Name: Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie die selektive Gewinnung von marginierenden hepatischen Leukozyten aus Ratten- oder Mäuslebern durch erzwungene Perfusion. Diese Methode liefert reine Leukozyten aus den Lebersinusoiden für Immunologie- und Hepatologieforschung.

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Die Autoren und diese Arbeit wurden durch NIH/NCI Grant # R01CA172138 (an SBE) unterstützt.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität Tel Aviv genehmigt. 1. Ratten-Protokoll <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie heparinisiertem PBS (30 Einheiten / ml) Lösung verwendet werden, bei Raumtemperatur (RT) durch Zugabe von 30 Einheiten frei von Konservierungsstoffen Heparin pro ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) 1x Lösung. Berechnen Sie 35 ml pro Tier. </li><li> Pass heparinisiertem PBS durch die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente - 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, 2 hemostats und Zahngewebe Zange (Autoklav bei 121 ° C für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung). </li></ol></li><li> Perfusion der Leber und Sammlung von MH-Leukozyten <ol><li> Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Als Vorsichtsmaßnahme ein 50-ml-Tube eine Isofluran enthält-soaked Polster um die Ratte den Kopf, bis seine Brusthöhle zu öffnen. </li><li> Öffnen Sie die Peritonealdialyse und Brusthöhlen, die Leber und die Herz-Lungen-Komplex unmittelbar nach Beendigung der Atmung aussetzen. Vermeiden Sie durch diesen Prozess Blutungen. <ol><li> Genauer gesagt, starten Sie den Schnitt an der unteren Bauchmittellinie Punkt, ohne Beschädigung der inneren Organe und des Fortschritts zu beiden Seiten schräg zu den Rippen, um durch sie zu oberen Brusthöhle Ebenen schneiden. </li></ol></li><li> Innerhalb von etwa einer Minute, zu sammeln, so viel Blut wie möglich (~ 6 ml einer 250 g Tier) aus dem rechten Ventrikel in eine Spritze. </li><li> Klemmen Sie die Schwanz Hohlvene mit einem hemostat so nah wie möglich an das Herz, die Sammlung des Perfusat zu ermöglichen. </li><li> Ziehen Sie die Eingeweide heraus und außerhalb des Tieres in die rechte Ecke des Experimentators, die Pfortader zu belichten. </li><li> Legen Sie eine 25 G IV-Katheter, der mit einer Schlauchpumpe in die Pfortader, wie Schwanz- wie möglich,aber rostral der Milzvene. </li><li> Legen Sie eine 25 G Butterfly-Nadel, die mit einer 5-ml-Spritze, in die untere Hohlvene, kaudal der hemostat. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 3 ml / min und sanft die ersten ml Perfusat sammeln, die mit Blut in die Spritze kontaminiert sind. Fortfahren, bis das Perfusat Farbe erblasst rot (ca. 3-5 ml). Beachten Sie, dass die Farbe der Leber verändert sich in Richtung hellbraun. </li><li> Ohne die peristaltische Pumpe zu stoppen, ersetzen Sie die 5 ml Ernte Spritze mit einer 20 ml Ernte Spritze und sammeln mindestens 20 ml Leber Perfusat eine höhere Geschwindigkeit der Perfusion verwendet wird (bis zu 4 ml / min). Kontinuierlich überwacht die Perfusat Strom in die Sammel Spritze, und vermeiden Sie Vakuum, das zu stark ist (was die Nadel durch das Zusammenlegen der Hohlvene Wände verstopfen können). </li><li> Terminate Perfusion, wenn die Farbe der Leber bis hellbraun dreht. </li></ol></li><li> Leukozyten-Extraktion <ol&gt; <li> Zentrifugieren Sie die Perfusat für 10 Minuten bei 400 · g, 24 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren </li><li> 10 ml PBS, Zentrifugation bei 400 xg für 10 min und der Überstand absaugen. Basierend auf Studienziele, verwenden Vorbereitung wie es ist, oder zusätzliche Reinigungen durchführen (zB Dichtegradienttrennmittel). <ol><li> Insbesondere Schicht 4 ml Perfusat über 4 ml Dichtegradienttrennmittel Masse in einem 50 cc Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen bei 754 xg, RT, 30 min mit der Pause ab. </li><li> Besorgen Sie sich die einkernigen Schichten an der Dichtegradienttrennmittel-Überstand-Schnittstelle durch manuelles Pipettieren, Waschen in PBS, und legen Sie in einem 5-ml-Tube. