Split negative Kontrolle in zwei Röhren, eines mit PI und eine ohne. PI bindet DNA nur in tote Zellen. Obnach den ersten paar Arten gibt es keine toten Zellen zu markieren, wird die Verwendung von PI nicht benötigt. </li><li> Transport - Zellen - Zytometrie Instrument fließen, z. B., BD FACS AriaII Diva 8 - Software ausgeführt wird , auf dem Eis. </li><li> Da die Größe der Zellen in dieser Population variabel ist, verwenden Sie eine große Düse (100 &amp; mgr; m) zum Sortieren. Zur Verringerung der Menge an Stress Erfahrung, um die Zellen und erhöhen die Lebensfähigkeit der Zellen niedrigem Druck verwenden (20 psi). </li><li> Verwenden Sie die FACS-Sorter Software die Analyse Plots, Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung (SSC), Fast Blue einzurichten, und PI, wenn nötig. </li><li> Um erneut zu suspendieren Zellen, Strudel sanft die Probe kurz bevor sie in den Sortierer geladen werden. </li><li> Beginnen Sie mit der negativen Kontrolle, kein Fast Blue oder PI, der Gate - Schwelle (2A) zu setzen. Dadurch wird die Menge der Autofluoreszenz in der Zellpopulation zu bestimmen. Optional: Führen Sie die negative Probe mit PI zu erkennen, ob es eine Population von toten Zellen ist. </li><li> Sortieren Sie die positive Kontrollprobe (incubated mit Fast Blue), Kompensationsparameter einzustellen. </li><li> Sobald die Tore und die Parameter festgelegt sind, beginnen die experimentellen Proben zu sortieren. Proben werden in die vorbereiteten Sammelröhrchen, enthaltend RNA Lysepuffer sortiert. </li><li> Halten Sie sortierten Proben auf Eis, bis die Zellsortierung abgeschlossen ist. </li><li> Beginnen RNA-Extraktionsschritt unmittelbar nach Zellen sortiert werden. </li></ol> 6. RNA-Extraktion <ol><li> Vortex sortierten Zellen in Lysepuffer für 1 min zu homogenisieren. </li><li> 1 Volumen 70% Ethanol und Mischung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Übertragung von bis zu 700 &amp; mgr; l der Probe auf einer Spin-Säule. Zentrifuge für 15 sec bei 8.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. <ol><li> Wiederholen, bis das Gesamtvolumen der Probe durch die Spin-Säule geleitet wird. </li></ol></li><li> In 350 &amp; mgr; l Puffer RW1 und weiterhin die RNA-Reinigungsverfahren, einschließlich der DNase Behandlungsschritt nach der Protoco des Herstellersl für Zellen. </li><li> Sobald RNA extrahiert wurde, testen Sie die RNA-Qualität eines mikrofluidischen Elektrophorese-System gemäß den Spezifikationen des Herstellers. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Atemwegs-innervating Neuronen in der nodose Ganglien des Nervus vagus zu zielen. Einmal markiert, werden die Ganglien sanft distanzierte optimal Zellzahlen und die Lebensfähigkeit zu erhalten. Diese Neuronen sind dann FAC sortiert direkt in Lysepuffer und RNA extrahiert wird. Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Fähigkeit, zu zielen, zu isolieren, und die Qualität einer bestimmten Sinneszellpopulation zu erhalten. Genexpression wird in diesem kleinen Population von Neuronen b...

Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Nerven in sensorischen Ganglien, wie die Spinalgan, trigeminal oder nodose ganglia befindet. Jedes sensorische ganglion innervates spezifischen Regionen des Körpers und enthält Zellen, die getrennte Organe und Gewebe innerhalb dieser Region innervieren. So werden zum Beispiel die Dorsalwurzelganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im ganzen Körper und Gliedmaßen, während die Trigeminalganglien im Schädel befinden, enthält Neuronen, die das Gesicht, Augen, Hirnhaut oder der oberen Atemwege 1 innervate, 2. Die nodose Ganglien des Nervus vagus im Hals unterhalb des Schädels und enthält Zellkörper , die Nervenfasern im gesamten Magen - Darm - Trakt, Herz erstrecken und unteren Atemwege und Lungen 3. Beim Menschen steht das Ganglion nodosum allein, jedoch in der Maus, um es fusioniert istmit dem Ganglion jugulare, die auch die Lunge 4 innervates. Das fusionierte Ganglion wird oft die Gurgel / nodose Komplex, Vagus - Ganglion oder einfach Ganglion nodosum 5 genannt. Hier wird bezeichnet als das Ganglion nodosum. Afferenzen der nodose passieren Informationen von den Eingeweiden zum Kern des einsamen-Darm-Trakt (NTS) im Hirnstamm. Sensorischen Input zu diesem einzigartigen Ganglion steuert eine Vielfalt von Funktionen, wie Darmmotilität 6, Herzfrequenz 7, Atmung 8,9 und Reizaktivierte Atmungsreaktionen 10,11. Bei dieser Vielfalt der Funktionen und innervated Organe ist es entscheidend, organspezifische Subpopulationen des Ganglion nodosum, um einzelne zu studieren neuronalen Bahnen zu zielen und zu isolieren. Es können jedoch die geringe Größe des nodose und die begrenzte Anzahl von Neuronen gegebenen enthält dieses keine triviale Aufgabe. Jede Maus Ganglion nodosum enthält ungefähr 5.000 Neuronen 12zusätzlich zu einer umfangreichen Bevölkerung von Satellitenzellen zu unterstützen. Von den 5.000 nodose Neuronen, nur 3 bis 5% innervate die Atemwege. Daher werden alle funktionalen, morphologische oder molekulare Veränderungen im Atemweg-innervating Neuronen, durch Atemstimulation oder Pathologien, in der dicht gepackten Ganglion nodosum verloren. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung Neuronen entwickelt, die die Atemwege innervate. Die Atemwege wurden mit einem fluoreszierenden Markierungsfarbstoff ausgesetzt, um die nachfolgenden innervating nodose Neuronen zu identifizieren. Fast Blue wurde von Neuronen und wandert schnell in ihre Zellkörper aufgenommen , wo es für bis zu acht Wochen 13 zurückgehalten wird - 15. Einmal identifiziert, eine sanfte, aber wirksame, Dissoziation Protokoll verwendet wurde, Farbstoffmarkierung und die Lebensfähigkeit von Zellen fluoreszenzaktivierte Zell (FAC) Sortierung zu erhalten. Sortierte Zellen werden verwendet, um hohe Qualität Ribonukleinsäure (RNA) extrahieren Genexpression oder f, um zu bestimmenoder andere Downstream-Genanalyse. Dieses Protokoll stellt eine nützliche und robuste Technik zur Isolierung von sensorischen Neuronen, die ein Gewebe von Interesse innervate.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>Bestand 2 mg/ml in Wasser</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 rot Nissle Färbung</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Saline (PBS) Ca und Mg frei</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (kein Vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nervenwachstumsfaktor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>Lager 50 &Mikro; g/ml in PBS/10% FBS-Aufschlussenzym</td></tr><tr><td>, Liberase DH Roche</td><td></td><td>5401054001</td><td>Forschungsqualität 2,5 mg/ml in</td></tr><tr><td>Wasserpartikellösung (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & micro; m cell Sieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase freies Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase Dekontaminationsreagenz, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraktionskit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase Kit, RNase-freies DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>schaft 10 mg/ml in 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>schaft 10 & micro; g/ml im PBS</td></tr><tr><td>Mikrofluidischen Elektrophoresesystem (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine methode zum ziel und isolieren airway-innervating sensorischen neuronen bei mäusen

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Neuronen innerhalb der sensorischen Ganglien. Sensorischen Ganglien ein spezifisches Organ oder Teil des Körpers innervieren. Zum Beispiel werden die Spinalganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im gesamten Körper und Gliedmaßen. Die Trigeminalganglien sind im Schädel und innervate das Gesicht befindet, und der oberen Atemwege. Vagal Afferenzen der nodose Ganglien erstrecken sich in den Darm, Herz und Lunge. Die nodose Neuronen steuern, um eine Vielfalt von Funktionen wie: Atemfrequenz, Reizung der Atemwege und Husten Reflexe. Somit, um ihre Funktion zu verstehen und zu manipulieren, ist es entscheidend Atemweg spezifischen neuronalen Subpopulationen zu identifizieren und zu isolieren. Bei der Maus werden die Atemwege zur retrograden Tracing von Atemwegsspezifischen nodose Neuron zu einem fluoreszierenden Tracer-Farbstoff, Fast Blue, ausgesetzts. Die nodose Ganglien dissoziiert und Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung verwendet wird Farbstoff-positiven Zellen zu sammeln. Als nächstes wird aus positiven Zellen Farbstoff für die Sequenzierung der nächsten Generation extrahiert hoher Qualität Ribonukleinsäure (RNA). Mit dieser Methode Atemwegs spezifische neuronale Genexpression bestimmt wird.

