Name: Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Lernen Sie die effiziente Nukleinsäure-Extraktion aus Abstrichen zur Charakterisierung bakterieller Gemeinschaften mittels 16S rRNA Gen-Sequenzierung. Diese Methode liefert hochwertige DNA und RNA für mikrobiologische Analysen.

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Wir möchten, dass Elizabeth Byrne, David Gootenberg und Christina Gosmann für kritisches Feedback über das Protokoll zu danken; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco und Jason Norman für die Probenvorbereitung Führung und Demonstrationen; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower Skip Virgin und Bruce Walker für die Protokoll-Rat und fruchtbare Diskussionen; und Jessica Hoisington-Lopez für die Sequenzierung Unterstützung. Die Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation, und die NIAID (1R01AI111918) nicht unterstützt. DSK erhielt zusätzliche Unterstützung vom Burroughs Wellcome Fund. MNA wurde von Verleihungsnummer T32GM007753 vom NIGMS, und der Paul und Daisy Soros Fellowship unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der NIGMS oder die NIH.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Identifizierung und Charakterisierung der relativen bakteriellen Häufigkeiten innerhalb eines menschlichen vaginaler Abstrich. Dieses Protokoll kann leicht für andere Probentypen, wie Stuhl und Tupfer anderer Körperstellen angepaßt werden, und für Proben aus einer Vielzahl von Quellen gesammelt. Die Extraktion von Nukleinsäure von sicken Schlagen in einer gepufferten Lösung von Phenol und Chloroform ermöglicht die Isolierung von sowohl DNA als auch RNA, die besonders wichtig ist, wenn sie mit wertvollen Proben gesammelt durch klinische Studien zu arbeiten. Die isolierte bakterielle DNA eignet sich hervorragend für bakterielle taxonomische Identifizierung und genomische Montage, während die gleichzeitige Sammlung von RNA die Möglichkeit bietet, funktionelle bakterielle Wirt und Virus-Beiträge durch RNA-seq zu bestimmen. Das beschriebene Protokoll basiert auf einer validierten Ein-Schritt - Primer - Set , das auf einer Vielzahl von Probenarten erfolgreich eingesetzt wurde, einschließlich Mensch, Hund und Umweltproben 10 </sup&gt;. Die Verfügbarkeit von Tausenden von barcodierte Primer ermöglicht Multiplexing von Proben und enorme Einsparungen bei den Sequenzierungskosten. Der komplette Kosten (einschließlich aller Reagenzien, einer einzigen Sequenzierungslauf und Primer aber nicht Ausrüstung) ist etwa 20 $ pro Probe bei 200 Proben gemultiplext werden. Zusätzlich gibt es eine sehr hohe Reproduzierbarkeit wenn mehrere Tupfer aus der gleichen Probenstelle unabhängig durch die gesamte Pipeline verarbeitet werden. Insgesamt ist das Protokoll, kosteneffizient, flexibel, zuverlässig und wiederholbar. Die Nukleinsäureextraktion Teil dieses Protokolls wird durch die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen begrenzt, wenn mit Phenol und Chloroform zu arbeiten, und die Herausforderungen, die Pipeline zu einem hohen Durchsatz zu automatisieren, 96-Well-Plattenformat. Zusätzlich wird die kräftige Wulst Schläge für die mechanische Lyse Schere die bakterielle DNA auf ca. 6 kb Fragmente verwendet; wenn längere DNA-Fragmente werden für Downstream-Anwendungen erforderlich, die Dauer der Wulst Schlagen should verkürzt werden. Die Beschränkungen des Bakterienidentifizierungs Teil dieses Protokolls sind inhärent für jede Methode, die auf 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung beruht. 16S-rRNA-Sequenzierung ist für die Identifizierung von Bakterien, die zur Gattung und sogar Artniveau ideal, aber nur selten bietet Verformungspegel Identifikation. Während die V4 variable Region der 16S - rRNA - Gen unter den meisten Bakterienarten 11, zusätzliche Rechenverfahren wie Oligotyping 31 robust Diskriminierungs bietet müssen genau verwendet werden , um bestimmte Arten, wie Lactobacillus crispatus identifizieren. Schließlich Informationen über die genaue bakterielle funktionellen Fähigkeiten in einer bestimmten Probe kann nicht allein durch die 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bestimmt werden, obwohl dieses Protokoll Extraktion von whole genome DNA und RNA ermöglicht, die zu diesem Zweck verwendet werden können. Der kritischste Schritt zur Gewährleistung Erfolg mit diesem Protokoll wird unter großer Sorgfalt Kontamination zu verhindern during Probensammlung, Nukleinsäure-Extraktion und PCR-Amplifikation. Stellen Sie sicher, Sterilität zum Zeitpunkt der Probenentnahme durch saubere Handschuhe tragen und mit sterilen Tupfern, Röhren und Schere. Um eine Kontamination der Sammlung Materialien beurteilen zu können, sammeln negative Kontrolltupfer, indem zusätzliche nicht verwendeten Tupfer direkt in Transportröhren zum Zeitpunkt der Probenahme. Im Labor führen alle Vorverstärkung Schritte in einem sterilisierten Haube nur dekontaminiert liefert und nur mit molekularen, DNA-freie Reagenzien enthält. Während die Nukleinsäureextraktion, verhindern eine Kreuzkontamination durch den