Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Das übergeordnete Ziel dieses Differenzierungsprotokolls ist es, homogene Populationen von atrialen Kardiomyozyten in Kultur zu erzeugen. Diese Methode kann also dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der kardialen Entwicklung und von Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie in vitro homogene Kulturen von Vorhof-Kardiomyozyten herstellt und dass sie mit minimalem Schulungsaufwand durchgeführt werden kann.

Bis zu vier Tage vor dem Einrichten der embryonalen Stammzell- oder mESC-Kulturen der Maus codieren Sie 10-Zentimeter-Gewebeschalen mit jeweils 5 Millilitern 0,2%iger Gelatinelösung in sechs Vertiefungsplatten mit 1 Milliliter Gelatine pro Vertiefung in einer sterilisierten Gewebekulturhaube. Am Tag der Kultur die überschüssige Gelatinelösung entfernen und 10 Milliliter Medium in eine der mit Gelatine überzogenen 10-Zentimeter-Schalen geben. Verwenden Sie dann eine Kryozange, um ein Fläschchen mit 1 mal 10 auf die 6 mESCs in einem 37-Grad-Celcius-Wasserbad vorsichtig zu schwenken, bis nur noch ein kleiner Eiskristall in der Mitte des Fläschchens übrig bleibt.

Trocknen Sie das Fläschchen mit einem fusselfreien Einwegtuch und sterilisieren Sie es mit 70 % Ethanol. Stellen Sie dann das Fläschchen in die Gewebekulturhaube und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die ESCs in die Schale zu geben. Legen Sie die Zellen in einen 37-Grad-Celcius-Befeuchtungs-Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und bewegen Sie die Platte vorsichtig von vorne nach hinten und von Seite zu Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein Hellfeldmikroskop, um die Zelladhäsion zu bestätigen. Es werden einige Ablagerungen und abgestorbene Zellen beobachtet. Ersetzen Sie das Medium durch 10 Milliliter frisches mESC-Medium und stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.

Wenn die Kultur zu 60 bis 70 % konfluent ist, spülen Sie die Platte mit 5 Millilitern sterilem DPBS ohne Magnesium und Kalzium und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang in 2 Millilitern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Während die Zellen inkubieren, aspirieren Sie die überschüssige Gelatinelösung aus einer neuen 10-Zentimeter-Schale pro durchgelassener Kultur und geben Sie 10 Milliliter Medium in jede Platte. Sammeln Sie dann die abgelösten Zellen durch Zentrifugation in einem 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Millilitern mESC-Medium.

Je nach gewünschtem Split-Verhältnis geben Sie 0,5 bis 1 Milliliter Zellsuspension in jede 10-Zentimeter-Schale und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator, wobei Sie die Zellen vorsichtig in jeder Schale verteilen, wie gerade gezeigt. Wenn die passageierten Zellen zu 70 % konfluent sind, lösen Sie sie mit Trypsin-EDTA ab, wie gerade gezeigt, und resuspendieren Sie dann die einzellige Suspension in 5 Millilitern Embryoidkörper oder EB-Medium. Zählen Sie die mESCs und verdünnen Sie sie dann im entsprechenden Volumen des EB-Mediums auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 auf die 3. Zellen pro Milliliter.

Geben Sie als Nächstes 2 Milliliter PBS auf den Boden einer sterilen 10 Zentimeter großen bakteriellen Petrischale pro hängender Tropfenkultur und geben Sie die EB-Suspension in ein steriles Lösungsbecken. Nehmen Sie nun den Deckel von einer der vorbereiteten Schalen ab und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette, die mit sechs Spitzen ausgestattet ist, vorsichtig 60 20-Mikroliter-Tropfen EB-Suspension auf die Innenfläche. Setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf die Schale, achten Sie darauf, dass sich die hängenden Tropfen nicht lösen, und stellen Sie die Schalen für zwei Tage in den Zellkultur-Inkubator.