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Maus-Protokoll <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie heparinisiertem PBS (30 Einheiten / ml) Lösung bei Raumtemperatur (RT) durch Zugabe von 30 Einheiten frei von Konservierungsstoffen Heparin pro ml Phosphat verwendet werden (PBS) 1x solution. Berechnen Sie 20 ml pro Tier. </li><li> Pass heparinisiertem PBS durch die peristaltische Pumpe Leitungen und den Schmetterling Nadeln Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente - 2 Paar Scheren, abgestumpft kantigen Zange, 2 hemostats und Zahngewebe Zange (Autoklav bei 121 ° C für mindestens 30 min auf die Schwerkraft (trocken) Einstellung). </li></ol></li><li> Perfusion der Leber und Sammlung von MH-Leukozyten <ol><li> Euthanize das Tier durch eine Überdosis von 8% Isofluran. Als Vorsichtsmaßnahme, legen Sie ein 15-ml-Röhrchen eine Isofluran-getränkten Polster um die Maus Kopf bis zum Öffnen seiner Brusthöhle enthält. </li><li> Befestigen Sie die Schenkel der Maus auf ein Bett. </li><li> Öffnen Sie die Peritonealdialyse und Brusthöhlen, die Leber und die Herz-Lungen-Komplex unmittelbar nach Beendigung der Atmung aussetzen, intakt den unteren Aspekt der Membran zu halten (um eine Entleerung Brusthöhle Pool). Vermeiden Sie durch diesen Prozess Blutungen. <ol><li> Genauer gesagt, starten Sie den Einschnitt am unterenBauchmittellinie Punkt, ohne Beschädigung der inneren Organe und des Fortschritts zu den beiden diagonal gegenüber den Rippen Seiten, um durch sie zu oberen Brusthöhle Ebenen schneiden. </li></ol></li><li> Ausziehbares den Darm und außerhalb des Tieres in die rechte Ecke des Experimentators, die Pfortader zu belichten. </li><li> Legen Sie eine 30 g Nadel, verbunden mit einer Schlauchpumpe in die Pfortader rostral der Milzvene. </li><li> Schneiden Sie die untere Hohlvene oberhalb des Zwerchfells Entwässerungs- und Sammlung des Perfusat aus der Brusthöhle zu ermöglichen. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe bei einer Geschwindigkeit von etwa 3 ml / min und Sammeln sanft die ersten 3 ml Perfusat, die mit Blut aus der Brusthöhle Pool kontaminiert sind. </li><li> Entsorgen Sie diesen Perfusat. Wiederholen solch ein Waschen wieder benötigt, wenn durch Kochsalzlösung verwendet, und erst dann starten Leber Perfusat gesammelt werden. </li><li> Wieder initiieren die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von bis zu 4 ml / min, und sammeln 10 ml Perfusat aus der Brusthöhle unter Verwendung vonein Schmetterling mit einer Spritze verbunden. </li><li> Terminate Perfusion, wenn die Farbe der Leber bis hellbraun dreht. </li></ol></li><li> Leukozyten-Extraktion <ol><li> Zentrifuge das Perfusat 10 min bei 400 x g. </li><li> Den Überstand aspirieren. </li><li> In 10 ml PBS, Zentrifugation bei 400 × g für 10 min und den Überstand aspirieren Basierend auf Studienziele, verwenden Vorbereitung , wie oder führen zusätzliche Reinigungen (zB Dichtegradienttrennmittel). <ol><li> Insbesondere Schicht alle 4 ml Perfusat über 4 ml Dichtegradienttrennmittel Masse in einem 50 cc Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen bei 754 xg, RT, 30 min mit der Pause ab. </li><li> Besorgen Sie sich die einkernigen Schichten an der Dichtegradienttrennmittel-Überstand-Schnittstelle durch manuelles Pipettieren, Waschen in PBS, und legen Sie in einem 5-ml-Tube. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Methode Leberperfusion hier vorgestellten ermöglicht eine selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von marginating Leber Leukozyten. Leber NK - Zellen, auch Grube Zellen 3 genannt, bilden eine unverwechselbare NK - Zellpopulation , die in den Leber sinusoids befinden. Sie werden bei Ratten, Mäusen 17 und beim Menschen 18,19 gefunden. Im Vergleich zu isolierten peripheren NK - Zellen zeigte pit Zellen höhere Zytotoxizität gegen YAC-1 und CC531s Zielzelllinien ...

