Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochwertige DNA und RNA aus Abstrichen zu isolieren und anschließend ihre bakterielle Zusammensetzung mittels 16S rRNA-Gensequenzierung zu bestimmen. Diese Methode kann einem Forscher helfen, zu identifizieren, welche Bakterien in einer bestimmten menschlichen Probe enthalten sind, und Assoziationen zwischen bestimmten Bakterien und Wirtsmerkmalen oder Krankheitsstatus zu bestimmen. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um Einblicke in menschliche vaginale Bakteriengemeinschaften zu geben, kann die Methode auch angewendet werden, um Bakteriengemeinschaften aus anderen Körperstellen wie Nasenlöchern, Mund, Haut und Rektum sowie von anderen Organismen zu untersuchen.

Beachten Sie, dass dieses Video die schwierigeren Teile des Protokolls hervorhebt und weder den Sequenzierungsteil noch die Sequenzierungsanalyse abdeckt. Brittany Bowman, eine Technikerin aus meinem Labor, wird es vorführen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit ektozervikalen Abstrichen, die wie im Begleitdokument beschrieben entnommen und auf nassem Eis gelagert werden.

Reinigen Sie zur Vorbereitung der Nukleinsäureextraktion alle Oberflächen der Haube und alle Gegenstände, die in die Haube eingebracht werden, mit Bleichmittel, gefolgt von einem Dekontaminationsmittel, das RNasen, DNasen und DNA entfernt. Setzen Sie ein Perlenperlenrohr pro Probe in die Haube ein. Geben Sie zu jedem Röhrchen 500 Mikroliter NaCl-Tris-EDTA-Puffer, 210 Mikroliter 20 % SDS und 500 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol

Ein sorgfältiger Umgang mit den Tupfern ist entscheidend, um mit diesem Protokoll klare Ergebnisse zu erzielen. Es braucht ein wenig Übung, um den Tupfer zu übertragen, ohne ihn fallen zu lassen, und es ist einfacher, wenn Sie einen Hohlschafttupfer wie diesen verwenden. Übertragen Sie den Tupfer mit einer sterilen Pinzette aus dem Transportfläschchen in das Bead-Bead-Röhrchen.

Reiben Sie den Tupferkopf mindestens 30 Sekunden lang gründlich gegen die Innenwände des Röhrchens. Lege das Rohr auf Eis. Wechseln Sie dann die Handschuhe und wiederholen Sie den Abstrichvorgang mit der nächsten Probe.

Nachdem alle Proben kräftig gerieben wurden, lassen Sie sie mindestens 10 Minuten lang auf Eis abkühlen. Nachdem 10 Minuten vergangen sind, um den Tupfer zu entfernen, halten Sie den Griff mit einer sterilen Pinzette fest und drücken Sie den Kopf mit einer sauberen P200-Spitze gegen die Innenseite der Röhrchenwand. Bei diesem Prozess wird Flüssigkeit aus dem Tupfer freigesetzt, wodurch die Nukleinsäurerückgewinnung erhöht wird.

Setzen Sie das Bead-Bead-Röhrchen in den Bead-Beader ein und homogenisieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann das Perlenperlenröhrchen drei Minuten lang bei 6.000 g und vier Grad Celsius, um die Rückstände zu pelletieren und die wässrige und die Phenolphase zu trennen. Nach dem Spin sind in der Regel drei Phasen zu sehen.

Die oberste Schicht ist die wässrige Phase, die die DNA und RNA enthält. Die untere Schicht ist die organische Phase, die Lipide und Ablagerungen aus den Zellen und Tupfern enthält. Die dünne weiße Mittelschicht, die sogenannte Interphase, enthält Proteine.

Die wässrige Phase, etwa 500 bis 600 Mikroliter, wird in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie die gleiche Menge Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzu. Mischen Sie durch Inversion und kurzes Vortexen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang. Nach dem Schleudern die wässrige Phase in ein neues steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, kein Material aus der Zwischenphase oder der darunter liegenden Phenolphase zu übertragen.