Um die EBs abzuwaschen, entfernen Sie vorsichtig den Deckel von der hängenden Tropfenkultur und kippen Sie ihn in einem 45-Grad-Winkel. Waschen Sie dann mit einer serologischen 5-Milliliter-Pipette mit EB-Medium bei Raumtemperatur die EBs vorsichtig in ein Becken am unteren Rand des Deckels. Untersuchen Sie den Deckel sorgfältig auf EBs, die an der Oberfläche kleben, und geben Sie die EBs dann in eine unbeschichtete, 6 Zentimeter große Petrischale.

Legen Sie die EBs für weitere zwei Tage in den Gewebekultur-Inkubator zurück und überprüfen Sie die Platten täglich auf EB-Aggregation und -Anhaftung. Ersetzen Sie vor dem Plattieren der EBs die überschüssige Gelatine-Beschichtungslösung in jeder Vertiefung der vorbereiteten Sechs-Well-Platte durch 2 Milliliter frisch zubereitetes Grem2-Behandlungsmedium bei Raumtemperatur. Verwenden Sie dann eine P1000-Pipette auf 100 Mikroliter, um 30 EBs in jede Vertiefung zu übertragen, und stellen Sie die Platte dann über Nacht wieder in den Inkubator ein, wobei die Zellen mit sanften Bewegungen, wie gezeigt, gleichmäßig verteilt werden.

Nachdem sich die EBs am Boden der Vertiefungen festgesetzt haben, tauschen Sie das Grem2-Medium alle zwei Tage bis zum 10. Tag aus. Füttern Sie die Zellen dann alle zwei Tage mit frischem EB-Medium, um eine gesunde Zellkultur zu erhalten. Vor ihrer Hanging-Drop-Kultur sollten die pluripotenten Stammzellen kompakt und frei von spontaner Differenzierung sein.

Wenn eine spontane Differenzierung beobachtet wird, sollten die Zellen nicht in den hängenden Tropfenkulturen verwendet werden. Qualitäts-EB bildet sich im Allgemeinen am besten in gleichmäßig verteilten, gut abgerundeten hängenden Tropfen. Am zweiten Tag der Differenzierung sollten die EBs mit bloßem Auge sichtbar sein, als kugelförmige Anordnungen von differenzierenden Stammzellen an den Spitzen der hängenden Tropfen.

Am vierten Tag sollten gut geformte EBs frei schwebend und homogen in Größe und Form sein. Nach der Plattierung flachen die EBs ab, wenn die Zellen aus dem EB auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte wandern, wie hier an den Differenzierungstagen acht und 10 beobachtet. In unbehandelten Kontrollwells werden kleine, sich langsam zusammenziehende Flecken bereits am sechsten und am neunten Tag beobachtet.

In Grem2-behandelten Vertiefungen sind große Flecken mit einer relativ schnellen Schrumpfungsrate üblich. Die RT-QPCR-Analyse der Genexpression in den differenzierten Zellen zeigt in der Regel einen hohen Gehalt an kardialen strukturellen und regulatorischen Genen in Grem2-behandelten Kulturen. Wenn die alpha-MHC DsRed-Nuke-Zelllinie verwendet wird, wird die erhöhte Ausbeute an Kardiomyozyten in Form einer höheren Anzahl von DsRed-markierten Zellkernen in den Grem2-behandelten Vertiefungen beobachtet.

Grem2-Behandlung verzerrt auch die Differenzierung in Richtung eines atrialen Phänotyps, wie durch RT-QPCR- und Patch-Clamp-Messungen der zellulären Wirkungspotentialdauer bestätigt wurde. Einmal gemeistert, können die differenzierenden Stammzellen in nur 60 Minuten mit Grem2 behandelt werden, und Perlenzellen werden in der Regel bereits am siebten Tag beobachtet. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Grem2 am vierten Tag nach der Spitzenexpression von Gastrulationsmarkern wie brachyury konsequent hinzuzufügen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Elektrophysiologie und QPCR durchgeführt werden, um die funktionellen und molekularen Eigenschaften der erzeugten Zellen zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit Grem2 atriale Kardiomyozyten aus Maus-ESCs erzeugt.