Einsatz neuer sterilen Pinzette und frische Handschuhe mit jeder Probe, und halten Sie alle Rohre, es sei denn im Gebrauch geschlossen. Die Verarbeitung nicht verwendeten Tupfer parallel sorgt für Sterilität sowohl der Probensammlung und Nukleinsäure-Extraktion; die nicht verwendeten Tupfer sollte nicht ein Pellet nach Isopropanol-Fällung und Ethanol Waschen erhalten. Wenn ein Pellet angezeigt wird, führen 16S-rRNA-Gen-Amplifikation eine mögliche Quelle zu bestimmen,die Verunreinigung (zB würde das Vorhandensein von Streptococcus oder Staphylococcus Kontamination der Haut zeigen). Zusätzlich führen PCR Amplifikationen ohne Templat Kontrollreaktionen in parallel, um sicherzustellen, dass die PCR-Reagenzien und Reaktionen sind nicht kontaminiert worden ist. Wenn ein Band in einem keine Vorlage Steuerung angezeigt wird, um die Reagenzien zu verwerfen und die Amplifikation mit frischen Reagenzien wiederholen. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden erfolgreiche Sequenzierung der Bakterien Interesse sicherzustellen. Die PCR-Amplifikation Schritt neigt dazu, die meisten Problembehandlung erfordern. Amplifizierung in Gruppen von zwölf Proben stellt ein Gleichgewicht zwischen Effizienz und Konsistenz. Das vollständige Fehlen von Banden in allen Proben in einem bestimmten Verstärkung Satz deutet auf eine systematische Versagen, zum Beispiel vergessen , ein Reagens hinzuzufügen oder falsch den Thermocycler Programmierung. Das Fehlen einer Bande von einigen Proben ist in der Regel aufgrund von menschlichem Versagen und die Amplifikationen erneut r sollteun mit der gleichen Paarung von Probe und Reverse-Primer. Im Fall einer fortgesetzten Abwesenheit eines Bandes kann die Probe mit einem anderen Strichcode unter Verwendung eines reversen Primers erneut amplifiziert werden. Wiederholter Ausfall der PCR mit mehreren Reverse-Primer können einen Inhibitor in der Probe vorhanden zeigen. Inhibitoren entfernen, ohne signifikant zu verändern relativen Abundanzen bakteriellen In diesem Fall wird häufig die DNA mit einer Säule gereinigt wird. Wenn mehrere Bänder nach einer Verstärkung führen, wieder verstärken, um die Probe mit einem anderen Reverse-Primer-Barcode. Zusätzlich zu einer Kontamination der Umwelt zu verhindern und sicherzustellen, Amplifikation eines einzelnen spezifischen Produkt, erfolgreiche Sequenzierung beruht auf Pflege, wenn die Bibliothek Pool vorbereitet. Das Ziel ist, äquimolare Mengen von jeder Probe des Amplicons zu kombinieren etwa die gleiche Anzahl von Sequenzierungs sicherzustellen pro Abtastwert liest. Wenn die Nukleinsäure-Konzentrationen vor der Verstärkung vergleichbar sind, das Hinzufügen einfach gleichen Volumina jeder sample des Amplikons ist ausreichend, wenn die Bibliothek Pool zu schaffen. Jedoch, wenn die Nukleinsäurekonzentrationen erheblich unterschiedlich sind und in gleichem Volumen, wobei die Probe mit der geringen Nukleinsäurekonzentration wird schlecht mit einer geringen Anzahl von Lesevorgängen dargestellt zugesetzt. In diesem Fall ist es möglich, ein höheres Volumen der Amplikons von der Niedrigkonzentrationsprobe von der relativen Intensität der Gel-Bande basierend hinzuzufügen. Alternativ ist es möglich, rigoroser Primern aus den einzelnen Amplifikaten entfernen, quantifizieren die einzelnen Proben Amplicon-Konzentration einen fluorimetrischen Quantifizierung dsDNA-Kit und genau äquimolaren Mengen jeder Probe kombinieren. Sobald ein ausgewogenes Amplicon-Pool generiert wird, wird es von entscheidender Bedeutung, um sorgfältig die Konzentration des Pool messen. Im Anschluss vorsichtig Verdünnung und Spike-in mit PhiX erhöhen die Lese Komplexität für das Erreichen optimaler Sequenzierungsergebnisse kritisch ist. Hochdurchsatz-Sequenzern, die Sequen verwendencing durch Synthese sind in den Cluster-Dichte auf der Durchflusszelle sehr empfindlich. Laden einer Bibliothek Pool, der auch konzentriert in overclustering, mit geringerer Qualität Partituren, geringere Datenausgabe und ungenau Demultiplexen 32 führen wird. Laden eines Bibliothek-Pool, der auch bei niedrigen Datenausgang führt zu verdünnt wird. die Bibliothek Pool vor der Sequenzierung sorgfältig Quantifizierung werden optimale Ergebnisse zu gewährleisten. 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bietet eine umfassende Beurteilung der vorhandenen Bakterien innerhalb einer gegebenen Probe und ist ein absolut entscheidender erster Schritt in Hypothesengenerierung. Das Vorhandensein einer umfangreichen Satz von Metadaten ermöglicht weiterhin die Forscher Assoziationen zwischen bestimmten Bakterienarten zu testen und wichtige biologische Faktoren. Darüber hinaus kann die gleiche 16S - Informationen verwendet werden , um die bakterielle Funktionen mit Werkzeugen ableiten wie PICRUSt 33. Oberstes Ziel ist es 16S Charakterisierung verwenden neue Assoziationen zu identifizieren, die sein könnenweiter getestet und in Modellsystemen validiert, zusätzlich zu unserem wachsenden Verständnis der Auswirkungen der bakteriellen microbiome auf die menschliche Gesundheit und Krankheiten.

