Name: Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Lernen Sie die Tandem-Affinitätsreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie zur Identifizierung von MyoD-Proteinpartnern in HeLa S3-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse selten vorkommender Interaktoren in subnukleären Kompartimenten.

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Die Arbeit im Ait-Si-Ali-Labor wurde unterstützt von der Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot und die "Wer bin ich?" Laboratory of Excellence #ANR-11-LABX-0071, finanziert von der französischen Regierung im Rahmen des Programms "Investments for the Future", das von der ANR unter dem Zuschuss #ANR-11-IDEX-0005-01 betrieben wird. EB wurde durch einen INCA Zuschuss unterstützt.

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<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
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<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
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<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
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<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
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<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine erschöpfende Identifizierung von Partnern eines Transkriptionsfaktors, MyoD. Es zeigte sich MyoD Partner in einem heterologen System resistent gegen MyoD-induzierte Differenzierung, nämlich HeLa-S3-Zellen. Somit definitions identifiziert MyoD Partner ubiquitär exprimiert. Diese umfassen allgemein und sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren, Chromatin-modifizierende Enzyme, RNA - Prozessierung Proteine, Kinasen (Tabellen 1 und 2). Da HeLa-S3-Zel...

Eukaryotische mehrzellige Organismen werden aus verschiedenen Organen und Geweben besteht. Jedes funktionale Gewebe hat ein spezifisches Gen-Musterausdruck, der bei jedem Differenzierungsschritt bestimmt wird. Zelldifferenzierung beinhaltet die Aktivierung von spezifischen Genen, Wartung ihrer Expression und, im allgemeinen, die von einem Satz von Genen, beteiligt an der Zellproliferation silencing. Skelettmuskeldifferenzierung oder Myogenese, ist somit ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bestimmung von mesodermalen Stammzellen in Myoblasten beginnt, und dann führt zur terminalen Differenzierung dieser Myoblasten in erste mono nukleiert, und dann mehrkernigen, Myotuben . Somit Myoblasten &quot;bestimmt&quot; Zellen, die noch in der Lage zu proliferieren, aber sie sind auf die Skelettmuskelabstammungslinie gebunden und somit ausschließlich in Skelettmuskelzellen entweder während der embryonalen Entwicklung oder im Erwachsenenmuskelregeneration unterscheiden kann. Der Prozess der Skelettmuskulatur Terminal unterscheidenzierung wird durch eine spezifische genetische Programm orchestriert , die aus dem Zellzyklus der Myoblasten - Vorläuferzellen mit dem Permanent Ausgang beginnt , die mit 1 der Proliferation assoziierten Genen, wie E2F Zielgenen auf eine definitive silencing führt. Tatsächlich während des Prozesses der terminalen Differenzierung, Proliferation Myoblasten Stillstand ist ein entscheidender Schritt, der die Expression von Skelettmuskel - spezifischen Genen und die Fusion von Myoblasten in Myotuben 2 vorausgeht. Ein solches Programm ermöglicht erwachsenen Muskelstammzellen, auch Satellitenzellen genannt, während des Regenerationsprozesses folgende Skelettmuskelverletzung zu unterscheiden. Mammalian myogenesis auf eine Familie von myogenic basischen Helix-Loop-Helix kritisch abhängig ist (bHLH) Transkriptionsfaktoren MyoD, Myf5, MRF4 und Myogenin bezeichnet häufig als die Familie der Skelettmuskulatur Bestimmung Faktoren oder MRF (Muscle Regulatory Factors) 3. Jeder von ihnen spielt eine wesentliche Rolle in der Beschreibung und den difzierung von Skelettmuskelzellen und eine spezifische Expressionsmuster April 05-07. Die Aktivierung von Myf5 