Name: Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Lernen Sie eine Laminierungstechnik für die konfokale Mikroskopie der menschlichen Sklera, um Immunzellverteilung und Gefäßstatus in gesundem und pathologischem Gewebe zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Bildgebung dichter Bindegewebe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deutsche Forschungsgemeinschaft (FOR2240 "(Lymph-)Angiogenese und zelluläre Immunität bei entzündlichen Erkrankungen des Auges" zu CC und LMH; HE 6743/2-1 und HE 7643/3-1 bis LMH; CU47/6-1 nach CC), Deutsche Krebshilfe (nach LMH und CC), GEROK-Programm der Universität zu Köln (nach SLS und LMH) und EU COST BM1302 "Mit vereinten Kräften zur Hornhautregeneration" (nach CC).

Die Verwendung von menschlichen Geweben müssen von einem Institutional Review Board oder gleichwertig geprüft und genehmigt werden. Die hier beschriebene Arbeit wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt und hatte die Genehmigung für die wissenschaftliche Untersuchung. Diese Arbeit wurde nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die menschlichen scleral Proben wurden vor den Augen der ganzen Welt Spender (maximal post-mortem Zeit 24 h) an der Augenbank der Augenklinik der Universität zu Köln, Deutschland, erhalten. 1. Experimentelle Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung 96% Ethanol und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in verschiedenen Röhren. Bereiten Sie die primären Antikörper in der empfohlenen Verdünnung von PBS, die 2% Rinderserumalbumin (BSA) und halten alle Lösungen auf dem Eis. Bereiten Sie 100 ul pro Probe. </li><li> Reinigen Sie alle Instrumente und verwenden scharfe Skalpelle. Nachdem er mit dem gleichen Skalpell wiederholte Schneiden, das Skalpell ändern. </li><li> Erhalten Sie 1-2 Colibri Zange, gerade Mikro Dissektionsscheren, ein # 10 Skalpelloder ophthalmische Skalpell Mikro Feder und vier 26 G Nadeln. </li><li> Wickeln Sie Aluminiumfolie um eine Polystyrolplatte oder verwenden Sie eine Korkplatte um das Gewebe zu befestigen. Arbeiten unter einem binokularen Stereomikroskop. Arbeiten steril unter einem laminaren Luftstrom, wenn nötig. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Sclera <ol><li> Sie vorsichtig die Lampe halten und ein Perforieren Trepanation auf dem korneoskleralen Teil ausführen, drehen Sie dann den trepan. Drehen Sie den trepan sorgfältig und gleichmäßig auf der Oberfläche eine ebenso runde Schnitt durchzuführen. Verwenden Sie einen 15,5 mm große trepan. Schneiden Sie die restlichen Anlagen mit einer gebogenen Schere. Entfernen Sie die korneoskleralen Trepanation. Dies wird sich in einer nach vorne geöffneten Lampe führen. <ol><li> Legen Sie die Sklera auf einem Tupfer mit dem offenen Teil nach oben. Entfernen Sie die Retina und Uvea, Colibri Zange mit beiden Schichten abziehen (Retina und Uvea) von der Sklera. Sie nicht die pigmentierte Uvea auf der inneren Lederhaut verlassen. Verwenden einer gebogenen Schere die Retina und Uvea von der Papille zu entfernen. Entfernen Sie die remaining Konjunktiven, Augenmuskeln, und Tenon-Kapsel von der oberflächlichen Sklera. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die scleral Probe in der gewünschten Größe von straight-Typ Schere und Colibri Zange. Nehmen Sie etwa 2 cm 2 Größe scleral Proben von verschiedenen Orten aus . Aufgrund der geringen Größe, halten Sie die Lederhaut sanft und die gewünschte Größe als Quadrate schneiden Sie die straight-Typ Schere. Die korneoskleralen Trepanation definiert den vorderen Rand der Sklera-Proben. <ol><li> Vermeiden Sie wiederholte greifen mit der Zange als den Bereich, wo das Gewebe wurde gepackt ist nicht geeignet für die konfokale Mikroskopie analysiert. Bereiten Sie die erforderliche Anzahl von Proben je nach Experiment Typ (zB ventral nach dorsal vs., vergleiche Abbildung 1) und die Menge von Antikörpern verwendet. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen für die spätere Verwendung. Befestigen Sie die Proben in 1,5 ml 96% Ethanol für 15 Minuten und dann waschen Sie sie dreimal jeweils 5 minin 1,5 ml PBS auf dem Schüttler. Wenn mit gefrorenem Gewebe arbeiten, führen Sie diesen Schritt vor dem Snap Einfrieren. </li><li> Verwenden Sie frische Gewebe. Ist dies jedoch nicht möglich ist, rasten die Sklera in flüssigem Stickstoff einfrieren und halten Sie sie bei -20 ° C für die spätere Verwendung. Wenn mit gefrorenem Gewebe arbeiten, Tauwetter vor dem Gebrauch. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und Einfrieren Zyklen. </li><li> Halten jede Probe in PBS, die 1,5 ml 5% BSA bei Raumtemperatur für 2 Std. Dieser Schritt bewirkt eine Quellung der Probe, die für die Laminierung nützlich ist und verhindert auch unspezifische Bindung. </li><li> Nachdem die Proben schwoll haben, bereiten Sie die scleral Quadrate für die Laminierung. Arbeiten unter einem Mikroskop, zB einem binokularen Stereomikroskop. Befestigen Sie die hinteren scleral Proben auf die Polystyrol-Membran in Aluminiumfolie eingewickelt oder die Korkplatte mit den 26 G Nadeln. </li><li> Biegen Sie die Kanten der Nadeln, so dass sie nicht mit dem Gesichtsfeld unter dem Mikroskop stören. </li><li> Laminat, das die gesamte Dicke scleral samples. <ol><li> Zunächst halten die vordere Kante scleral mit Colibri Pinzette. Dann schneiden Sie vorsichtig eine dünne Schicht der oberflächlichen Sklera die # 10 Skalpell, das ophthalmologische Skalpell Mikro Feder oder einem Spatel Klinge. Halten Sie das Skalpell horizontal und schneiden Sie die oberflächliche Schicht so dünn wie möglich von der darunter liegenden Schicht. </li><li> Präparieren einer dünnen scleral Schicht aus dem scleral Platz. Dieses Verfahren ist vergleichbar mit Standard - OP - Techniken , um eine Klappe während der Trabekulektomie vorzubereiten und in 30-80 um dicke Schichten (vergleiche Abbildung 2) zur Folge haben sollte. </li></ol></li><li> Trocknen der Sklera verhindern , indem kleine Mengen an PBS zu dem Gewebe, beispielsweise 50 &amp; mgr; l PBS mit einer Pipette hinzugefügt wird . </li><li> Setzen Sie die geschnittenen Schichten in 100 ul PBS in der 96 - Well - Platte und beschriften sowohl die Ausrichtung (Richtung extern und intern) und die Schicht (oberflächliche und tiefe) , zB mit einer wasserdichten Farbe. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,9, bis das Gewebe vollständig laminiert. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Führen Immunohistochemistry <ol><li> 100 l der erforderlichen primären Antikörper in der empfohlenen Verdünnung. Hier zB Verwendung CD 31 (monoklonaler Maus anti human) und LYVE1 Antikörper (Kaninchen - anti human), die beide in einer Verdünnung von 1: 100 in PBS (enthaltend 2% BSA) und über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Um das Medium ändern, in der 96-Well-Platte, halten Sie die Pipette auf die Wand des Bohrlochs und entfernen Sie die Flüssigkeit. </li><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Proben dreimal jeweils 5 min mit 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. 100 l der entsprechenden Sekundärantikörper; hier verwenden Ziege anti-Maus-Fluorescein (FITC) und Ziege anti-Kaninchen-Cyaninfarbstoffe 3 (Cy3) und die Proben bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden inkubiert. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper 1: 300 in PBS 2% Ziegenserum enthält. </li><li> Spülen Sie die Proben wieder dreimal jeweils 5 min in 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. </li><li> Führen Kernfärbung, zB </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Verdünnung 1: 2000, 100 &amp; mgr; l in jeder Vertiefung und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren), dann waschen Sie erneut 2-mal in 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf Objektträger, betten sie in 1-2 Tropfen fluoreszierenden Eindeckmediums, fügen Sie ein Deckglas, verschließen Sie diese durch die Kanten Abdeckung mit transparenten Lack, und lagern bei 4 ° C für die spätere Verwendung oder direkt die Folien mit dem konfokalen untersuchen Mikroskop. </li><li> Verwenden, um ein konfokales Mikroskop (oder Äquivalent), um die Proben zu analysieren. Verwenden Sie die gewünschte Vergrößerung, zB 10-40x Vergrößerung. </li><li> Um die Dicke der Proben zu überprüfen, messen mit der konfokalen Mikroskopie mit Z-Stacks. Die Menge der möglichen skleralen Abschnitte hängt von der Lage der Sklera, als die Dicke äquatorial und posterior (Einführung Vergleich) unterscheidet. </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Offenlegungen. Für den Inhalt dieses Artikels sind ausschließlich die Autoren verantwortlich.

