Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, das dysfunktionale Pigmentepithel der Netzhaut (RPE) zu ersetzen, um eine mögliche Heilung für RPE-bedingte Krankheiten, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration, zu finden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im optometrischen Bereich zur zellbasierten Therapie und zur altersbedingten Makuladegeneration zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Transportmodalität für Zellersatzsubstrate oder Wirkstoffverabreichungsgeräte in den subretinalen Raum bereitstellen kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Vitrektomie und subretinale Chirurgie bei Kaninchen geben kann, kann sie auch an anderen Modellorganismen wie Schweinen, Affen oder Menschen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da nicht nur die intraokulare Chirurgie komplex ist, sondern auch das Personal, die Organisation und die Technologie für dieses Verfahren gut aufeinander abgestimmt sein müssen. Fabian Thieltges, Postdoktorand, und Ralf Brinken, OP-Pfleger, beide aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren der Instrumentenbeladung

Bestätigen Sie vor Beginn der Operation den entsprechenden Anästhesiegrad und tragen Sie Augensalbe auf das andere nicht operierte Auge des Tieres auf. Legen Sie dann das Kaninchen unter ein Operationsmikroskop auf der linken Seite, mit dem rechten Auge nach oben und der Nase durch eine Deckenfalte leicht erhöht. Desinfizieren Sie das Auge eine Minute lang mit ein paar Tropfen Povidon-Jod.

Spülen Sie dann das Auge mit sterilem BSS aus und bedecken Sie den Kopf des Tieres mit einem sterilen Tuch mit einer vorgeschnittenen Augenöffnung. Legen Sie ein 12 x 17 Zentimeter großes Stück klebriges chirurgisches Schnitttuch über das Auge und legen Sie das Auge mit einer Schere mit einem horizontalen Schnitt in der Mittellinie frei. Verschieben Sie das Auge mit umgekehrten Messschiebern in die protosierte Position und sichern Sie das Gewebe mit einer 3-0-Seidennaht.

Verwenden Sie dann eine Vannas-Schere, um die Bindehaut in der Nähe des Limbus zu schneiden, etwa einen Millimeter von den angrenzenden Blutgefäßen entfernt, und vergrößern Sie die Peritomie parallel zum Limbus. Trennen Sie die Bindehaut stumpf, gefolgt von einem senkrechten Schnitt von sechs bis sieben Millimetern, um ein "T" in der Bindehaut zu machen. Machen Sie eine weitere kleine Peritomie um die 2-Uhr-Position.

Führen Sie dann vorsichtig die Spitze einer 23-Gauge-Mikrovitreoretinalklinge durch die Sklera ein und zeigen Sie in Richtung des hinteren Pols des Auges in 3,5 Millimetern Entfernung vom Limbus in der 8-Uhr-Position. Um eine Vergrößerung des Schnitts zu vermeiden, ziehen Sie die Klinge langsam in die gleiche Richtung zurück und platzieren Sie eine 7-0 Vicryl-Naht. Führen Sie dann eine benutzerdefinierte Lateral-Port-Infusionskanüle in die Skleralöffnung ein und verwenden Sie die vorplatzierte Naht, um die Kanüle zu sichern.

Stellen Sie den Augeninnendruck auf 20 bis 24 Millimeter Quecksilbersäule ein. Verwenden Sie dann einen 25-Gauge-Trokar mit flachem Kopf, um die Sklera bei 2 Uhr zu durchstechen, und führen Sie eine 25-Gauge-Kronleuchterleuchte in den Anschluss ein. Sichern Sie das Licht mit Klebeband und stellen Sie es auf etwa 30 % Leistung ein, dann individuell anpassen.

Verwenden Sie ein 20er Skalpell, um das ödematöse Hornhautepithel zu entfernen, um eine bessere intraokulare Visualisierung zu ermöglichen. Führen Sie nun bei 10 Uhr eine weitere Sklerotomie mit der 23-Gauge-Mikrovitreoretinalen Klinge durch und legen Sie eine U-förmige 7-0 Vicryl-Naht um die eingeschnittene Sklera, ohne den Knoten vollständig zu binden. Führen Sie die Spitze eines Hochgeschwindigkeits-Vitrektors in den Schnitt ein und beginnen Sie mit der Vitrektomie um die Eintrittsöffnung.

Schneiden Sie den Glaskörper mit maximal 2.000 bis 3.000 Schnitten pro Minute in kleine Stücke, setzen Sie die Vitrektomie über der Sehscheibe und den Fibrae medullares fort und aspirieren Sie mit maximal 200 Millimeter Quecksilber. Um den Glaskörper sanft von der Netzhaut zu trennen, halten Sie den Vitrektor über den hinteren Pol und den unteren Rand der Bandscheibe und saugen Sie ohne Schnitt weiter. Wenn die hintere Glaskörperablösung abgeschlossen ist, werden intravitreal etwa 50 Mikroliter der interessierenden Verbindung injiziert, um den schwebenden Glaskörper während seiner nahezu vollständigen Entfernung sichtbar zu machen.

Wenn das Auge vorbereitet wurde, spülen Sie die Implantationszellkultur dreimal mit nicht supplementiertem BSS in ophthalmischer Qualität. Füllen Sie anschließend eine 100 x 20 Millimeter große Zellkulturschale mit 10 Millilitern ophthalmischem BSS und geben Sie den Zellkultureinsatz in die Schale. Zentrieren Sie die Schale unter einem Lichtmikroskop und stanzen Sie mit einer scharfen, ovalen, speziell angefertigten Hohlnadel ein flaches, bohnenförmiges Substrat von 2,4 x 1,1 Millimetern mit zwei langen und zwei runden Kanten aus der Zellkultur.