und MyoD bildet die bestimmend Schritt, die Zellen in die myogenen Linie, und anschließende Expression der Myogenin löst myogenesis mit der Aktivierung von Skelettmuskel spezifische Gene, wie MCK (Muscle Creatine Kinase) begeht. Myogenen bHLH - Transkriptionsfaktoren wirken mit Mitgliedern der MEF2 - Familie bei der Aktivierung von Muskel Gene von zuvor stillen loci 8. Sie stimulieren auch Skelettmuskel Gentranskription als Heterodimere mit ubiquitären bHLH - Proteinen, E12 und E47, wie E - Proteine ​​bekannt, die in verschiedenen Gen-regulatorischen Regionen 8 sogenannte E-Boxen binden. Twist, Id (Inhibitor der Differenzierung) und andere Faktoren negativ diesen Prozess regulieren, durch die Bindung 8 mit MyoD für E - Proteine ​​konkurrieren. MyoD wird als wichtiger Akteur betrachtet bei der Auslösung von Muskel terminale Differenzierung 9 </sup&gt; da hat es die Fähigkeit , eine myogenic Bestimmung / Differenzierung (trans-Differenzierung) Programm in vielen ausdifferenzierten nicht Muskelsysteme 10-13 zu induzieren. Tatsächlich induziert gezwungen Expression von MyoD die trans-Differenzierung verschiedener Zelltypen , auch diejenigen , die aus einem anderen embryologischen Ursprungs 12. Zum Beispiel MyoD können Hepatozyten, Fibroblasten, Melanozyten, Neuroblasten und Adipozyten in muskelähnliche Zellen umwandeln. Die trans-differentiative Wirkung von MyoD beinhaltet eine abnormale Aktivierung des genetischen Programms myogene (insbesondere seine Zielgene) in einem nicht-muskuläre Umgebung gleichzeitige zum Silencing des ursprünglichen genetischen Programms (insbesondere Proliferationsgene). In proliferierenden Myoblasten wird MyoD ausgedrückt , ist aber nicht imstande, seine Zielgene selbst aktivieren , wenn es um ihre Promotoren bindet 14-16. Daher ist für die Anforderung MyoD kontinuierlich in undifferenzierte Myoblasten exprimiert werden bleibt ganz elusive. MyoD konnte seine Zielgene aufgrund Rekrutierung von repressiven Chromatin-modifizierende Enzyme in proliferierenden Myoblasten vor dem Laden von Chromatin - Remodeling - Enzyme 14,17 Aktivierung unterdrücken . Zum Beispiel Myoblasten in wuchernden, MyoD mit Transkriptions Korepressor KAP-1, Histon-Deacetylasen (HDACs) und repressive Lysin-Methyltransferasen (KMZ) verbunden sind, einschließlich Histon H3 Lysin 9 oder H3K9 und H3K27 Kmts und unterdrücken aktiv seine Zielgene Ausdruck durch eine lokal repressiven Chromatinstruktur 14,17 etablieren. Wichtig ist , zeigte eine kürzlich veröffentlichten Bericht , dass MyoD ist selbst durch die H3K9 KMT G9a was zu einer Hemmung der Aktivität transaktivierend 16 direkt methyliert. Die epigenetische Mechanismen in dieser Transdifferenzierung nicht-Muskelzellen durch MyoD sind weitgehend unbekannt. Bemerkenswerterweise sind einige Zelllinien resistent gegen MyoD-induzierte Transdifferenzierung. So wird in HeLa-Zellen, MyoD ist entweder inaktiv oderkönnte sogar als Repressorfunktion anstatt Aktivator der Transkription aufgrund des Fehlens der Expression der BAF60C Untereinheit des Chromatin - Remodeling - Komplexes SWI / SNF 18. Dieses Modell kann somit der Wahl sein, um besser die Mechanismen der MyoD-induzierte Gen Repression zu charakterisieren. Es ist auch geeignet , um die Fähigkeit von MyoD dem Test an seinem Zielloci mit seinen zugehörigen Partner repressive Chromatin - Umgebung zu induzieren und daher die MyoD abhängigen repressive Mechanismen aufzudecken Myoblasten in proliferierenden terminalen Differenzierung zur Feinabstimmung. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Identifizierung von MyoD Partner unter Verwendung von Tandem Affinity Purification (TAP-Tag), die mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung. Die Verwendung von HeLa-S3-Zellen stabil Flag-HA-MyoD exprimieren erlaubt genug Material bekommen die MyoD Komplexe aus fraktionierten Kernextrakten zu reinigen. Die Identifizierung von MyoD Partner im heterologen System wurde von validati gefolgtauf in einem relevanten System.