Der menschliche unteren Reproduktionstrakts, des gastrointestinalen Systems, des Atmungstrakts und der Haut werden durch komplexe Bakteriengemeinschaften besiedelt , die für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und Unterstützung der Gesundheit des Wirtes 1 entscheidend sind. Zum Beispiel eine unwirtliche Umgebung für Pathogene bestimmte Laktobazillen erstellen , indem Sie das Scheidengewölbe Versauerung, die Herstellung von antimikrobiellen Effektoren und Modulation lokalen Host Immunität 2-4. Die wachsende Wertschätzung für die Bedeutung der bakteriellen microbiome hat auch Interesse erhöht bei der Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften in vielen klinischen Kontexten. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Zusammensetzung der bakteriellen microbiome aus Genitalabstrichen zu bestimmen. Das Protokoll kann leicht für Hocker und Tupferproben aus anderen anatomischen Stellen und anderen Wirtsarten gesammelt modifiziert werden. Aufgrund der inhärenten Einschränkungen bei der Anzahl der Proben, die von einem gegebenen Bolzen gesammelt und gespeichert werden können,y Teilnehmer wurde dieses Protokoll zu extrahieren , DNA, RNA, entworfen und möglicherweise sogar Protein aus einem einzigen Tupfer eine angepasste Phenol-Chloroform basierend sicken Schlagen Verfahren 5,6. Die Kombination der physikalischen Störung der bakteriellen Zellwände mit sicken Schlagen und chemische Störung mit Detergenzien ermöglicht eine schnelle Lyse von Gram-positive, Gram-negative und säurefeste Bakterien ohne zusätzliche enzymatische Verdauung Schritte. Um eine hohe Qualität RNA zu erhalten, wird empfohlen, trockenen Tupfer zu verwenden, die bei oder unter 4 ° gehalten wurden C unmittelbar nach der Entnahme und beim Transport in das Labor (falls zutreffend) und gespeicherte Langzeit bei -80 ° C. Um die bakterielle microbiome innerhalb einer gegebenen Probe zu bestimmen, ist dieses Verfahren nutzt 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierung, die derzeit die kostengünstigste Mittel zur umfassenden bakteriellen Taxonomie zuordnen und relative Quantifizierung durchzuführen. Alternative Verfahren umfassen qPCR gezielte 7, kundenspezifische microarrays 8 und Vollgenomsequenzierung 9. Das 16S-rRNA-Gen enthält neun hypervariablen Regionen, und es gibt keinen Konsens über die optimale V-Region in Bezug auf die für die vaginale microbiome Studien zu sequenzieren. Hier verwenden wir die 515F / 806R Primer - Set und bauen auf die Pipeline entworfen von Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. &#39;S 515F / 806R Primer - Set ermöglicht Multiplexing von Hunderten von Proben auf einer einzigen Sequenzierungslauf aufgrund der Verfügbarkeit von Tausenden von validierten barcodierte Primer und die Kompatibilität mit Illumina - Sequenzierung Plattformen. Im Gegensatz zu den 27F / 338R Primer Human Microbiome Projekt 13 gesetzt, 515F / 806R verstärkt auch Bifidobacteriaceae effektiv und damit fängt genau Gardnerella vaginalis, ein wichtiges Mitglied der vaginalen mikrobiellen Gemeinschaft in einigen Frauen. Alternativ ist seit Pyrosequenzierung der vaginalen Proben 14 und ein 515F / 926R Primerpaar ein 338F / 806R Primerpaar erfolgreich hat rece verwendetntly verfügbar werden für die nächste Generation - Sequenzierung 12. Schließlich bietet dieses Protokoll grundlegende Anweisungen 16S Amplikon - Analyse durchzuführen , die quantitativen Insights mit in Microbial Ecology (QIIME) Software - Paket 15. Die erfolgreiche Umsetzung der QIIME Befehle beschrieben hier ergibt sich eine Tabelle für jede Probe Bakterien taxonomischen Abundanzen enthält. Viele zusätzliche Qualitätskontrollschritte, taxonomische Klassifizierung Methoden und Analyseschritte können in die Analyse einbezogen werden, wie es im Detail auf der QIIME Website beschrieben (http://qiime.org/index.html). Wenn die Analyse auf einem Apple - Computer ausgeführt werden, 16 das MacQIIME - Paket bietet eine einfache Installation von QIIME und ihre Abhängigkeiten. Alternative Software - Pakete für die 16S rRNA - Gen - Sequenzanalyse umfassen Mothur 17 und UPARSE 18.