die menschliche Sklera Laminieren ist ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie an diesem Gewebe durchgeführt wird. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist die Verwendung von Ethanol anstelle von Formalin für das Gewebe zu befestigen. Nach unserer Erfahrung sind bessere Ergebnisse erhalten, wenn Ethanol anstelle von Formalin für die Fixierung verwendet wird. Blunt Skalpelle verschlimmern das Verfahren und sollte vermieden werden. Ebenso sollte die Austrocknung der Sklera vermieden werden, da es das Verfahren verkom...

Die Sklera ist die starre äußere Schicht, die das Auge bedeckt, die aus dichtem Bindegewebe besteht. Es hilft intraokularen Strukturen zu schützen und intraokularen Druck aufrechtzuerhalten. Somit ist die Sklera für klare Sicht unerlässlich. Es ist frei von Lymphgefäßen 1,2 und bildet dadurch eine äußere lymphatischen freie Grenze zwischen ihm und dem lymphatischen freien inneren Auge 3-7. Es bietet auch Bindungsstellen für Extraokularmuskeln, damit anatomische Ähnlichkeiten mit Sehnen zu teilen. Da vor allem die Sklera dichten Bündeln von Typ - I - Kollagen besteht und hat kleinere Anzahlen von Kollagentypen III, IV, V, VI, VIII 8,9 und Elastin 10,11, ist dieses Gewebe nicht leicht für die Immunhistochemie verwendet werden . Anatomisch kann die Sklera in drei Schichten getrennt werden: (1) die oberflächliche vaskularisierten Episklera unterhalb der Bindehaut und Tenon-Kapsel und in Richtung der Seiten und th gefundene Rückseite des Auges die Bahn zugewandt ist; (2) das sklerale Stroma, der Hauptteil der Sklera; und (3) die Lamina fusca, die eine dünne, pigmentierte Schicht direkt über der Uvea befindet. Unsere anatomischen Kenntnisse über die Sklera resultiert im Wesentlichen aus der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Damals untersuchten die Forscher die Anatomie des Gefäßsystems hauptsächlich durch die Verwendung Tusch Injektionen 12 und Gefäß Gießen 13-15. Später wurde in angiographischen Studien erforscht 16-19. Seit dieser Zeit wurden ältere Techniken verbessert und neue entwickelt worden, die erlaubt haben, uns vorherigen anatomischen Kenntnisse zu ergänzen. Zum Beispiel hat es nur etwa ein Jahrzehnt her , dass wir eine solche zuverlässige lymphatische Marker als lymphatischen Gefäßendothel spezifischen Hyaluronan - Rezeptor-1 (LYVE1) 20 oder podoplanin 21 hatten. Die konfokale Mikroskopie bietet neue Möglichkeiten für die Untersuchung der anatomischen Merkmale der unterschiedlichen tiHEMEN des Auges. Es ermöglicht mehrere Flecken zum Differenzieren von Zellen oder Marker zur Lokalisierung von Zellen in Bezug auf die Blutgefäße und anderer anatomischer Strukturen verwendet werden. Es gibt einen Überblick, wenn die Probe von einer größeren Größe und ermöglicht es uns durch eine Probe abzutasten, wenn auf der Suche nach einem bestimmten Zelltyp. Mit Z-Stack-Technologie kann die konfokale Mikroskopie für Proben auf 100-200 &amp; mgr; m bis verwendet werden. Die Sklera unterscheidet zwischen 0,3 mm hinter der Muskelinsertionen und 1 mm am hinteren Pol 11 in der Dicke. Aufgrund sowohl seine Dicke und Undurchsichtigkeit ist die Sklera für die konfokale Mikroskopie mit herkömmlichen Methoden nicht geeignet. Um Abhilfe zu schaffen, wurden skleralen Gewebe laminiert für ihre Analyse mit der konfokalen Mikroskopie zu ermöglichen. Diese Technik ist nützlich für ein besseres Verständnis der beiden physiologischen und pathologischen Situationen im menschlichen Sklera gewinnt.