Die Lebersinusoide enthalten zahlreiche Leukozytensubtypen verschiedener Immunaktivitäten entscheidend für den Organismus. Zum Beispiel marginating Leber (MH) natürliche Killerzellen (NK), die auch als Pit-Zellen bekannt sind, charakterisiert morphologisch als große granuläre Lymphozyten (LGLs) und funktionell als Leukozyten mit spontaner zytotoxische Kapazität, so dass Leber-Widerstand gegen die Errichtung von blut- getragen Tumormetastasen. Das Ziel des Verfahrens vorgestellt hierin selektive Ernte von MH Leukozyten zu aktivieren, um diese wichtige und einzigartige Zellpopulation zu untersuchen (und Immunraum), und die Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen aufzuklären. Trotz des Ausfalls der Immunität eines Entwicklungsprimärtumor, Nachweis bei Krebspatienten und Tiermodelle zu eliminieren, zeigen an, dass das Immunsystem zirkulierende Tumorzellen steuern können, Mikrometastasen und residual disease through zellvermittelte Immunität (CMI). Es gibt jedoch eine scheinbare Unstimmigkeit zwischen diesen in vivo - Funktionen und in vitro - Studien in Menschen und in Tieren, die zeigen , dass die meisten autologe Tumorzellen - Zytotoxizität durch zirkulierende oder splenic Leukozyten 1,2 resistent sind. Diese Inkonsistenz kann zurückgeführt werden, zumindest teilweise auf die in vivo Existenz einer deutlichen Leukozytensubpopulation, nämlich die marginating-hepatische (Sinusoide) Leukozyten und deren Subpopulation von aktivierten NK - Zellen, nämlich pit Zellen 3. Tatsächlich unpublizierte Daten aus unserem Labor zeigten , daß in F344 Ratten syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent gefunden, 4 durch MH-NK Zellen lysiert wurden. Somit Tumorzellen, die angeblich &quot;NK-resistant&quot; auf zirkulierende Leukozyten sind, können durch MH-NK-Zellen gesteuert werden. Bemerkenswert ist die verstärkte Aktivität von MH-NK bei Mäusen in vivo nach nur offensichtlich immunStimulation (zB durch die Verwendung von Poly I: C oder CpG-C) 5. Leberspezifischen NK-Zellen (MH-NK) innerhalb der sinusförmigen Lumens befindet, an die Endothelzellen und Kupffer-Zellen anhaften. MH-NK - Zellen werden durch sphärische dichten Granula und stäbchen entkernt Vesikeln 6, die enthalten saure Phosphatase als lysosomale Enzyme und Perforin und Granzyme als bioaktive Substanzen 7,8 ausschließlich aus. Verglichen mit NK - Zellen zirkulierende weisen MH-NK - Zellen eine höhere Anzahl und Größe der Granula und Vesikel 9-11. Unter entzündlichen Bedingungen wurden MH-NK - Zellen gezeigt höhere Expression von LFA-1 12 aufweisen, im Vergleich zu den NK - Zellen zirkulieren. Diese erhöhte Expression könnte einen Mechanismus dar , mit dem MH-NK - Zellen mehr zytotoxischen gegen bestimmte Tumorzellen sind als NK - Zellen 13,14 zirkuliert. nterestingly nach in vitro - Inkubation mit Interleukin (IL) -2, werden MH-NK - Zellen vergrößert undihre Anzahl und Größe der Körner zu erhöhen, die alle mit einem Pro fi l von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) 15 konsistent sind. Aktive MH Leukozyten kann nicht ausschließlich durch die Standard Leber Leukozyten Ernteverfahren erhalten werden, die auf Schleif- und biologischen Abbau des Gewebes beruhen. Unser Perfusion Ansatz hier beschriebenen hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu den Standard-Ansätzen. Erstens, erntet die Perfusion Ansatz selektiv MH Leukozyten, Verunreinigungen durch andere Leukozyten aus anderen Leberfächer zu verhindern. Zweitens behält die Perfusionstechnik besser, die Integrität, die Aktivität und die physiologischen Milieu MH Leukozyten, im Gegensatz zu der Gewebeverarbeitung dass Zellen schädigen nähert oder ihre Morphologie zu verändern, und aufgrund von Gewebeschäden induzieren die Freisetzung von verschiedenen Faktoren, die deutlich immune modulieren Aktivität. Die Leber ist ein wichtiges Zielorgan für die Krebsmetastasierung and für verschiedene Infektionen 16. Als MH-Zellen einzigartige Eigenschaften aufweisen, ist es wichtig, diese spezifische Population unter verschiedenen Bedingungen in bezug auf diese Pathologien zu studieren. Zum Beispiel ist es angemessen , dass die systemische Immunaktivierung durch verschiedene BRMs (zB Poly I: C oder CpG-C) zu beachten sind MH-Leukozyten gezeigt mehr zu aktivieren , als Leukozyten 5 zirkuliert.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic Pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly Nadel</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Butterfly Nadel</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr> <tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic Lösung</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic-Lösung</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Pic-Lösung</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td>mit stumpfen Kanten</tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hämostatisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W Leuchtstofflampe mit Tageslichtlupe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selektive ernte von marginating-leber-leukozyten