<table><tbody><tr><td>Ausstattung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>PCR Workstation</td><td></td><td></td><td>Jede PCRHaube kann verwendet werden, z.B. die AirClean 600.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td>Es kann jeder Thermocycler mit beheiztem Deckel verwendet werden, z.B. MJ Research PTC-200.</td></tr><tr><td>Elektrophorese-System</td><td></td><td></td><td>Jedes Elektrophorese-System kann verwendet werden, z. B. das Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini-Gel-Elektrophorese-System.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Jede andere DNA-Quantifizierungsmethode ist ausreichend</td></tr><tr><td>Bioanalysator</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Eine Alternative ist das Agilent 2200 TapeStation Instrument. Nicht unbedingt notwendig, aber sehr hilfreich.</td></tr><tr><td>MiSeq oder HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td><>Materialien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catch-All Probenentnahme Tupfer</td><td>Epibio</td><td>QEC89100</td><td>Andere Tupfer können verwendet werden, aber der Catch-All-Tupfer wird vom Human Microbiome Project empfohlen.</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>SteriFlip 50 ml Filtrationsgerät (0,22 &Mikro; m)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mm Glasperlen</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Röhrchen mit Schraubverschluss</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td>Zum Beschlagen von Kügelchen</td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>Molekularbiologie Grad</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9856</td><td>Molekularbiologie Grad</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Grade Natriumdodecylsulfat, 20% Lösung</td><td>Fisher</td><td>BP1311-200</td><td>Molekularbiologie Grade</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Ambion</td><td>10977-015</td><td>Molecular Biology Grade, für die Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>2-Propanol BioReagenz, für die Molekularbiologie, &ge; 99,5%</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Qualität Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>Warnung: Giftig</td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat, pH 5,5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td><td>Molekularbiologie</td></tr> Qualität <tr><td>Einweg sterile Polystyrolzange, PS</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml, klar, PCR saubere Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>22364120</tr><tr><td>Wasser in PCR-Qualität</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>Für PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0,5 ml</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml PCR 8-Röhrchen mit angebrachten durchsichtigen flachen Kappen, natur</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>Alle 8-Röhrchen-Streifen, die frei von DNase-, RNase-, DNA- und PCR-Inhibitoren sind Arbeit</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Puffer</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Gel-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading Dye</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 bp GeneRuler Ladder</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>UltraClean PCR Clean-up Kit</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td>Eine Alternative ist Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F (vorderes Primer) 5'-AATGATACGGCGACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'Bestellung</td><td></td><td></td> <td>bei 100 nmole; Reinigung: Standard-Entsalzung. Resuspendieren bei 100 μM. **<stark>Kritisch: Primer müssen mit MoBio PCR Grade Water (siehe oben) in einer Haube resuspendiert werden, um eine Kontamination zu vermeiden.**</td></tr><tr><td>Reverse Primer, siehe Supplemental Code File und: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt</td><td>IDT wird empfohlen</td><td></td><td>Wenn Sie große Sätze von Primern bestellen, bestellen Sie sie als 96-Well-Platte im Maßstab von 100 nmol. Resuspendieren bei 100 μm. Vollständige Anweisungen für die Bestellung und Resuspension von Primern bei http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc.&nbsp; **<stark>Kritisch: Die Primer müssen mit MoBio PCR Grade Water (siehe oben) in einer Haube resuspendiert werden, um eine Kontamination zu vermeiden.**</strong</td></tr><tr><td>>Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGTG CCA GCM GCM GCC GCG GTA A-3'25</td><td></td><td></td> <td>nmole; Reinigung: Standard-Entsalzung. Resuspendieren bei 100 & micro;M.</td></tr><tr><td>Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'26</td><td></td><td></td> <td>nmole; Reinigung: Standard-Entsalzung. Resuspendieren bei 100 & micro;M.</td></tr><tr><td>Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3'27</td><td></td><td></td> <td>nmole; Reinigung: Standard-Entsalzung. Resuspendieren bei 100 & micro;M.</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Erforderlich, wenn die Sequenzierung intern durchgeführt wird. Wenn die Sequenzierung von einem Sequenzierungszentrum eines Drittanbieters durchgeführt wird, verfügt dieses bereits über PhiX.</td></tr></tbody></table>

effiziente nukleinsäure-extraktion und 16s rrna gen-sequenzierung für bakterielle gemeinschaft charakterisierung

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Es gibt eine wachsende Wertschätzung für die Rolle der mikrobiellen Lebensgemeinschaften als kritische Modulatoren der menschlichen Gesundheit und Krankheit. Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien für die schnelle und effiziente Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften verwenden 16S rRNA-Gen-Sequenzierung aus einer Vielzahl von Quellen erlaubt. Obwohl leicht verfügbaren Werkzeuge für die 16S rRNA-Analyse-Sequenz standardisierte Rechen Workflows haben, bleibt Probenverarbeitung zur DNA-Extraktion über Studien, die eine Fortsetzung Quelle der Variabilität. Hier beschreiben wir eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern extrahieren. Wir beschreiben auch Downstream-Methoden für 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung, einschließlich der Erzeugung von Sequenzierungsbibliotheken, Datenqualitätskontrolle und Sequenzanalyse. Die Workflow kann mehrere Proben-Typen, einschließlich Stuhl und Tupfer aus einer Vielzahl von anatomischen Stellen und Wirtsarten gesammelt zubringen. Zusätzlich gewonnene DNA und RNA abgetrennt und verwendet werden,für andere Anwendungen, einschließlich vollständige Genomsequenzierung oder RNA-Seq. Das beschriebene Verfahren erlaubt einen gemeinsamen Ansatz bei Verarbeitung für mehrere Probentypen und bietet Platz für Downstream-Analyse genomischer, Metagenom und Transkriptions Informationen.