<table><tbody><tr><td>96%</td><td>Ethanol Merck Chemicals, Darmstadt, Deutschland</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binokulares Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadeln&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgien</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15,5 mm Trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Deutschland</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>. Nr. 10 Skalpell&nbsp;</td><td>Feder, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>Augenskalpell Mikrofeder &nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>Nr. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 Antikörper (monoklonaler Maus-Anti-Mensch)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 Antikörper&nbsp; (polyklonales Kaninchen gegen den Menschen)</td><td>Zytomed, Deutschland</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-FITC-Antikörper für Ziegen</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Cy3-Antikörper</td><td>Dianova, Deutschland</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum normal</td><td>Dako, Glostrup, Dänemark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Folien&nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&uuml; nde, Deutschland</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Deutschland</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluoreszierendes Eindeckmedium&nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 konfokale Mikroskopie&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

mit hilfe einer laminiertechnik konfokale mikroskopie der menschlichen sclera to perform

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Die Sklera ist ein dichtes Bindegewebe, bedeckt und schützt das Auge. Es besteht hauptsächlich aus dichten Kollagenbündeln (Typen I, III, IV, V, VI und VII). Aufgrund seiner Eigenfluoreszenz, Undurchsichtigkeit und die Dicke ist es nicht geeignet für die konfokale Mikroskopie gefunden. Ein alternativer Ansatz für die hier vorgestellt, die für die Immunhistochemie in Paraffin eingebettet Formalin fixierten Sklera verwendet, hat technische Herausforderungen, insbesondere, wenn das Gewebe für Antigen Retrieval Vorwärmen. Da die Sklera in beiden Zellen und Gefäße relativ schlecht ist, wurde die Verwendung von größeren Gewebeproben untersucht, um mit Blick auf Zellen zu verhindern und ihre Lokalisierung in Bezug auf Schiffen und anderen anatomischen Stellen zu verstehen. Um die Analyse von grßeren Gewebeproben unter dem konfokalen Mikroskop zu ermöglichen, eine Laminiertechnik wurde durchgeführt, um dünne Schichten von der Sklera erstellen. Im Anschluss an die Analyse der Ergebnisse von CD31 Blutgefäße und Lymphgefäße endothelialen Hyaluronan-Rezeptor 1 (LYVE1) positive Zellen, für die eine Genehmigung für die wissenschaftliche Untersuchung erhalten wurde, werden die Vorteile und Grenzen dieser Methode diskutiert.

In den repräsentativen Experimenten hier durchgeführt wird, gibt es nachweisbare Vorteile aus der Verwendung dieser besonderen Laminiertechnik abgeleitet. Das erste Experiment veranschaulicht die unterschiedlichen Netzwerk des episkleralen Blutgefß Plexus in drei repräsentativen Bilder (Bild 3). Die Gefäße sind positiv für CD31. Das zweite Experiment zeigt, Immunzellen, insbesondere LYVE1 + Zellen des Episkler...