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatische (MH) Leukozyten (Leukozyten, die an den Sinusoiden der Leber haften) wiesen im Vergleich zu Leukozyten anderer Immunkompartimente eine einzigartige Zusammensetzung und Eigenschaften auf. Insbesondere deuten die Hinweise auf ein ausgeprägtes pro- und antiinflammatorisches Profil der MH-Leukozytenpopulation und eine höhere Zytotoxizität von leberspezifischen NK-Zellen (nämlich Grubenzellen) im Vergleich zu zirkulierenden oder milzartigen Immunozyten sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten hin. Das hierin vorgestellte Verfahren ermöglicht die selektive Entnahme von MH-Leukozyten durch erzwungene Perfusion der Leber bei Mäusen und Ratten. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Extraktion von Leber-Leukozyten, einschließlich Gewebezerkleinerung und biologischem Abbau, werden bei dieser Methode ausschließlich Leukozyten aus den Lebersinusoiden gewonnen, die nicht durch Zellen aus anderen Leberkompartimenten kontaminiert sind. Darüber hinaus bewahrt die Perfusionstechnik die Integrität und das physiologische Milieu der MH-Leukozyten besser, wodurch bekannte physiologische Reaktionen auf die Gewebeverarbeitung vermieden werden. Da viele zirkulierende maligne Zellen und infizierte Zellen beim Passieren der Lebersinusoide zurückgehalten werden und physisch mit Endothelzellen und ansässigen Leukozyten interagieren, ist die einzigartige MH-Leukozytenpopulation strategisch positioniert, um mit aberrant zirkulierenden Zellen zu interagieren, sie zu identifizieren und darauf zu reagieren. Daher kann die selektive Entnahme von MH-Leukozyten und ihre Untersuchung unter verschiedenen Bedingungen unser Verständnis der biologischen und klinischen Bedeutung von MH-Leukozyten verbessern, insbesondere im Hinblick auf zirkulierende aberrante Zellen und leberbedingte Erkrankungen und Krebsmetastasen.

In F344 Ratten verglichen wir die Zytotoxizität von NK-MH-Zellen (aus der Leber Sinusoide durch erzwungene Leberperfusion gesammelt) auf die Zytotoxizität der gesamten Leberzellpopulation folgende mechanische Mahlung des Lebergewebes und auf die Zytotoxizität von Leukozyten zirkulieren. Alle Zellpräparationen wurden mindestens 3 Mal, als Routine, die in immunologischen Assays und als Zielzelllinien verwendeten wir die allogenen YAC-1 oder die syngenen MADB106 Zielzelllinien gewaschen. Wi...