Unter Verwendung dieses Verfahrens Atemweg-innervating Neuronen werden durch intranasal Einträufeln Fast Blue (1A) gekennzeichnet. Nach zwei Tagen erscheinen Fast Blue markierten Zellen in der nodose ganglia (Abbildung 1C). Diese Zellen machen 3 - 5% der gesamten neuronalen Population der nodose Ganglien. Andere retrograden Farbstoffe, die für diesen Zweck verwendet wurden, umfassen DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin...

Organspezifische sensorische Neuronen sind schwer zu identifizieren. Fast Blue Tracing wird verwendet, um Nodose-Neuronen zu identifizieren, die die Atemwege für die Zellsortierung innervieren. Sortierte Nodose-Neuronen werden verwendet, um hochwertige Ribonukleinsäure (RNA) für die Sequenzierung zu extrahieren. Mit Hilfe dieses Protokolls wird die Genexpression von atemwegsspezifischen Neuronen bestimmt.

Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die die Atemwege innervierenden Nodose-Neuronen des Vagusnervs zu markieren und zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der peripheren Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise: Welche identifizierbaren Eigenschaften besitzen die Atemwege innervierende Neuronen?Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine robuste und hochdurchsatzfähige Methode zur gezielten Anreicherung und Isolierung spezifischer neuronaler Populationen bietet. Nach der Gewinnung der sensorischen Ganglien pipettieren Sie 500 µL der Gangliendissoziationslösung aus jedem Röhrchen ab, ohne die Ganglien zu stören. Geben Sie anschließend je ein Milliliter PBS zu jeder Probe hinzu und warten Sie, bis sich die Ganglien am Boden der Röhrchen abgesetzt haben.Entfernen Sie dann das PBS und geben Sie ein Milliliter Ganglien-Dissociationslösung, ergänzt mit Verdauungsenzym, zu den Neuronen hinzu, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern Fast Blue zur positiven Kontrollprobe. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für die je nach Alter des Verdauungsenzyms geeignete Zeit. Schütteln und klopfen Sie die Proben alle 15 Minuten kurz an, um sicherzustellen, dass die Ganglien von der Verdauungslösung bedeckt sind.Während die Nervenzellen verdaut werden, langsam und vorsichtig 400 Mikroliter frisch zubereitete 12%-Dichtelösung über 400 Mikroliter 28%-Dichtelösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Probe geben. Es sollten zwei deutlich unterscheidbare Schichten sichtbar sein, wobei eine dunkler als die andere ist. Danach 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen zur Sortierung beschriften, jeweils ein Fast-Blau-positives und ein Fast-Blau-negatives Röhrchen pro Sortierprobe.Am Ende der Verdauungszeit verwerfen Sie das Verdauungsenzym und waschen die Ganglien zwei Mal mit je einem Milliliter PBS, wie gerade gezeigt. Nach dem zweiten Waschschritt geben Sie 200 Mikroliter frische Gangliendissoziationslösung zu jedem Röhrchen hinzu. Anschließend pipettieren Sie die Ganglien mehrmals mit einer 200-Mikroliter-Pipette, die auf ein Volumen von 100 Mikrolitern eingestellt ist, auf und ab, um die Zellen in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren, und achten dabei darauf, Blasenbildung zu vermeiden.Wenn keine intakten Gewebestücke mehr sichtbar sind, pipettieren Sie die dissoziierte Zellsuspension unter festem Halten eines 70-Mikrometer-Zellsiebs mit einer Hand in die Mitte des Siebs. Spülen Sie anschließend das Dissoziationröhrchen mit 100 Mikrolitern frischer Ganglien-Dissoziationlösung aus, um zusätzliche Zellen zu gewinnen. Filtrieren Sie die Spülflüssigkeit durch das Sieb und aspirieren Sie mit einer neuen Pipettenspitze jegliche verbleibende zellhaltige Flüssigkeit von der Unterseite des Siebs, um sie der Zellsuspension hinzuzufügen.