Notieren Sie sich das übertragene Volumen und bewahren Sie die Phenolphase für die zukünftige Proteinisolierung auf. Als nächstes fügen Sie 0,8 Volumen Isopropanol und 0,1 Volumen drei molare Natriumacetate hinzu. Durch Umkehren und kurzes Vortexen gründlich mischen.

Fältitieren Sie die Nukleinsäure, indem Sie das Röhrchen mindestens zwei Stunden lang und so lange wie über Nacht bei 20 Grad Celsius kühlen. Nach der Fällung zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang. Entfernen Sie nach dem Schleudern vorsichtig mit einer Pipette den Überstand und lassen Sie das Pellet intakt.

Fügen Sie 500 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu. Lösen Sie das Pellet durch sanftes Vortexen oder Pipettieren, ohne das Pellet zu berühren. Fünf Minuten zentrifugieren.

Entfernen und entsorgen Sie mit einer P10-Pipette so viel Ethanol wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Trocknen Sie das Pellet 15 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern UltraPure 0,1X-Tris-EDTA-Puffer.

Lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis abkühlen und pipettieren Sie sie wiederholt, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten. Messen Sie die Nukleinsäurekonzentration mit einem Spektralphotometer. Falls gewünscht, trennen Sie die DNA von der RNA mit einem Säulenreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Das PCR-Setup ist ein kritischer Schritt in diesem Verfahren. Es ist sehr wichtig, die Kontamination zu minimieren, indem die Sterilität der Reagenzien, der PCR-Haube und der Handschuhe sichergestellt wird. Arbeiten Sie schnell, aber vorsichtig und verwenden Sie die richtige Technik, wenn Sie Gegenstände in die Haube hinein- und herausbewegen.

Platzieren Sie ein sauberes Tischkühlergestell für Mikrozentrifugenröhrchen und einen PCR-Plattenkühler in der Haube. Beschriften Sie 8-Well-Streifenröhrchen mit einzelnen Kappen und legen Sie sie in den PCR-Kühler. Die Amplifikation sollte in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden, und für jedes Primerpaar sollte eine Wasserkontrolle ohne Template enthalten sein.

Legen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für den Mastermix in den Kühler. Kombinieren Sie dann für jede Probe Reinstwasser, 5X HF-Puffer, DNTPs, 515F Forward Primer und 3 % DMSO, wie im Begleitdokument beschrieben. Fügen Sie dann Polymerase zum Mastermix hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.

In die erste Vertiefung 90 Mikroliter des Mastermixes und zwei Mikroliter des Reverse-Primers geben, gut mischen. Geben Sie dann in die vierte Vertiefung, die als No-Template-Kontrolle dient, 23 Mikroliter des Masters und zwei Mikroliter Wasser und mischen Sie. Geben Sie anschließend sechs Mikroliter der entsprechenden Probe in die erste Vertiefung.

Gründlich mischen und 25 Mikroliter in die zweite Vertiefung geben. Wechseln Sie die Spitzen und übertragen Sie dann weitere 25 Mikroliter von der ersten Vertiefung in die dritte Vertiefung. Verschließen Sie jede Vertiefung fest.

Achten Sie darauf, dass Sie weder das Innere der Vertiefungen noch die Kappe berühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann für jede Probe. Sobald alle Proben vorbereitet sind, drehen Sie die Streifenröhrchen schnell, übertragen Sie sie in einen Thermocycler und führen Sie das Programm aus.

Nachdem der Lauf beendet ist, drehen Sie die Röhren schnell, um Flüssigkeit von den Wänden zu sammeln. Kombinieren Sie dann auf einem sauberen Labortisch die dreifachen PCR-Reaktionen aus jeder Probe in einem markierten sterilen Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie 25 Mikroliter von jedem ohne Template-Kontrolle in ein separates steriles Röhrchen.