<table><tbody><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator:&nbsp; Dounce Homogenisator&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 und 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Rührwerk für Spinner</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Niedrig bindende Röhrchen</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Leere Spin-Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-Polyacrylamid 4-12%&nbsp; Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x Ladepuffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x Reduktionsmittel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Silberfärbekit</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheiten, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarosekügelchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; Harz</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Flag Harz (Anti-Flag M2-Agarose-Affinitätsgel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA Harz (monoklonale Anti-HA Agarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Flagfreies Peptid (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>Resuspendierung von bis zu 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>HA freies Peptid (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Kundenspezifische Synthese</td><td>Resuspendierung von bis zu 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Protein-Assay-Kit auf Bicinchoninsäure-Basis: BCA-Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitoren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Luminol-basiertes verbessertes Chemilumineszenz-Substrat (ECL) HRP-Substrat</td><td>Lebenstechnologien</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Spermien-DNA von geschertem Lachs (Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus Lachshoden)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Spermin-Tetrahydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS Laufpuffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoher Glukosegehalt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Vorwärmen&nbsp; bei 37&Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>: Trypsin-EDTA (0,05 % Phenolrot</td>, <td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr>, <tr><td>Serum</td>, <td>GE, Gesundheitswesen, Life Sciences&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Jede Charge Serum muss zuerst auf Ihre Zellen getestet werden.</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (steril gefiltert)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA aus Ratte (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Zur Verwendung für Western Blotting</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Zur Verwendung für Immunpräzipitation und Western Blotting</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Maus</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Kaninchen</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Ratte -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus für Ziegen -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von myod interaktom gekoppelt mit tandem affinity purification zu mass spectrometry

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Der Skelettmuskel terminale Differenzierung beginnt mit dem Einsatz von pluripotenten mesodermalen Vorläuferzellen zu Myoblasten. Diese Zellen haben immer noch die Möglichkeit, sich zu vermehren oder sie können unterscheiden und Sicherung in kernige Myotuben, die maturate weiter Muskelfasern zu bilden. Der Skelettmuskel terminalen Differenzierung wird durch die koordinierte Wirkung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren orchestriert, insbesondere die Mitglieder der Muskel-regulierende Faktoren oder MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 und MRF4), auch genannt die myogenen bHLH Transkriptionsfaktoren Familie. Diese Faktoren wirken mit Chromatin-Remodeling-Komplexe in aufwendigen Transkriptionsregulationsnetzskelett myogenesis zu erreichen. Dabei ist der Master MyoD myogenen Transkriptionsfaktor betrachtet in Muskel terminalen Differenzierung auszulösen. Diese Vorstellung wird durch die Fähigkeit von MyoD verstärkt nicht-Muskelzellen in Skelettmuskelzellen umwandeln. Hier haben wir einen Ansatz beschreiben MyoD zu identifizierenProteinpartner in erschöpfender Weise, um die verschiedenen Faktoren in Skelettmuskel terminalen Differenzierung beteiligt aufzuklären. Das langfristige Ziel ist es, die epigenetische Mechanismen bei der Regulation der Skelettmuskulatur Gene beteiligt zu verstehen, dh., MyoD Ziele. MyoD Partner werden durch die Verwendung Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) von einem heterologen System gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung, gefolgt von Validierung der Rolle der relevanten Partner während der Skelettmuskulatur terminalen Differenzierung identifiziert. kongenitale Myasthenie, Muskeldystrophie, Rhabdomyosarkom und Defekte in der Regeneration der Muskulatur: Aberrant Formen von myogenen Faktoren oder deren abweichende Regelung, sind mit einer Reihe von Muskelerkrankungen in Verbindung gebracht. Als solche bieten myogenen Faktoren einen Pool von potenziellen therapeutischen Ziele in Muskelerkrankungen, sowohl im Hinblick auf Mechanismen, die Krankheit selbst und regenerative Mechanismen verursachen, die Behandlung von Krankheiten zu verbessern. Somit ist die detaillierte underding der intermolekularen Wechselwirkungen und die genetischen durch die myogene Faktoren gesteuert Programme ist für das rationale Design von effizienten Therapien unerlässlich.