Menschliches Skleragewebe besteht hauptsächlich aus Kollagen; daher ist es für die Immunhistochemie nicht leicht verwendbar. Um das Ziel zu erreichen, Immunhistochemie für die konfokale Mikroskopie von Skleralgewebe durchzuführen, wurde eine Laminiertechnik verwendet.

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die konfokale Mikroskopie der menschlichen Sklera durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im ophthalmologischen Bereich zu beantworten, beispielsweise zur Verteilung von Immunzellen und zum Gefäßstatus in der gesunden sowie in der pathologischen Sklera.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die konfokale Bildgebung von dichtem Bindegewebe ermöglicht. Stefan Kremers, ein Doktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Zunächst bereiten Sie 96-prozentiges Ethanol und PBS in separaten Röhrchen vor.Bereiten Sie anschließend je 100 Mikroliter der Primärantikörper pro Probe in der empfohlenen Verdünnung in PBS mit zwei Prozent BSA vor und bewahren Sie alle Lösungen auf Eis auf. Bereiten Sie saubere Instrumente vor, darunter ein bis zwei Colibri-Forceps, gerade mikrochirurgische Scheren, gebogene Scheren, ein Skalpell der Größe 10 oder ein ophthalmologisches Mikro-Skalpell (Feather), vier 26-Gauge-Nadeln und einen Tupfer. Wickeln Sie eine Aluminiumfolie um eine Polystyrolplatte oder bereiten Sie eine Korkplatte vor, um das Gewebe daran zu befestigen.Nachdem gemäß Textprotokoll eine nach anterior geöffnete Bulbuswand hergestellt wurde, legen Sie die Sklera mit der offenen Seite nach oben auf einen Tupfer. Entfernen Sie dann mit einer Kolibri-Zange die Netzhaut und die pigmentierten uvalen Schichten von der inneren Sklera, bis die Sklera von diesen Schichten befreit ist. Entfernen Sie anschließend gegebenenfalls mit einer gebogenen Schere die Netzhaut und die Uvea von der Papille.Entfernen Sie dann die restliche Bindehaut, die extraokularen Muskeln und die Tenonsche Kapsel von der oberflächlichen Sklera. Halten Sie das Gewebe nun mit Kolibri-Forceps vorsichtig fest und schneiden Sie mit einer geraden Schere etwa zwei Quadratzentimeter große Skleraproben von verschiedenen Stellen des Gewebes ab, wobei Sie vermeiden sollten, die Proben mehrfach mit der Pinzette anzufassen, da dies den Bereich für die konfokale Mikroskopie ungeeignet machen würde. Geben Sie die Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie 1,5 Milliliter 96-prozentigen Ethanol hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang zur Fixierung des Gewebes.Entfernen Sie danach das Ethanol und waschen Sie die Proben dreimal mit jeweils 1,5 Milliliter PBS für jeweils fünf Minuten unter Schütteln. Überführen Sie anschließend die Proben in 1,5 Milliliter PBS mit fünf Prozent BSA und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, wodurch eine Schwellung der Proben induziert wird, um das Laminieren zu erleichtern und unspezifische Bindungen zu verhindern. Sobald die Proben angeschwollen sind, befestigen Sie unter einem Stereomikroskop die posterioren skleralen Proben mithilfe von 26-Gauge-Nadeln, deren Spitzen gebogen wurden, an der mit Folie umwickelten Polystyrolmembran oder an der Korkplatte.Dann, um die vollständig dicken Proben zu laminieren, halten Sie mit einer Colibri-Pinzette die vordere Kante des skleralen Gewebes horizontal fest. Mit einem Skalpell Nr. 10 schneiden Sie vorsichtig eine möglichst dünne Schicht der oberflächlichen Sklera von der darunterliegenden Schicht ab. Um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet, pipettieren Sie 50 Mikroliter PBS auf die Schichten.Danach die Schnitte in 100 Mikroliter PBS in einer 96-Loch-Platte platzieren und mit einem wasserfesten Marker sowohl die Orientierung als auch die Schicht kennzeichnen. Das Isolieren von Schichten fortsetzen und diese in die 96-Loch-Platte