Kombinieren Sie noch keine Amplikons aus verschiedenen Proben. Um eine erfolgreiche PCR-Amplifikation zu validieren, laden Sie fünf Mikroliter jeder Probe auf ein 1,5%-Agarosegel und führen Sie eine Elektrophorese bei 120 Volt für 30 bis 60 Minuten durch. Betrachten Sie das Gel unter UV-Licht.

Überprüfen Sie die erfolgreiche Amplifikation jeder Probe, indem Sie eine einzelne starke Bande um 380 Basenpaare notieren. Wenn eine Doppelbande vorhanden ist, verstärken Sie die Probe mit einem anderen umgekehrten Barcode. Wenn überhaupt keine Bande vorhanden ist, amplifizieren Sie die Probe entweder mit demselben Reverse-Barcode oder einem Primer mit einem neuen Reverse-Barcode

Wenn die erneute Amplifikation nicht erfolgreich ist, können PCR-Inhibitoren in der Probe vorhanden sein, in diesem Fall führen Sie eine säulenbasierte DNA-Reinigung durch, um PCR-Inhibitoren zu entfernen. Lagern Sie die restlichen 70 Mikroliter Amplikon bei 20 Grad Celsius. Verwerfen Sie die restlichen 20 Mikroliter der Kontrolle ohne Vorlage, vorausgesetzt, sie ergab keine Bande.

Um den Amplikon-Pool zu erstellen, kombinieren Sie zwei bis fünf Mikroliter jedes Amplikons in einem einzigen sterilen Röhrchen. Wenn die Bande eines Samples schwach ist, addieren Sie das doppelte Volumen im Verhältnis zum Rest der Samples. Entfernen Sie dann die PCR-Primer mit einem Kit.

Kombinieren Sie ggf. die primerfreien Amplikon-Pools, um die endgültige Bibliothek zu erstellen. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration der Bibliothek mit einem Spektralphotometer oder einem fluorometrischen System. Zum Schluss verdünnen Sie die Proben auf zwei Nanomolare und senden Sie sie zur Sequenzierung.

Detaillierte Informationen zur Sequenzanalyse finden Sie im Begleitdokument. Hochwertige DNA und RNA wurden isoliert und die DNA als Vorlage für die PCR-Amplifikation der Region des 16S rRNA-Gens V4 verwendet, wie in diesem Video beschrieben. Die Gelelektrophorese wurde verwendet, um das Vorhandensein einer einzelnen Bande mit etwa 380 Basenpaaren in jeder Probe zu bestätigen, die mit einem Template amplifiziert wurde.

Bei den Steuerelementen ohne Vorlage, die parallel mit demselben Primerpaar ausgeführt wurden, war keine Bande vorhanden. Die PCR-Amplikons wurden dann in einem einzigen Röhrchen kombiniert, quantifiziert und vor der Sequenzierung weiter verdünnt. Hier sehen Sie ein repräsentatives Balkendiagramm der Sequenzqualitätsbewertungen an jeder Position des Lesevorgangs.

Es ist normal, dass die Sequenzqualität nach 200 Basenpaaren abnimmt. Der durchschnittliche Qualitätsfaktor sollte jedoch über 30 bleiben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie DNA und RNA aus Tupfern mit einer Extraktion auf Phenolchloroform-Basis isolieren, die V4-Region des ribosomalen RNA-Gens 16SR amplifizieren und eine Bibliothek für die Hochdurchsatzsequenzierung vorbereiten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, große Sorgfalt walten zu lassen, um eine Kontamination während der Probenentnahme, der Nukleinsäureextraktion und der PCR-Amplifikation zu vermeiden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenolchloroform äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer belüfteten Haube und das Tragen von undurchlässigen Handschuhen, einer Schutzbrille mit Seitenschutz und einem Laborkittel getroffen werden sollten.