Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist die Durchführung einer konfokalen Mikroskopie der menschlichen Sklera. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Augenheilkunde zu beantworten. Wie zum Beispiel die Verteilung der Immunzellen und der Gefäßstatus bei gesunden Menschen sowie die pathologischen Zustände bei der Sklera.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die konfokale Darstellung von dichtem Bindegewebe ermöglicht. Das Verfahren wird von Stefan Kremers, einem Doktoranden aus unserem Labor, vorgeführt. Bereiten Sie zunächst 96 Prozent Ethanol und PBS in einzelnen Röhrchen vor.

Bereiten Sie dann 100 Mikroliter der Primärantikörper pro Probe in der empfohlenen Verdünnung von PBS mit zwei Prozent BSA vor und halten Sie alle Lösungen auf Eis. Ordnen Sie saubere Instrumente an, darunter ein bis zwei Colibri-Pinzetten, eine gerade Mikropräparierschere, eine gebogene Schere, ein Skalpell mit der Nummer 10 oder eine Mikrofeder mit Augenskalpell, vier 26-Gauge-Nadeln und einen Tupfer. Wickeln Sie Alufolie um eine Styroporplatte oder bereiten Sie eine Korkplatte vor, um das Taschentuch zu befestigen.

Nachdem Sie eine nach vorne geöffnete Glühbirne gemäß dem Textprotokoll hergestellt haben, legen Sie die Sklera mit dem offenen Teil nach oben auf einen Tupfer. Verwenden Sie dann eine Colibri-Pinzette, um die Netzhaut und die pigmentierten Aderhautschichten von der inneren Sklera zu entfernen, bis die Sklera von diesen Schichten befreit ist. Verwenden Sie anschließend bei Bedarf eine gebogene Schere, um die Netzhaut und die Uvea von der Papille zu entfernen.

Entfernen Sie dann die verbleibende Bindehaut, die extraovularen Muskeln und die Sehnenkapsel aus der oberflächlichen Sklera. Mit einer Colibri-Pinzette wird das Gewebe nun sanft gehalten, und mit einer geraden Schere werden etwa zwei Quadratzentimeter große Skleraproben von verschiedenen Stellen des Gewebes geschnitten, wobei ein wiederholtes Greifen mit der Pinzette vermieden wird, das den Bereich für die konfokale Mikroskopie ungeeignet macht. Geben Sie die Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie 1,5 Milliliter 96-prozentiges Ethanol hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang, um das Gewebe zu fixieren.

Nachdem Sie das Ethanol entfernt haben, verwenden Sie 1,5 Milliliter PBS, um die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten unter Schütteln zu waschen. Als nächstes werden die Proben in 1,5 Milliliter PBS mit fünf Prozent BSA überführt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch die Proben aufquellen, um das Laminieren zu erleichtern und eine unspezifische Bindung zu verhindern. Wenn die Proben aufgequollen sind, verwenden Sie unter einem stereobinokularen Mikroskop 26-Gauge-Nadeln, die an den Rändern gebogen wurden, um die hinteren Skleralproben auf der mit Folie umwickelten Polystyrolmembran oder Korkplatte zu befestigen.

Um die Proben in voller Dicke zu laminieren, verwenden Sie dann eine Colibri-Pinzette, um den vorderen Rand des Skleralgewebes horizontal zu halten. Schneiden Sie mit einem Skalpell mit der Nummer 10 vorsichtig eine möglichst dünne Schicht der oberflächlichen Sklera von der darunter liegenden Schicht ab. Um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, pipettieren Sie 50 Mikroliter PBS auf die Schichten.

Nachdem die Schichten geschnitten wurden, legen Sie sie in 100 Mikroliter PBS in eine 96-Well-Platte und beschriften Sie mit einem wasserfesten Marker sowohl die Ausrichtung als auch die Schicht. Fahren Sie mit der Isolierung der Schichten fort und übertragen Sie sie auf die 96-Well-Platte, bis das Gewebe vollständig laminiert ist. Um die Immunhistochemie durchzuführen, entfernen Sie das Medium von der 96-Well-Platte, indem Sie die Pipette gegen die Wand jeder Vertiefung halten und die Flüssigkeit ansaugen.

Geben Sie dann 100 Mikroliter der Primärantikörper, verdünnt um eins bis 100 in PBS mit zwei Prozent BSA, in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Proben mit 200 bis 300 Mikrolitern PBS dreimal für jeweils fünf Minuten auf einem Shaker. Verwenden Sie bei Bedarf einen anderen Primärantikörper und inkubieren Sie erneut über Nacht bei vier Grad Celsius.

Dann fügen Sie 100 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörper hinzu, verdünnen einen bis 300 in PBS mit zwei Prozent Ziegenserum und inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für ein bis zwei Stunden. Nach der Inkubation werden die Proben mit 200 bis 300 Mikrolitern PBS erneut dreimal für jeweils fünf Minuten auf dem Schüttler gespült. Geben Sie dann 100 Mikroliter einer Verdünnung von 1 bis 2000 DAPI in jede Vertiefung und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Bevor Sie 200 bis 300 Mikroliter PBS verwenden, um die Proben zweimal zu waschen. Übertragen Sie die Proben auf Objektträger unter dem stereobinokularen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Probe flach auf dem Objektträger liegt, und fügen Sie ein bis zwei Tropfen fluoreszierendes Eindeckmedium hinzu. Legen Sie dann einen Deckslip darauf und versiegeln Sie die Ränder mit transparentem Nagellack.

Für die spätere Verwendung im Dunkeln bei vier Grad Celsius lagern oder direkt durch Konfokalmikroskopie untersuchen. Um die Dicke der Proben zu überprüfen, werden Z-Stacks entnommen, da die Dicke je nach Skleraposition äquatorial und posterior unterschiedlich ist. Diese Bilder zeigen das vielfältige Netzwerk des Blutgefäßplexis in laminierten humanen Sklera, die aus der vorderen und hinteren Episklera stammen.

Die Blutgefäße sind positiv für CD31, wie in grün dargestellt. In dieser Abbildung sind LYVE1-positive Immunzellen der Episclera und ihre Beziehung zu den CD31-positiven Blutgefäßen dargestellt. Die Z-Stack-Serie wurde mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen, um die dreidimensionalen Beziehungen von Blutgefäßen und Immunzellen zu untersuchen.

Wie hier gezeigt, können auch die in der Sklera eingeschlossenen extraokulären Muskeln mit den Markern CD31 bzw. LYVE1 auf das Vorhandensein von Blutgefäßen oder Immunzellen untersucht werden. Einmal gemeistert, kann die Laminiertechnik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass das Gewebe nicht austrocknet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe potenziell infektiös sein kann und im Vorfeld immer Vorsichtsmaßnahmen wie mikrobiologische und virologische Diagnostik getroffen werden sollten.