<html> Die allgemeine Übersicht über das Protokoll, welches die Bestimmung der relativen Abundanzen bakteriellen aus einem Tupfer - Sequenzierung unter Verwendung 16S - rRNA - Gens, dargestellt in Figur 1 .Das Protokoll wurde optimiert für den menschlichen vaginale Abstriche, aber kann leicht angepasst für die meisten Schleimhautmessstellen ermöglicht und anderen Wirten. Abbildung 2 zeigt die hochwertige DNA und RNA, die die sickenschlag Protokoll isoliert werden können. 3 veranschaulicht eine erfolgreiche PCR - Amplifikation von 12 Proben, wobei jede Amplifikation mit einer Probe eine einzige starke Bande der korrekten ergab Größe und jedes Wasserkontrolle hat eine Band nicht ergeben. Abbildung 4 zeigt die Quantifizierung der endgültigen Bibliothek Pool vor der Sequenzierung. 5 zeigt eine typische Abfolge Qualitätsprofil nach einer Single-End 300 bp MiSeq laufen. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Übersicht des Protokolls. Zunächst wird Nukleinsäure aus einem Tupfer von Wulst-Schläge in einer gepufferten Lösung extrahiert , das Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol. Variable Region 4 des 16S-rRNA-Gen wird dann aus der erhaltenen Nukleinsäure unter Verwendung von PCR amplifiziert. PCR-Produkte von bis zu Hunderten von Proben werden dann kombiniert und auf einem einzigen Lauf sequenziert. Die resultierenden Sequenzen werden mit einer Referenzdatenbank abgeglichen relativen Abundanzen bakterielle zu bestimmen. Das gesamte Protokoll kann in etwa drei Tagen durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> Abbildung 2. Hochwertige Nukleinsäure Heraus Verwendung des Phenol: Chloroform Bead Beating Methode. (A) DNA - Qualität, wie ein Spektrophotometer verwendet wird . Ein A260 / A280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 zeigt an reine Nukleinsäure , die nicht mit Phenol oder Protein. (B) Nach einer Spalte Bereinigungs kontaminiert ist, kann dieses Protokoll qualitativ hochwertige RNA ergeben, angezeigt durch starke 16S und 23S - rRNA - Gipfel. (C) RNA - Abbau kann auftreten , wenn die Probe nicht kalt nach der Entnahme gehalten wird (während Transport und Lagerung) oder wenn RNasen während der Verarbeitung vorhanden sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bestätigung der erfolgreichen 16S - rRNA - Gene Amplifikation unter Verwendung der 515F und Barcodierte 806R Primer - Set. Top) Gel - Elektrophorese verwendet , um die Anwesenheit eines einzigen Band um 380 Basenpaare zu bestätigen in jede Probe, die mit Schablone amplifiziert. Das Fehlen einer Bande zeigt erfolglosen Verstärkung; dies ist in der Regel aufgrund von menschlichem Versagen und der PCR - Reaktion aus dieser Probe zu wiederholen. Unten) Kein Template (Wasser) Kontrollen in parallel mit dem gleichen Primerpaar laufen sollte kein Band vorhanden sind. Das Vorhandensein einer Bande in der Wasserkontrolle zeigt an kontaminierten Reagenzien; verwerfen die Reagenzien , die kontaminiert sein können und wieder tun , um die PCR - Amplifikationen sowohl der Vorlage und Wassersteuerung für das Primerpaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung der Schluß Bibliothek Pool Konzentration und Validierung der Bibliothek Größe. Nachdem die einzelnen Probe Amplikons Bündelung the Konzentration der fertigen Bibliothek Pool muss bestimmt werden. Die Bibliothek Pool muss dann weiterhin eine 2 nM Konzentration zu erreichen , verdünnt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Bar Plot der Sequenz Qualitätsfaktor bei jeder Position des Read. Es ist normal , dass die Sequenz Qualität nach 200 Basenpaare fallen zu lassen, aber die durchschnittliche Qualität der Gäste sollte über 30 bleiben <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen dieser Figur.