Targeting Biofilm Assoziierte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Biofilme einfach und reproduzierbar in einem 96-Well-Plattenformat auf an den Deckeln befestigten Zapfen mittels eines Vitalitätsfarbstoffs für die Testung der Antibiotikasuszeptibilität anzuzüchten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Antibiotika-Entdeckung und -Entwicklung zu beantworten, indem sie die Wirkung auf Biofilm-assoziierte Zellen untersucht, die oft repräsentativer für Infektionszustände in vivo sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, vorgebildete Biofilme in einem dreiteiligen mittleren Assay leicht zu belasten und die Hemmung mittels eines gängigen Vitalitätsfarbstoffs zu bestimmen.

Beginnen Sie damit, eine Kultur eines biofilmbildenden Organismus in einem nährstoffreichen Medium anzusetzen. Inokulieren Sie den Stamm Staphylococcus aureus Newman aus einem Glycerin-Halt in 10 Milliliter Muller-Hinton-Medium. Führen Sie alle Arbeiten, bei denen S. aureus manipuliert wird, mit Handschuhen und innerhalb eines Biosicherheitswerksatzes durch.

16 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rüttelinkubator inkubieren. Das berechnete Kulturvolumen einer Zentrifugenröhrchen hinzufügen und die Zellen durch Zentrifugation eine Minute bei 10.000 G pelletieren. Um den Biofilminokulum vorzubereiten, das verbrauchte Wachstumsmedium absaugen und das Zellenpellet in 20 Milliliter CRPMI erneut suspendieren. Mit einer 200-Mikroliter-Mehrkanalpipette 125 Mikroliter Inokulum aus einem 25-Milliliter-Behälter in jede Vertiefung der Reihen A bis G der unteren Platte geben.

Füllen Sie 125 Mikroliter steriles CRPMI-Medium in jedes Loch der Reihe H als Sterilitätskontrolle. Nehmen Sie den Stiftdeckel und halten Sie ihn mit den Stiften nach unten über den Plattenboden. Richten Sie die einzelnen Stifte sorgfältig mit den entsprechenden Löchern aus.

Vermeiden Sie physischen Kontakt zwischen der Platte und den Zapfen. Senken Sie den Deckel vorsichtig herab, sobald er ausgerichtet ist. Versiegeln Sie den Deckel mit Parafilm, um Verdunstung zu verhindern, und legen Sie die Platte in einen verschließbaren Plastikbeutel, den Sie fest verschließen.

Halten Sie das Luftvolumen in der Tüte so gering wie möglich, um die Verdunstung zu minimieren. Inkubieren Sie die Platte ohne Schütteln bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator. Am Tag der Biofilm-Belastung nehmen Sie eine frische 96-Well-Platte und geben 100 Mikroliter CRPMI, die auf Raumtemperatur ausgeglichen wurden, in jedes Well der Reihen B bis H. Verdünnen Sie bis zu vier Testsubstanzen separat in 1,0 Milliliter CRPMI auf die 2-fache gewünschte Endkonzentration.

Fügen Sie 200 µL von Verbindung 1 in die Vertiefungen A1–A3 hinzu. 200 µL von Verbindung 2 in die Vertiefungen A4–A6. 200 µL von Verbindung 3 in die Vertiefungen A7–A9. Und 200 µL von Verbindung 4 in die Vertiefungen A10–A12. Verdünnen Sie die Testverbindungen seriell mithilfe einer Mehrkanalpipette.

Beginnen Sie damit, 100 Mikroliter von Reihe A in Reihe B zu übertragen und zu mischen. Setzen Sie auf diese Weise fort, jeweils 100 Mikroliter von Brunnen zu Brunnen zu übertragen. Mischen Sie nach jeder Übertragung und hören Sie in Reihe F auf. Nach dem Mischen geben Sie 100 Mikroliter aus Reihe F in einen Abfallbehälter ab.

Übertragen Sie keine Flüssigkeit in die Reihen G und H. Fügen Sie schließlich mit einer Mehrkanalpipette je 100 Mikroliter CRPMI in jedes Loch der Platte hinzu, um das Endvolumen auf 200 Mikroliter zu bringen. Geben Sie 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in eine neue, sterile 96-Loch-Platte, deren Löcher die gleichen Abmessungen wie die der Biofilmbildungs-Initiierungsplatte aufweisen. Entfernen Sie danach die Plastiktüte und die Paraffinfolie von der inkubierten Biofilmbildungs-Initiierungsplatte.

Heben Sie den Deckel gerade nach oben, wobei Sie vermeiden sollten, dass die Zapfen den Boden der Platte berühren, da dies den Biofilm beschädigen könnte. Behalten Sie den unteren Teil für die anschließende OD600-Analyse. Spülen Sie planktische Zellen ab, indem Sie den Zapfendeckel auf die Platte mit PBS setzen.