überführen, bis das Gewebe vollständig laminiert ist. Um die Immunhistochemie durchzuführen, das Medium aus der 96-Loch-Platte entfernen, indem die Pipette an der Wand jedes Wells angelegt und die Flüssigkeit abgesaugt wird.Anschießend 100 µL der primären Antikörper, verdünnt im Verhältnis 1:100 in PBS mit zwei Prozent BSA, zu den entsprechenden Vertiefungen hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten auf einem Schüttler mit 200 bis 300 µL PBS waschen. Falls erforderlich, einen weiteren primären Antikörper verwenden und erneut über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Anschießend 100 Mikroliter der entsprechenden sekundären Antikörper hinzufügen, verdünnt im Verhältnis 1:300 in PBS mit zwei Prozent Zieusersum, und im Dunkeln bei Raumtemperatur eine bis zwei Stunden inkubieren. Nach der Inkubation die Proben dreimal je fünf Minuten auf dem Schüttler mit 200 bis 300 Mikroliter PBS erneut waschen. Danach 100 Mikroliter einer 1:2000-Verdünnung von DAPI in jede Vertiefung geben und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.Vor der Verwendung von 200 bis 300 Mikroliter PBS, um die Proben zwei Mal zu waschen. Überführen Sie die Proben unter dem Stereomikroskop auf Objektträger, um sicherzustellen, dass die Probe flach auf dem Objektträger liegt, und geben Sie ein bis zwei Tropfen fluoreszierendes Einbettmedium hinzu. Anschließend legen Sie ein Deckglas auf und versiegeln die Ränder mit durchsichtigem Nagellack.Aufbewahren im Dunkeln bei vier Grad Celsius für eine spätere Verwendung oder direkte Untersuchung mittels konfokaler Mikroskopie. Um die Dicke der Proben zu überprüfen, nehmen Sie Z-Stapel auf, da die Dicke je nach skleraler Lage äquatorial und posterior variiert. Diese Bilder zeigen das vielfältige Netzwerk der Blutgefäßerplexus in lamelliertem menschlichem Skleragewebe, das aus der vorderen und hinteren Episklera stammt.Die Blutgefäße sind positiv für CD31, wie in grün dargestellt. In dieser Abbildung werden LYVE1-positive Immunzellen der Episklera und ihr Verhältnis zu den CD31-positiven Blutgefäßen veranschaulicht. Die Z-Stack-Reihe wurde mit 10facher Vergrößerung aufgenommen, um die dreidimensionalen Beziehungen zwischen Blutgefäßen und Immunzellen zu untersuchen.Wie hier gezeigt, können die innerhalb der Sklera liegenden extraokularen Muskeln ebenfalls auf das Vorhandensein von Blutgefäßen oder Immunzellen mithilfe der Marker CD31 bzw. LYVE1 analysiert werden. Sobald die Laminierungstechnik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Gewebe nicht austrocknet.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe potenziell infektiös sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie mikrobiologische und virologische Diagnostik stets vorab getroffen werden sollten.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Bewertung der chemische Vernetzung von den Kaninchen Sklera mit Erzeugung der zweiten harmonischen Bildgebung und differential scanning Kalorimetrie.

Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phalloidin-basierten filamentösen Aktin-Färbetechnik mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Visualisierung der adhärenten Zellschichtstruktur in mikrofluidischen dynamischen Kulturkanälen und traditionellen statischen Fix-Well-Kulturkammern. Dieser Ansatz hilft bei der Bewertung der Zellschichtkonfluenz, der Monolagenbildung und der Gleichmäßigkeit der Schichtdicke.

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation

Lernen Sie eine Laminierungstechnik für die konfokale Mikroskopie der menschlichen Sklera, um Immunzellverteilung und Gefäßstatus in gesundem und pathologischem Gewebe zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Bildgebung dichter Bindegewebe.

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform

Weitere Videos entdecken