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> Strichcode <br/&gt; Sequence </td><td colspan="3"> LinkerPrimer Sequenz </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> Extraktion Stapel </td><td> Verstärkung Teller </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> #an Beispiel Mapping-Datei finden Sie unter: http://qiime.org/_static/Examples/File_ Formate / Beispiel_ Kartierung_ file.txt </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td> zervikal Tupfer </td><td> 1 </td><td> EIN </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mapping Dateivorlage. Creating eine genaue und gründliche Mapping-Datei für die erfolgreiche kritisch das Protokoll ausführt. Die Mapping - Datei ist nicht nur für die Ausführung von QIIME erforderlich, aber es ermöglicht auch die Forscher den Zusammenhang zwischen der Probe Barcode und Metadaten zu halten, um die Daten für alle systematischer Fehler (zB Batch-to-Batch - Variation) zu analysieren und zu bestimmen , interessante Korrelationen zwischen den Metadaten und Bakterienpopulationen. Eine nackte Knochen-Mapping-Datei zur Verfügung gestellt, aber die Benutzer werden ermutigt, so viele Spalten wie möglich mit Metadaten hinzuzufügen. Beispiele für zusätzliche Metadaten für ein vaginaler Abstrich umfasst das Alter der Teilnehmer, Datum / Uhrzeit der Abstrichentnahme, Art hormonalen Kontrazeptivums (falls zutreffend), sexuell übertragene Infektion Testergebnisse, usw. <img alt="suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> Supplemental - Datei 1. Liste der Barcodierte Reverse Primer Sequenzen 10 </sup&gt;. Die ersten drei Spalten können verwendet werden , um die Mapping - Datei abgeschlossen ist , und die letzte Spalte stellt die gesamte Primer - Sequenz Zwecken für die Bestellung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige DNA und RNA aus Abstrichen zu isolieren und anschließend ihre bakterielle Zusammensetzung mittels 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung zu bestimmen. Diese Methode kann einem Forscher helfen, welche Bakterien in einer bestimmten menschlichen Probe enthalten sind, zu identifizieren und Zusammenhänge zwischen bestimmten Bakterien und Wirtseigenschaften oder Krankheitszuständen zu ermitteln. Obwohl dieses Verfahren entwickelt wurde, um Einblicke in menschliche vaginale bakterielle Gemeinschaften zu gewinnen, kann es auch zur Untersuchung bakterieller Gemeinschaften aus anderen Körperstellen wie den Nasenlöchern, dem Mund, der Haut und dem Rektum sowie von anderen Organismen angewendet werden.Beachten Sie, dass in diesem Video die schwierigeren Teile des Protokolls hervorgehoben werden und der Sequenzierungsteil bzw. die Sequenzierungsanalyse nicht behandelt werden. Brittany Bowman, eine Technikerin aus meinem Labor, wird die Durchführung demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit ektocervikalen Abstrichen, die wie in dem begleitenden Dokument beschrieben gesammelt und auf nassem Eis gelagert wurden.Zur Vorbereitung der Nukleinsäure-Extraktion säubern Sie alle Oberflächen des Sicherheitswerks und alle in das Sicherheitswerk eingebrachten Gegenstände zunächst mit Bleiche und anschließend mit einem Dekontaminierungsmittel, das RNasen, DNasen und DNA entfernt. Stellen Sie im Sicherheitswerk einen Bead-Breaking-Tube pro Probe bereit. Geben Sie in jeden Tube 500 Mikroliter NaCl-Tris-EDTA-Puffer, 210 Mikroliter 20 %iges SDS und 500 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol.Die sorgfältige Handhabung der Tupfer ist entscheidend, um mit diesem Protokoll klare Ergebnisse zu erzielen. Es erfordert etwas Übung, den Tupfer zu übertragen, ohne ihn fallen zu lassen, und es ist einfacher, wenn Sie einen hohlen Schafttupfer wie diesen verwenden. Übertragen Sie den Tupfer mit sterilen Pinzetten aus dem Transportröhrchen in das Bead-Breaking-Röhrchen.Reiben Sie den Tupfkopf mindestens 30 Sekunden lang gründlich an den inneren Wänden des Röhrchens. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Wechseln Sie dann die Handschuhe und wiederholen Sie den Abstrichvorgang mit der nächsten Probe.Nachdem alle Proben kräftig abgerieben wurden, lassen Sie sie mindestens 10 Minuten lang auf Eis abkühlen. Nach Ablauf von 10 Minuten greifen Sie den Stiel mit sterilen Pinzetten und drücken mit einer sauberen P200-Spitze den Kopf gegen die Innenseite der Röhrchenwand, um den Tupfer zu entnehmen. Dieser Vorgang löst Flüssigkeit aus dem Tupfer, wodurch die Gewinnung von Nukleinsäuren verbessert wird.Platzieren Sie das Kugelrührrohr in den Kugelzerreiber und homogenisieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie das Kugelrührrohr bei 6.000 ×g und vier Grad Celsius für drei Minuten, um den Zelltrümmerpellet zu sedimentieren und die wässrige und phenolische Phase zu trennen. Nach dem Zentrifugieren sind üblicherweise drei Phasen sichtbar.Die obere Schicht ist die wässrige Phase, die