Fluten Sie die Nadel vorsichtig durch den zweiten Port mit BSS, um das Implantat in die mit BSS gefüllte Zellkulturschale zu spülen. Um eine dritte Kante zu erhalten, machen Sie einen 0,5-Milliliter-Schnitt in eines der runden Enden des Implantats und verwenden Sie eine 23-Gauge-Membranschälzange, um das Implantat in die maßgefertigte Ladestation zu überführen. Stellen Sie sicher, dass sich das Implantat in der aufrechten Position befindet, schieben Sie das Implantat dann mit der Pinzette vorsichtig vollständig in das Shooter-Instrument, bis das gesamte Gewebe in der Spitze gesichert ist, und platzieren Sie die Shooter-Spitze in der Ladestation unter BSS, bis die Zellen implantiert sind.

Um die Implantation der Zellen unter der Netzhaut zu ermöglichen, nähern Sie sich der neuralen Netzhaut mit einer ausziehbaren subretinalen 41-Gauge-Injektionsnadel, die mit einer gasdichten Spritze verbunden ist, und injizieren Sie subretinal BSS, um eine Bläschennetzhautablösung zu erzeugen. Wenn die Blase einen Durchmesser von etwa 2 bis 3 Scheiben hat, vergrößern Sie die Retiotomie mit einer vertikalen 23-Gauge-VR-Schere auf 1,5 Millimeter und mit einem 1,4-Millimeter-Schnittmesser die 10-Uhr-Sklerotomie präzise auf einen 20-Gauge-Zugang. Versuchen Sie als nächstes, eine 20-Kaliber-Schützenpuppe durch die Sklerotomie zu führen und den Schnitt nach Bedarf zu vergrößern, um einen reibungslosen, aber festen Übergang des geladenen Schützen zu gewährleisten.

Führen Sie dann den geladenen Shooter durch den Skleraschnitt bei 20 bis 24 Millimeter Quecksilber bis zum Retinotomienrand und injizieren Sie das Implantat subretinal aus einer epiretinalen Position. Der Schütze sollte beim ersten Versuch schnell durch die Sklerotomie wechseln, um eine Sklerotomie in optimaler Größe zu gewährleisten. Die RPE-Zellen sollten dann in einem flachen Winkel subretinal implantiert werden, um ein Einklemmen der Implantatvorderkante an der Bruch-Membran zu vermeiden.

Stellen Sie das Implantat so ein, dass es unter der Netzhaut einigermaßen weit von der Retinotomie entfernt platziert wird. Entfernen Sie dann den Port aus der Sklerotomie und injizieren Sie 25 Mikroliter Triamcinolon durch den Kronleuchteranschluss. Schließen Sie die 2- und 10-Uhr-Sklerotomien mit 7-0-Nähten und prüfen Sie, ob sie undicht sind.

Entfernen Sie die Infusionskanüle und verschließen Sie die letzte Sklerotomie sofort mit der vorgesetzten 7-0 Vicryl-Naht. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel BSS, um den Augeninnendruck während des Abtastens nach Bedarf anzupassen. Zum Schluss vernähen Sie die Bindehaut mit 7-0 Vicryl und entfernen die Proptosingseide, wobei Sie darauf achten, dass der tiefe orbitale Venenplexus vermieden wird.

Die Transplantation unter der Netzhaut hat eine chirurgische Erfolgsrate von ca. 60 %, wenn eine Kernvitrektomie durchgeführt wird, die auf über 75 % ansteigt, wenn eine hintere Glaskörperablösung induziert wird. Hier wird ein Scanning-Laser-Ophthalmoskop-Infrarot-Reflexionsbild von xenotransplantierten kultivierten retinalen Pigmentepithelien auf einer Polyestermembran nach einem unkomplizierten Verfahren gezeigt, wobei die aus der Immunreaktion resultierende Photorezeptoratrophie als Halo um das Implantat herum erscheint. In diesem entsprechenden Bild der optischen Kohärenztomographie im Spektralbereich ist eine Ausdünnung der äußeren Kernschicht als Reaktion auf die Xenotransplantation von RPE zu beobachten, hauptsächlich in der Netzhaut mit einem sichtbaren hyperreflektierenden Band über dem Implantat.

Die an das Implantat angrenzende neurale Netzhaut weist jedoch nahezu normale Reflexionsbänder auf, was auf eine atraumatische Verabreichung des Implantats hindeutet. Wie bei der H/E-Färbung beobachtet, treten bei xenotransplantierten, nicht immunsupprimierten Kaninchen subretinale Narbenbildung und Atrophie der äußeren Kernschicht auf. Die Bruch-Membran unter dem Implantat scheint ebenfalls zusammenhängend zu sein, wobei die Choriokapillaris einige verstreute Erythrozyten enthält, was das Fehlen eines Traumas während der Implantateinführung weiter bestätigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde abgeschlossen werden, wenn keine Komplikationen auftreten. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, eine Netzhautblase und eine Retiotomie zu erstellen, die gerade groß genug sind, um auf das Implantat zu passen. Außerdem führt ein schnellerer chirurgischer Eingriff in der Regel zu besseren Ergebnissen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die optische Kohärenztomographie oder die Histologie eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den Erfolg der Transplantation, die subretinale Biokompatibilität und das Überleben der transplantierten Zellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Stammzellbiologie und Biomaterialien, um die subretinale Verabreichung von Stammzellderivaten und/oder biofunktionalisierten Trägersubstraten für Netzhauterkrankungen, insbesondere das RPE, zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Vitrektomie und subretinale Implantation bei Kaninchen durchführt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit der Schnittstelle zwischen Linse, vitreoretinalen und subretinalen Schnittstellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die richtige Positionierung der Hände, eine gute Visualisierung und ein stabiler Augeninnendruck.