Überlagern Sie nun vorsichtig alle 300 Mikroliter der Zellen auf die zuvor vorbereitete Dichtegradientenlösung. Sammeln Sie die Ganglien-Zellen durch Zentrifugation. Während die Zellen zentrifugiert werden, geben Sie 300 Mikroliter frisch zubereiteter Lysepufferlösung in das Sammelröhrchen für die Fast-Blue-positiven Zellen und 600 Mikroliter Lysepufferlösung in das Sammelröhrchen für die negativen Zellen, um sicherzustellen, dass die Umhüllungsflüssigkeit aus dem Sortiergerät den Lysepuffer nicht wesentlich verdünnt.Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation vorsichtig die oberen 700 Mikroliter der Lösung, die den Großteil des Zelldebrises enthält. Anschließend mischen Sie 700 Mikroliter frische Ganglien-Dissociationslösung mit den verbleibenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut, um sie zu pelletieren, und entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig.Suspenderen Sie die Zellen anschließend in 200 bis 300 Mikrolitern Sortier-Langendissociationslösung mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, die auf 200 Mikroliter eingestellt ist. Stellen Sie die Zellen bis zur Sortierung auf Eis. Nach der Reinigung der Ganglienzellen mittels FACS werden die Neuronen durch Vortexen für eine Minute in Puffer zur Zelllyse homogenisiert.Mischen Sie die Zellen anschließend mehrmals mit einem Volumen 70 %igem Ethanol und überführen Sie bis zu 700 Mikroliter der Probe in eine Säule für die Mikrozentrifuge. Zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 8.000 × g in einer Mikrozentrifuge und entsorgen Sie den Durchlauf. Wenn die gesamte Probe die Säule passiert hat, isolieren Sie die RNA gemäß Standardprotokollen zur RNA-Reinigung.Anschließend verwenden Sie ein mikrofluidisches Elektrophorese-System, um die RNA-Qualität gemäß den Herstellerspezifikationen zu überprüfen. In diesen Diagrammen sind die negativen und positiven Fast-Blue-Kontrollen zur Einstellung der Sortiertore dargestellt. Die dissoziierten, mit Fast Blue markierten Nodosazellen können dann in Fast-Blue-positive und Fast-Blue-negative Populationen sortiert werden.Die Sortier-Effizienz für diese Methode liegt zwischen 73 und 85 %, wobei durchschnittlich etwa 1.500 oder weniger Fast-Blau-positive und nahezu 60.000 Fast-Blau-negative Zellen gesammelt werden. Wie an diesem repräsentativen Beispiel beobachtet, können die durch mikrofluidische Elektrophorese erzielten 18S- und 28S-Peaks anschließend zur Berechnung der RNA-Integritätszahl verwendet werden, um die Qualität der extrahierten RNA zu bestimmen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von viereinhalb Stunden abgeschlossen werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Schritte zügig durchzuführen und frisch zubereitete Lösungen für die RNA-Extraktion zu verwenden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die neuronale Kultivierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche funktionellen Eigenschaften für die die Atemwege innervierenden Neuronen einzigartig sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der peripheren Neurobiologie den Weg, um die besonderen Eigenschaften einer spezifischen Population von Atemwegsinnervierenden Neuronen im Nodosus-Ganglion des Vagusnervs zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie spezifische Neuronen des Ganglion nodosum markiert und dissoziiert werden können, um anschließend für die RNA-Sequenzierung zu verwenden oder für funktionelle Untersuchungen zu platzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 2-Mercaptoethanol äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die Arbeit unter einem Abzug eingehalten werden sollten, wenn diese Verbindung verwendet wird.

