Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die MyoD-Proteinpartner umfassend zu charakterisieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Skelettmuskelbiologie beantworten, wie z.B. die molekulare Regulation der tonalen Verformung der Skelettmuskulatur durch den Schlüsselfaktor für Muskeltranskriptionen, MyoD. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, MyoD-Partner zu entschlüsseln, die eine elektiv geringe Häufigkeit aufweisen, von denen einer in einem bestimmten subnukleären Kompartiment lokalisiert ist.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Regulation der Muskeldifferenzierung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf jedes andere Gewebe, insbesondere auf die Kerndifferenzierung. Das Verfahren wird von Dr. Lauriane Fritsch, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, vorgeführt. In diesem Protokoll werden MyoD-Komplexe aus HeLa S3-Zellen aufgereinigt, die MyoD stabil mit FLAG-Glutenin-Tags exprimieren.

Als Kontrolle werden HeLa S3-Zellen verwendet, die mit dem leeren Vektor transduziert wurden. Beide Zelllinien wurden zuvor bei minus 80 Grad Celsius gezüchtet, gesammelt und gelagert, wie im Protokolltext beschrieben. Tauen Sie die Zellpellets schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf.

Alle Puffer und Homogenisatoren sollten vorgekühlt werden und der gesamte Vorgang sollte in einem Kühlraum durchgeführt werden. Typischerweise werden 20 Gramm Zellen für jeden Versuchspunkt verwendet, aber für die Zwecke dieser Demonstration werden nur 10 Gramm oder etwa 10 ml Zellen verarbeitet. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml hypotonischem Puffer A, indem Sie zunächst 5 ml des Puffers verwenden.

Fügen Sie dann 2,5 ml hinzu, gefolgt von weiteren 2,5 ml. Waschen Sie die Pipette gut mit frischem Puffer, um das Maximum an Zellen zu erhalten. 20 ml der Zellsuspension werden mit einem dicht schließenden Stößel in den vorgekühlten Homogenisator überführt.

Homogenisieren Sie die Zellen mit 20 Hüben. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Für eine maximale Rückgewinnung der Zellen waschen Sie den Homogenisator mit 3,5 mL Saccharosepuffer.

Übertragen Sie diese Suspension schnell in das 50-ml-Röhrchen, um die Zellkerne zu erhalten und Leckagen zu begrenzen. Färben Sie ein 30-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension mit 30 Mikrolitern 4%Trypanblau und analysieren Sie es unter dem Mikroskop, um die Lyseeffizienz zu bestimmen. Alle Zellkerne sollten blau sein, wenn die Lyse erfolgreich ist.

Wiederholen Sie gegebenenfalls die Homogenisierung. Zentrifugieren Sie sieben Minuten lang bei 10.000 x g und vier Grad Celsius, um die Zellkerne zu pelletieren. Bewahren Sie den Überstand als zytoplasmatische Fraktion auf.

Beginnen Sie das Verfahren zur Herstellung der extrahierbaren Kernsalzfraktion, indem Sie das Kernpellet in 4 ml Saccharosepuffer resuspendieren. Fügen Sie dann Tropfen für Tropfen 4 ml Puffer mit hohem Salzgehalt hinzu, während Sie gründlich auf einem Wirbel mischen, um eine Endkonzentration von 300 mM Natriumchlorid zu erhalten. 30 Minuten auf Eis inkubieren und alle fünf Minuten mischen.

Verringern Sie anschließend die Natriumchloridkonzentration auf 150 mM, indem Sie 8 mL Saccharosepuffer hinzufügen. 10 Minuten bei 13.000 x g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand, d. h. die salzextrahierbare Fraktion, und lassen Sie ihn auf Eis.

Um die Chromatingebundene Fraktion herzustellen, resuspendieren Sie das Pellet sorgfältig in 3,5 ml Saccharosepuffer. Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugeben und mischen. Das Calciumchlorid aktiviert die Mikrokokken-Nuklease, die später hinzugefügt wird.

Die Suspension eine Minute lang auf 37 Grad Celsius vorheizen. Fügen Sie 35 Mikroliter eines Mikrokokken-Nukleasebestands von 5 Einheiten pro Mikroliter hinzu, um eine Endkonzentration von 25 10 Tausendstel Einheit pro Mikroliter zu erhalten. Genau 12 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Alle vier Minuten mischen. Nach 12 Minuten die Reaktion sofort auf Eis legen. Um die Aktivität der Mikrokokken-Nuklease zu stoppen, fügen Sie 56 Mikroliter 5 molare EDTA pH 8,0 zu einer Endkonzentration von 4 mM hinzu und wirbeln Sie sie auf.

Fünf Minuten auf Eis inkubieren. Beschallung fünfmal für jeweils eine Minute bei hoher Amplitude, so dass zwischen den Beschallungen eine Pause von einer Minute eingelegt werden kann. Sowohl die salzextrahierbare als auch die mit Nukleosomen angereicherte Fraktion wird 30 Minuten lang bei 85.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Sammelt die Überstände ein. Die extrahierbare Salzfraktion sollte etwa 13 ml betragen. Und die mit Nukleasom angereicherte Fraktion sollte etwa 6 ml betragen.

MyoD-Proteinkomplexe werden durch Aufreinigung mit doppelter Affinität aufgereinigt. Da die Verfahren für die FLAG-basierte und die HA-basierte Aufreinigung ähnlich sind, wird nur die FLAG-basierte Aufreinigung demonstriert. Nach der Zugabe von TEGN wird das entsprechende Volumen des FLAG-Harzes in ein 50-ml-Röhrchen überführt.