die DNA und RNA enthält. Die untere Schicht ist die organische Phase, die Lipide und Zelltrümmer aus den Zellen und Abstrichen enthält. Die dünne weiße mittlere Schicht, die als Interphase bezeichnet wird, enthält Protein. Überführen Sie die wässrige Phase, etwa 500 bis 600 Mikroliter, in ein steriles 1,5-Milliliter-Gefäß. Geben Sie ein äquivalentes Volumen an Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu. Mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen und kurzes Vortexen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang. Nach dem Zentrifugieren überführen Sie die wässrige Phase in ein neues steriles 1,5-ml-Röhrchen. Achten Sie darauf, keine Bestandteile aus der Interphase oder der darunterliegenden Phenolphase mitzuübertragen.Notieren Sie das übertragene Volumen und bewahren Sie die Phenolphase für die zukünftige Proteinisolierung auf. Geben Sie anschließend 0,8 Volumenprozent Isopropanol und 0,1 Volumenprozent dreifach molarer Natriumacetat hinzu. Mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen und kurzem Vortexen.Fällen Sie die Nukleinsäure, indem Sie das Gefäß mindestens zwei Stunden und bis zu über Nacht bei 20 Grad Celsius abkühlen. Nach der Fällung zentrifugieren Sie das Gefäß 30 Minuten lang. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig mit einer Pipette den Überstand, wobei das Pellet intakt bleibt.Fügen Sie 500 µL 100 % Ethanol hinzu. Lösen Sie das Pellet vorsichtig durch Vortexen oder Pipettieren, ohne das Pellet zu berühren. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang.Entfernen und verwerfen Sie mit einer P10-Pipette so viel Ethanol wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Trocknen Sie das Pellet 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Lösen Sie das Pellet in 20 µL UltraPure 0,1X-Tris-EDTA-Puffer auf.Lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis abkühlen und pipettieren Sie mehrfach, um eine vollständige Resuspension sicherzustellen. Messen Sie die Nukleinsäurekonzentration mithilfe eines Spektrophotometers. Falls gewünscht, trennen Sie DNA von RNA unter Verwendung eines Säulenaufreinigungs-Kits gemäß dem Herstellerprotokoll.Die PCR-Setup ist ein entscheidender Schritt in diesem Verfahren. Es ist sehr wichtig, Kontaminationen zu minimieren, indem die Sterilität der Reagenzien, der PCR-Werkbank und der Handschuhe sichergestellt wird. Arbeiten Sie schnell, aber sorgfältig, und verwenden Sie die richtige Technik, wenn Sie Gegenstände in die Werkbank hinein- und aus ihr herausbewegen.Stellen Sie einen sauberen Kühlbehälter für Mikrozentrifugenröhrchen und einen PCR-Plattenkühler in der Abzugshaube bereit. Beschriften Sie 8-Loch-Streifenröhrchen mit einzelnen Deckeln und stellen Sie sie in den PCR-Kühler. Die Amplifikation sollte im Dreifachansatz durchgeführt werden, und für jedes Primerpaar sollte eine Kontrolle ohne Template (Wasser) eingeschlossen werden.Stellen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Master-Mix-Lösung in den Kühlbehälter. Kombinieren Sie dann für jede Probe UltraPure-Wasser, 5X HF-Puffer, dNTPs, den 515F-Vorwärtsprimer und 3 % DMSO, wie in dem beigefügten Dokument beschrieben. Geben Sie anschließend die Polymerase zur Master-Mix-Lösung hinzu und mischen Sie diese durch Pipettieren.Zum ersten Well geben Sie 90 µL der Master-Mix und 2 µL des reversen Primers hinzu und mischen gründlich. Danach geben Sie in den vierten Well, der als Kontrolle ohne Template dient, 23 µL der Master-Mix und 2 µL Wasser hinzu und mischen. Als Nächstes geben Sie 6 µL der entsprechenden Probe in den ersten Well.Gründlich mischen und 25 Mikroliter in die zweite Vertiefung übertragen. Pipettenspitzen wechseln und anschließend weitere 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung in die dritte Vertiefung übertragen. Jede Vertiefung fest verschließen.Berühren Sie nicht die Innenseiten der Vertiefungen oder die Kappe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe. Nachdem alle Proben vorbereitet wurden, zentrifugieren Sie die Strip-Röhrchen kurz, überführen Sie sie in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus.Nach Beendigung des Laufs die Röhrchen kurz anschleudern, um die Flüssigkeit von den Wänden zu sammeln. Anschließend die dreifachen PCR-Ansätze jedes Probenmaterials auf einer sauberen Laborfläche in einem beschrifteten sterilen Mikrozentrifugenröhrchen zusammenführen. Jeweils 25 Mikroliter der No-Template-Kontrollen in ein separates steriles Röhrchen überführen.Amplicons aus verschiedenen Proben noch nicht kombinieren. Um eine erfolgreiche PCR-Amplifikation zu überprüfen, jeweils fünf Mikroliter jeder Probe auf ein 1,5 %iges Agarosegel laden und Elektrophorese bei 120 Volt für 30 bis 60 Minuten durchführen. Das Gel unter UV-Licht sichtbar machen.