Marginating-hepatische Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir eine Methode zur selektiven Entnahme dieser spezifischen Leberzellpopulation durch erzwungene Perfusion der Leber von Ratten oder Mäusen. Marginating-hepatische Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für hepatische Erkrankungen und Metastasen zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, marginierende hepatische Leukozyten, also Immunzellen, die an den Sinusoiden der Leber haften, durch erzwungene Perfusion aus Mäuse- oder Rattenlebern gezielt zu gewinnen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hepatischer Leukozyten, die im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Merkmale und spezifische immunologische Funktionen aufweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ausschließlich Leukozyten aus dem Lebersinusoid liefert, unverunreinigt durch Zellen aus anderen Leberkompartimenten wie dem Parenchym.Den Ablauf werden Liat Sorski und Lee Shaashua demonstrieren, zwei hervorragende Doktorandinnen aus meinem Labor. Vor Beginn des Leberperfusionsverfahrens wird heparinisiertes PBS durch die Schläuche der peristaltischen Pumpe und die Butterfly-Nadeln gespült, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Unmittelbar nach dem Erliegen der Atmung wird mit sterilen Scheren und Zahnzangen ein medianer Bauchschnitt ausgeführt, der am Unterbauch der euthanasierten Ratte beginnt und bis zum Xiphoidfortsatz verläuft, wobei darauf zu achten ist, die inneren Organe nicht zu verletzen.Verwenden Sie anschließend die Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie vorsichtig das Zwerchfell und den Rippenkorb beidseits durch. Befestigen Sie eine Hämostaseklemme am Brustbein und klappen Sie den Rippenkorb rostral, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Bereiten Sie dann eine 21-Gauge-Butterfly-Kanüle vor, die mit einer 10-Milliliter-Spritze verbunden ist, und führen Sie sie in den rechten Ventrikel des Herzens ein.Verwenden Sie anschließend die 10-Milliliter-Spritze, um so viel Blut wie möglich zu sammeln. Wenn das gesamte Blut gesammelt ist, verschließen Sie die Vena cava caudalis mit einem Hämostaseklemme so nah wie möglich am Herzen. Danach verschieben Sie die Därme aus der Bauchhöhle auf die linke Seite des Tieres, um die Vena portae freizulegen.Bereiten Sie anschließend einen 25-Gauge-IV-Katheter vor, der mit dem Auslassrohr der peristaltischen Pumpe verbunden ist, und führen Sie ihn so kaudal wie möglich in die Vena portae ein, wobei er weiterhin rostral zur Milzvene liegen muss. Bereiten Sie danach eine 21-Gauge-Butterfly-Kanüle vor, die mit einer Fünf-Milliliter-Spritze verbunden ist, und führen Sie sie kaudal zum Hämostaseklemme in die untere Hohlvene ein. Schalten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa drei Millilitern pro Minute ein und sammeln Sie die ersten Milliliter des mit Blut kontaminierten Perfusats in der Spritze.Setzen Sie die fünf Milliliter-Harvesting-Spritze durch die 20 Milliliter-Harvesting-Spritze aus, ohne die Pumpe anzuhalten, wenn das Perfusat eine blassrote Farbe annimmt. Sammeln Sie anschließend mindestens 20 Milliliter Leberperfusat mit sieben Milliliter pro Minute. Beenden Sie die Perfusion, wenn die gesamte Leber hellbraun ist.Anschließend den Perfusat zentrifugieren und den Überstand abpipettieren. Um murine marginierende hepatische Leukozyten zu gewinnen, unmittelbar nach dem Erliegen der Atmung sterile Scheren und Zahn-Präparierpinzetten verwenden, um einen medianen Bauchschnitt bis zum Processus xiphoideus anzulegen. Danach mit der Pinzette das Brustbein anheben und das Zwerchfell sowie den Rippenbogen beidseits vorsichtig durchschneiden.Befestigen Sie eine Hämostaseklemme am Brustbein und klappen Sie den Rippenkasten nach kranial, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Verlagern Sie die Därme außerhalb der Bauchhöhle nach links, um die Pfortader freizulegen. Anschließend verbinden Sie eine Nadel mit 30 Gauge mit einer peristaltischen Pumpe und führen sie in die Pfortader kranial zur Milzvene ein.Schneiden Sie die untere Hohlvene oberhalb des Zwerchfells durch, um die Abfuhr und Sammlung des Perfusats aus dem Brustkorb zu ermöglichen. Schalten Sie dann die peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa drei Milliliter pro Minute ein und sammeln Sie die ersten Milliliter des blutkontaminierten Perfusats aus dem Brustkorbreservoir. Wenn drei Milliliter gesammelt wurden, schalten Sie die Pumpe aus.Danach, nachdem eine 21-Gauge-Butterfly-Nadel, die mit einer 10-Milliliter-Spritze verbunden ist, eingeführt wurde, die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von bis zu vier Millilitern pro Minute erneut starten, bis 10 Milliliter Perfusat aus der Brusthöhle gesammelt wurden. Wenn die Leber hellbraun wird, die Perfusion beenden. Anschließend das Perfusat in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Zentrifugieren Sie es. Anschließend den Überstand abpipettieren. Während marginierende hepatische NK-Zellen eine ausgeprägte Zytotoxizität gegenüber allogenen Zielzelllinien aufweisen, zeigen sowohl die gesamte Leberzellpopulation als auch die zirkulierenden Leukozyten deutlich geringere Zytotoxizität-Level und nahezu keine Abtötung gegenüber einer syngenenen Zielzelllinie.Die gleichen relativ geringeren Zytotoxizitätsgrade zeigen sich, wenn mechanisch aufbereitete Lebern einer Wäsche und einer Dichtegradientenseparation unterzogen werden. Die Analyse spezifischer Leukozytenpopulationen zeigt deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung der Immunzellpopulationen aus den zirkulierenden und Leberzellkompartimenten auf. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in wenigen Minuten abgeschlossen werden.Nach diesem Verfahren können die Zellen für die Durchflusszytometrie, die PCR oder andere Methoden zur Charakterisierung dieser wichtigen Leukozytenpopulation verwendet werden. Diese Technik ermöglicht die gezielte Gewinnung von marginalisierenden hepatischen Leukozyten, um unser Verständnis über ihre biologische und klinische Bedeutung zu vertiefen. Insbesondere erwarten wir Fortschritte bei der Kontrolle zirkulierender aberranter Zellen und leberbezogener Erkrankungen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man margierende hepatische Leukozyten gewinnt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Dieses Video beschreibt eine Methode zur räumlichen Trennung von drei leukämischen Zellsubpopulationen: die schwebenden leukämischen Zellen, die frei in den Medien schweben, phasenhelle leukämische Zellen, die an der Oberfläche der mesenchymalen Stromazell-Monoschicht haften, und die phasenschwachen Leukämiezellen, die unter die mesenchymale Stromazell-Monoschicht aus der 2D-Co-Kultur gewandert sind.