Für jeden Experimentierpunkt werden 300 Mikroliter FLAG-Harz aus der kommerziellen 50%-Vorwäsche FLAG benötigt. Zwei Minuten lang bei 1.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie kaltes TEGN hinzu und zentrifugieren Sie erneut.

Waschen Sie das FLAG-Harz insgesamt fünfmal mit kaltem TEGN. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das FLAG-Harz in einer gleichen Menge TEGN. Mischen Sie für jeden Versuchspunkt 300 Mikroliter gewaschenes FLAG-Harz und den entsprechenden Proteinextrakt.

Verwenden Sie ein 15-ml-Röhrchen für die mit Nukleasom angereicherte Fraktion und ein 50-ml-Röhrchen für die salzextrahierbare Fraktion. Inkubieren Sie die Röhrchen auf einem rotierenden Rad über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Folgetag zentrifugieren Sie alle Röhrchen für zwei Minuten bei 1.000 x g bei vier Grad Celsius.

Die Überstände werden aufgefangen und bei vier Grad Celsius aufbewahrt, bis das Ergebnis der Prüfung der Reinigungseffizienz vorliegt. Für die salzextrahierbaren Proben resuspendieren Sie das FLAG-Harz in 4 mL TEGN und geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und übertragen Sie ihn jedes Mal auf dieselben 15 ml, um den Verlust von Kügelchen zu vermeiden.

Zwei Minuten bei 1.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach Entfernen des Überstands werden 13 mL TEGN zum FLAG-Harz gegeben und zwei Minuten lang bei 1.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Waschen Sie das Harz auf diese Weise siebenmal.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Harz in 1 mL TEGN und geben Sie es in ein 1,5 mL Röhrchen mit niedriger Bindung. Zwei Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Harz für jeden Versuchspunkt in 100 Mikrolitern FLAG-Peptidlösung bei 4 mg/ml bei einem pH-Wert von 7,8. Mischen Sie es gut und fügen Sie 100 Mikroliter TEGN-Puffer hinzu.

Inkubieren Sie mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius, um gebundene Proteine zu eluieren. Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang und geben Sie das Harz und den Überstand in eine leere Spin-Säule, die in ein 2-ml-Röhrchen gegeben wird. Die Säule wird eine Minute lang bei 6.000 x g zentrifugiert.

Sammeln Sie den übrig gebliebenen Überstand im 2-ml-Röhrchen. Die Reinigungseffizienz wird dann wie im Protokolltext beschrieben getestet, bevor mit der HA-basierten Aufreinigung fortgefahren wird. Hier sind repräsentative Ergebnisse von doppelt affinitätsgereinigten MyoD-Komplexen aus nuklearen salzextrahierbaren oder nukleasomangereicherten Fraktionen einer HeLa S3-Zelllinie, die FLAG HA MyoD stabil exprimieren.

Bei der Silberfärbung wurde FLAG HA MyoD identifiziert, das durch den Pfeil gekennzeichnet ist, der in der Scheinzelllinie nicht vorhanden ist. Die doppelaffinitätsgereinigten MyoD-Komplexe wurden auf Glyceringradienten fraktioniert. Beim Western Blot der Fraktionen mit Anti-FLAG-Antikörpern wurden die MyoD-Subkomplexe in den beiden subnukleären Kompartimenten freigelegt.

Insbesondere ist salzextrahierbares MyoD in drei Unterkomplexen verteilt, während das chromatingebundene MyoD hauptsächlich zu einem Komplex gehört. Die massenspektrometrische Analyse von MyoD-Interaktoren, die aus nuklearen, salzextrahierbaren und nukleosomenangereicherten Fraktionen isoliert wurden, identifizierte eine Reihe bekannter und neuer Partner von MyoD. Hier werden die MyoD-Interaktoren, die in beiden Fraktionen vorkommen oder, spezifisch für eine der Fraktionen, auf der Grundlage ihrer funktionellen Annotationen gruppiert.

Einige der Massenspektrometrien zeigten, dass Interaktoren durch Western Blot auf MyoD-Komplexen bestätigt wurden. Dazu gehören die Transkriptionsfaktoren CBF, die SWI/SNF-Untereinheit BAF47 und die HP1-Proteine. Da HeLa-Zellen keine Muskelzellen sind und normalerweise kein MyoD exprimieren, ist es notwendig, die Wechselwirkungen zwischen neu identifizierten Interaktoren und MyoD und Myoblasten zu bestätigen.

Nukleäre Gesamtextrakte aus proliferierenden und differenzierenden Maus-Myoblasten wurden für die Immunpräzipitation und die westliche Analyse mit den angegebenen Antikörpern verwendet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die erzielten Ergebnisse in Myoblasten zu verfeinern.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie der Knockdown des jeweiligen Partners im Relevanzsystem wie Myoblasten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die funktionelle Bedeutung der Interaktion zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der entwicklungsbiologischen Epigenetik den Weg, um das Regulationsnetzwerk von fünf Transkriptionsfaktoren in den meisten Körpersystemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Partner des Transkriptionsfaktors identifizieren können, indem Sie eine Zellfraktionierung durchführen, gefolgt von einer Tandem-Affinitätsreinigung in Verbindung mit Massenspektrometrie.