Um die Regulierung der Aktivität MyoD verstehen, unternahmen wir die erschöpfende Charakterisierung der MyoD Komplexe mittels biochemischer Reinigung, basierend auf der Immunreinigung einer Doppel tagged Form MyoD gefolgt von Massenspektrometrie (MS). Die Verwendung von HeLa-S3-Zelllinie exprimiert Flag-HA-markierten MyoD und eine Linie Kontrollzelle, die Flag-HA erlaubt genug Material bekommen die MyoD-Komplex zu reinigen, indem Sie doppelt Affinitätsreinigung von Flag-HA-MyoD durchführ...

MyoD ist ein myogener Transkriptionsfaktor mit einer starken Fähigkeit, die myogene Transdifferenzierung vieler vollständig differenzierter Nicht-Muskelzelllinien zu induzieren. Die epigenetischen Mechanismen, die an dieser Transdifferenzierung beteiligt sind, sind weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine Aufreinigungsmethode mit doppelter Affinität, gefolgt von Massenspektrometrie, um MyoD-Partner umfassend zu charakterisieren.

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die MyoD-Proteinpartner umfassend zu charakterisieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Skelettmuskelbiologie beantworten, wie z.B. die molekulare Regulation der tonalen Verformung der Skelettmuskulatur durch den Schlüsselfaktor für Muskeltranskriptionen, MyoD. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, MyoD-Partner zu entschlüsseln, die eine elektiv geringe Häufigkeit aufweisen, von denen einer in einem bestimmten subnukleären Kompartiment lokalisiert ist.Obwohl diese Methode Einblicke in die Regulation der Muskeldifferenzierung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf jedes andere Gewebe, insbesondere auf die Kerndifferenzierung. Das Verfahren wird von Dr. Lauriane Fritsch, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, vorgeführt. In diesem Protokoll werden MyoD-Komplexe aus HeLa S3-Zellen aufgereinigt, die MyoD stabil mit FLAG-Glutenin-Tags exprimieren.Als Kontrolle werden HeLa S3-Zellen verwendet, die mit dem leeren Vektor transduziert wurden. Beide Zelllinien wurden zuvor bei minus 80 Grad Celsius gezüchtet, gesammelt und gelagert, wie

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Drosophila ist berühmt für seine leistungsstarken genetischen Manipulation, aber nicht für die Eignung der eingehenden biochemischen Analyse. Hier präsentieren wir eine TAP-basierte Verfahren, um Interaktionspartner eines Proteins von Interesse aus dem Fliegenhirn zu identifizieren. Dieser Vorgang kann möglicherweise zu neue Wege der Forschung führen.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung von endogenen Phosphoproteinphosphatasen und ihren interagierenden Proteinen aus Zellen und Geweben und deren Identifizierung und Quantifizierung durch massenspektrometriebasierte Proteomik vor.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Ein kurzes Protokoll für Protein-Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in Polyacrylamidgelen wird ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Essigsäure als in der klassischen Färbeverfahren mit CBB beschrieben.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Lernen Sie die Tandem-Affinitätsreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie zur Identifizierung von MyoD-Proteinpartnern in HeLa S3-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse selten vorkommender Interaktoren in subnukleären Kompartimenten.

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

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