Leukämische Subpopulationsernte: Eine Methode zur räumlichen Trennung von leukämischen Zellsubpopulationen aus 2D-Cokulturen

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von marginierenden Leberleukozyten aus der Mausleber durch erzwungene Perfusion.

Isolierung von marginierenden hepatischen Leukozyten aus einer Mausleber

Dieses Video zeigt die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich natürlicher Killerzellen oder NK-Zellen, aus menschlichem Lebergewebe für die selektive Expansion. Der enzymatische und mechanische Verdau, gefolgt von der Trennung durch Dichtegradienten, fördert die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich NK-Zellen. Die gesammelten Lymphozyten können für die selektive Vermehrung von NK-Zellen weiter verwendet werden.

Isolierung natürlicher Killerzellen aus Lebergewebe für die selektive Expansion

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Marginating-pulmonale Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir die selektive Entnahme dieser Subpopulation von Lungenleukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Ratten und Mäusen. Marginating-pulmonale Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für durch Blut übertragbare und lungenbedingte Krankheiten zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus  Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Lernen Sie die selektive Gewinnung von marginierenden hepatischen Leukozyten aus Ratten- oder Mäuslebern durch erzwungene Perfusion. Diese Methode liefert reine Leukozyten aus den Lebersinusoiden für Immunologie- und Hepatologieforschung.

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

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