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Neurowissenschaften

Wiederholte Messungen von Nagetier Atemfunktion und Probenahme von Atemwegs Entzündungszellen sind wünschenswert, aber in der Regel nicht möglich. Hier beschreiben wir eine wiederholbare Methode für oral Intubation Mäuse, wiederholte Messungen der Atemwege Hyperreaktivität und die Entnahme von Atemwegs-inflammatorischen Zellen ermöglicht.

Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die...

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Dieses Video zeigt die Isolierung von Zellen aus den sensorischen Ganglien von Mäusen. Ganglien werden einer enzymatischen Verdauung unterzogen, um die extrazelluläre Matrix aufzulösen. Die einzelnen Zellen werden dann durch Filtrierung durch ein Zellsieb gesammelt, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation zur Entfernung von Ablagerungen. Schließlich werden gewaschen und zentrifugiert, um die isolierten Zellen für die zukünftige Analyse zu sammeln.

Isolierung von Zellen aus sensorischen Ganglien

Dieses Video zeigt die elektrophysiologische Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs) bei Mäusen mit einer perforierten Patch-Clamp-Technik. Das olfaktorische Epithel, das OSNs mit Fluorophor-markierten Geruchsrezeptoren enthält, wird von einer Maus isoliert und in einer Aufzeichnungskammer gesichert. Eine Aufzeichnungspipette wird an den dendritischen Knopf eines OSN geklemmt, und Nystatin in der Pipette perforiert die Membran, um eine elektrische Verbindung mit der Zelle...

Perforierte Patch-Clamp-Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen bei Mäusen

Wir haben eine einfache, zuverlässige und relativ kostengünstiges Verfahren zur Intubation bei Mäusen durch direkte Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum entwickelt. Diese Technik ist atraumatisch und für wiederholte Messungen bei chronischen Experimente eingesetzt werden. Wir finden es besser als zuvor berichtet, Tracheostoma oder chirurgischen Techniken.

Intubation bei Mäusen<em&gt; Über</em&gt; Direkte Laryngoskopie Mit einem Otoskop

Wir präsentieren ein chirurgisches Protokoll, das detailliert beschreibt, wie eine Schnitt- oder Quetschaxotomie am Gesichtsnerv in der Maus durchgeführt wird. Die Axotomie des Gesichtsnervs kann eingesetzt werden, um die physiologische Reaktion auf Nervenverletzungen zu untersuchen und therapeutische Techniken zu testen.

Facial Nerve Axotomie bei Mäusen: Ein Modell zur Motoneuron Reaktion auf eine Verletzung Studieren

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.

Wiederholte orotracheale Intubation bei Mäusen

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die chirurgische Entfernung der postganglionären lumbalen sympathischen Neuronen bei einer Maus vor. Dieses Verfahren wird eine Vielzahl von Studien ermöglichen, die darauf abzielen, die Rolle der sympathischen Innervation in distalen Gewebezielen zu untersuchen.

Chirurgische lumbale Sympathektomie bei Mäusen

Diese Studie stellt eine chirurgische Manipulation vor, um das T-DRG in anästhesierten Mäusen für die in vivo Kalziumbildgebung freizulegen, zusammen mit synchronen EKG-Aufzeichnungen. Diese Methode stellt ein hochmodernes Werkzeug dar, um die periphere elektrische Nervenstimulation und die Eingänge der thorakalen viszeralen Organe sowie deren Wechselwirkungen auf der primären sensorischen Ebene zu untersuchen.

In-vivo-Calcium-Bildgebung und EKG-Aufzeichnung von thorakalen dorsalen Wurzelganglien (DRG) zur Untersuchung der peripheren Nervenstimulation

In dieser Studie wurden Husten- und Niesmodelle bei Mäusen etabliert, indem spezifische Reize auf die Luftröhre und die Nasenhöhle angewendet wurden, und es wurde eine audiobasierte Methode entwickelt, um zwischen Husten und Niesen von Mäusen zu unterscheiden, indem Unterschiede in ihren akustischen Signalen analysiert wurden.<br...

Präzise Induktion und Unterscheidung von Husten- und Niesreflexen bei Mäusen

Lernen Sie eine Methode zur Markierung und Isolierung luftwegs-innervierender Nodose-Neuronen des Nervus vagus bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht hochdurchsatzfähige RNA-Sequenzierung zur Analyse neuronaler Eigenschaften.

Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen

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