Überprüfen Sie die erfolgreiche Amplifikation jeder Probe, indem Sie eine einzelne starke Bande bei etwa 380 Basenpaaren feststellen. Falls eine Doppelbande sichtbar ist, amplifizieren Sie die Probe erneut mit einem anderen reversen Barcode. Falls keine Bande sichtbar ist, amplifizieren Sie die Probe erneut, wobei Sie entweder denselben reversen Barcode oder ein Primer mit einem neuen reversen Barcode verwenden.Falls eine erneute Amplifikation nicht erfolgreich ist, könnten PCR-Inhibitoren in der Probe vorhanden sein; führen Sie in diesem Fall eine säulengestützte DNA-Reinigung durch, um die PCR-Inhibitoren zu entfernen. Lagern Sie die verbleibenden 70 µL des Amplikons bei 20 °C. Entsorgen Sie die verbleibenden 20 µL der No-Template-Kontrolle, vorausgesetzt, sie hat kein Band ergeben.Um den Amplikon-Pool herzustellen, zwei bis fünf Mikroliter jedes Amplikons in einem einzigen sterilen Röhrchen kombinieren. Falls die Bande eines Probenmaterials schwach ist, die doppelte Menge im Vergleich zu den übrigen Proben hinzufügen. Anschließend die PCR-Primer mithilfe eines Kits entfernen.Falls zutreffend, die primerfreien Amplikon-Pools kombinieren, um die endgültige Bibliothek zu erzeugen. Die DNA-Konzentration der Bibliothek mittels eines Spektrophotometers oder eines fluorometrischen Systems bestimmen. Abschließend die Proben auf zwei Nanomolar verdünnen und zur Sequenzierung versenden.Detaillierte Informationen zur Sequenzanalyse sind im beigefügten Dokument enthalten. Es wurde hochwertige DNA und RNA isoliert, und die DNA wurde als Vorlage für die PCR-Amplifikation des V4-Bereichs des 16S-rRNA-Gens verwendet, wie in diesem Video beschrieben. Mithilfe der Gelelektrophorese wurde bestätigt, dass in jeder Probe, die mit Vorlage amplifiziert wurde, eine einzelne Bande von etwa 380 Basenpaaren vorhanden war.Die Kontrollen ohne Template, die parallel mit demselben Primer-Paar durchgeführt wurden, wiesen kein Band auf. Die PCR-Amplicons wurden anschließend in einem einzigen Reaktionsgefäß zusammengeführt, quantifiziert und vor der Sequenzierung weiter verdünnt. Hier gezeigt ist ein repräsentatives Balkendiagramm der Sequenzqualitätswerte an jeder Position des Reads.Es ist normal, dass die Sequenzqualität nach 200 Basenpaaren abnimmt. Der durchschnittliche Qualitätswert sollte jedoch über 30 liegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man DNA und RNA aus Abstrichen mittels einer auf Phenol-Chloroform basierenden Extraktion isoliert, die V4-Region des 16S-rRNA-Gens amplifiziert und eine Bibliothek für die Hochdurchsatzsequenzierung vorbereitet.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, größte Sorgfalt walten zu lassen, um Kontaminationen während der Probenentnahme, der Nukleinsäure-Extraktion und der PCR-Amplifikation zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Phenol-Chloroform äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer belüfteten Abzugshaube sowie das Tragen von undurchlässigen Handschuhen, Schutzbrille mit Seitenschutz und Laborkittel.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Ein Protokoll zur Quantifizierung von bakteriellen 16S rRNA-Genen und Transkripten aus Küstensedimenten mittels Echtzeit-PCR wird bereitgestellt. Die Methodik umfasst die Co-Extraktion von DNA und RNA; Herstellung von DNA-freier RNA; und Quantifizierung von 16S rRNA-Genen und -Transkripten mittels RT-q-PCR, einschließlich Standardkurvenkonstruktion.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine ​​aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Lernen Sie die effiziente Nukleinsäure-Extraktion aus Abstrichen zur Charakterisierung bakterieller Gemeinschaften mittels 16S rRNA Gen-Sequenzierung. Diese Methode liefert hochwertige DNA und RNA für mikrobiologische Analysen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

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