Tauchen Sie die Stifte fünf Sekunden lang ein. Heben Sie sie aus dem PBS heraus und tauchen Sie sie erneut ein, wobei darauf geachtet werden sollte, dass die Stifte nicht gegen die Wandungen der Vertiefungen stoßen. Legen Sie den gespülten Stiftdeckel in die Challenge-Platte.

Vermeiden Sie unnötigen Kontakt zwischen den Stiften und der Bodenplatte, da dies den Biofilm beschädigen und zu inkonsistenten Ergebnissen führen kann. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und legen Sie sie wie zuvor in einen verschließbaren Plastikbeutel. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator, ohne Schütteln.

Nehmen Sie den Boden der Biofilmbildungs-Initiierungsplatte und resuspendieren Sie die Bakterien in jedem Well mit einer Mehrkanalpipette. Messen Sie den OD600 mit einem geeigneten Mikroplattenreader, um das Wachstum in allen Wells außer den Sterilitätskontrollen in Reihe H zu bestätigen. Verwenden Sie einen Plattenreader mit Inkubationskammer, der kinetische Fluoreszenzmessungen zur Detektion der Resazurin-Umwandlung ermöglicht. Richten Sie eine 24-stündige kinetische Fluoreszenzmessung mit einer Anregung bei 530 Nanometern und einer Emission bei 590 Nanometern ein.

Stellen Sie die Kammertemperatur auf 37 Grad Celsius ein und lassen Sie die Platte alle 20 Minuten auslesen. Stellen Sie den Plattenreader gemäß den Herstelleranweisungen so ein, dass er von der Unterseite der Platte misst. Bereiten Sie das Waschen der Platte vor, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter PBS in jedes Loch einer sterilen 96-Loch-Platte geben.

Dann bereiten Sie das Biofilm-Recovery-Medium vor, indem Sie 400 Mikroliter einer 0,8 Milligramm pro Milliliter Resazurin-Stammlösung zu 20 Millilitern CRPMI-Medium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 16 Mikrogramm pro Milliliter Resazurin zu erreichen. Fügen Sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette jeweils 150 Mikroliter Biofilm-Recovery-Medium in jedes Loch einer frischen 96-Loch-Platte hinzu. Entnehmen Sie die Challenge-Platte aus dem Inkubator und bringen Sie sie in einen Biosicherheitsschrank; entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und die Versiegelungsfolie.

Entfernen Sie den Stiftdeckel von der Challenge-Platte und spülen Sie die planktischen Zellen wie zuvor mit PBS ab, wobei der Boden der Challenge-Platte für die anschließende OD600-Analyse aufbewahrt wird. Nach dem Spülen setzen Sie den Stiftdeckel in den Plattenboden, der das Biofilm-Recovery-Medium enthält. Wickeln Sie die Seite der Platte mit Parafilm ab, wobei darauf geachtet werden muss, dass der Boden der Randwells nicht blockiert wird.

Unmittelbar nach dem Verpacken der Platte diese auf das Plattenlesegerät stellen und eine kinetische Messung über einen Zeitraum von 24 Stunden starten, indem das zuvor erstellte Resazurin-Kinetik-Protokoll initiiert wird. Um das Wachstum planktischer Zellen, das während der Challenge auftreten kann oder auch nicht, zu quantifizieren, den OD600 der gesamten Unterseite der Challenge-Platte mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts messen. Hier ist ein Beispiel-Layout einer Challenge-Platte dargestellt, bei dem zwei vollständige Verdünnungen verwendet werden, um die Verbindungskonzentrationen zu titrieren.

Gewachsene Biofilme wurden mit Neocuproin oder dessen Kupferkomplex behandelt. OD600-Messungen der Unterseite der Challenge-Platte nach 24 Stunden zeigten, dass der Neocuproin-Kupferkomplex, im Gegensatz zu Neocuproin allein, bei Konzentrationen von 1,25 µM oder höher die Abgabe und anschließende Vermehrung lebensfähiger Zellen aus behandelten Biofilmen verhinderte. Die entsprechenden Biofilme wurden anschließend mittels Resazurin-Assay getestet.

Die visuelle Inspektion nach 24 Stunden ermöglicht eine schnelle Ja-Nein-Antwort, wenn mehrere Platten parallel durchgeführt werden. Resazurin färbt sich in Vertiefungen mit lebensfähigen Biofilmen rosa, bleibt jedoch blau, wenn der Biofilm abgetötet wurde. Eine kinetische Messung der Resazurin-Umwandlung kann konzentrationsabhängige Effekte auf die Lebensfähigkeit des Biofilms aufzeigen, wie hier mit Gentamicin gezeigt.

Die konzentrationsabhängige Verzögerung des Beginns der Farbstoffumwandlung deutet auf eine Abnahme der Vitalität des Biofilms hin. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Stifte nicht gegen die Seiten der Vertiefungen zu stoßen.