Name: Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Flockungsmittel zur effizienten Entfernung disperser Partikel aus Pflanzenextrakten bewerten. Diese Methode optimiert die Klärung und reduziert Prozesskosten erheblich.

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Ich möchte mich bei Dr. Thomas Rademacher für die Bereitstellung der transgenen Tabaksamen und bei Ibrahim Al Amedi für die Kultivierung der Tabakpflanzen bedanken. Ich danke Dr. Richard M. Twyman für die redaktionelle Unterstützung und Prof. Dr. Rainer Fischer für die fruchtbaren Gespräche. Diese Arbeit wurde teilweise gefördert durch den European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', Antragsnummer 269110, die Fraunhofer-Zukunftsstiftung und die Fraunhofer-Gesellschaft Interne Programme unter der Fördernummer 269110. Ziehen Sie 125-600164 an.

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Der Autor hat keinerlei Interessenkonflikte offen zu legen.

Der wichtigste Aspekt zu berücksichtigen , wenn eine DoE Einrichtung Partikel Flockung zu charakterisieren , ist , dass das Design grundsätzlich in der Lage sein müssen , um die zu erwartenden oder möglichen Auswirkungen 36,38, zB der Einfluss von pH - Wert, Polymertyp und Polymerkonzentration 16 erfassen und zu beschreiben. Daher ist es wichtig, den Anteil des Bauraums (FDS) vor Beginn der eigentlichen Experimente zu bewerten. Die FDS ist der Anteil des mehrdimensionalen Versuchsraum (abg...

Pflanzen sind weit verbreitet zu produzieren Nahrungsmittelrohstoffe wie Fruchtsäfte verwendet, aber sie können auch als Plattform für die Herstellung von höherwertigen biopharmazeutischen Produkten 1-3 entwickelt werden. In beiden Fällen wird der Weiterverarbeitung (DSP) beginnt häufig mit der Entnahme von Flüssigkeiten aus dem Gewebe wie Blätter oder Früchte, gefolgt von der Klärung der partikelbeladenen Extrakte 4,5. Für die Herstellung von Biopharmazeutika, können die Kosten für die DSP machen bis zu 80% der gesamten Produktionskosten 6,7 und dies spiegelt teilweise die hohe Partikelbelastung in Extrakten durch disruptive Methoden wie Blade-basierte Homogenisierung hergestellt 8,9 . Obwohl die rationale Auswahl der Filterschichten kann die Partikelgrößenverteilung in dem Extrakt auf Filterkapazität zu erhöhen und die Kosten 10,11 reduzieren, kann die Verbesserung nicht durch die Anzahl von Partikeln definiert , die Obergrenze der absolute Kapazität überschreiten , die pro aufbewahrt werden müssenEinheit Filterfläche Klärung zu erreichen. Die Decke kann aufgehoben werden , wenn weniger Partikel die Oberfläche der feinsten Filter in der Filterstrang gelangen, und dies kann , wenn dispergierte Teilchen vermischt sind mit Polymeren als Flockungsmittel bekannt , erreicht werden, die die Aggregation fördern 12 große Flocken zu bilden. Solche Flocken können weiter stromaufwärts durch gröbere und weniger teuer Beutelfilter zurückgehalten werden, um die Partikelbelastung Verringerung der feineren erreichen und teurer Tiefenfilter. Die Polymere müssen Sicherheitsprofile haben für ihre Anwendungen, zB für Biopharmazeutika sie mit der guten Herstellungspraxis (GMP) entsprechen müssen, und in der Regel müssen sie eine Molmasse&gt; 100 kDa haben und entweder neutral oder 13 aufgeladen werden kann. Während neutral Flockungsmittel deren Aggregation und die Bildung von Flocken mit einem Durchmesser handeln , im allgemeinen durch Vernetzung dispergierten Teilchen verursacht&gt; 1 mm 11, neutralisieren geladene Polymere die Ladung von dispersed Partikel, wodurch ihre Löslichkeit und damit verursachenden Niederschläge 14. Flockung kann durch Einstellen Parameter wie pH oder Leitfähigkeit und der Polymertyp oder der Konzentration verbessert werden, 15,16 , die Eigenschaften des Extrakts zu entsprechen. Tabakextrakte vorbehandelt mit 0,5-5,0 g L -1 Polyethylenimin (PEI), eine mehr als 2-fache Erhöhung der Tiefenfilterkapazität wurde in einer 100-L Pilotmaßstab Prozess berichtet. Die Kosten für dieses Polymers weniger als 10 € kg -1 , so dass ihre Einführung in den Prozess zu Kosteneinsparungen geführt von ca. 6.000 € für Filter und Verbrauchsmaterialien pro Charge 16 oder sogar noch mehr , wenn sie mit Cellulosebasis Filterhilfsmittel 17 kombiniert. Trotzdem sind Vorhersagemodelle erforderlich , um die a priori wirtschaftlichen Nutzen von Flockungsmitteln zu bewerten , da die Einbeziehung halten Schritten von 15-30 min 16,18 erfordern kann, was zu einer weiteren Investitionskosten für die LagerungPanzer. Es gibt jedoch noch keine mechanistische Modelle zur Verfügung, um das Ergebnis dieser Experimente aufgrund der komplexen Natur der Flockung vorhersagen kann. Daher ist ein geeignetes Design-of-Experiments (DoE) Ansatz 19 wurde wie in diesem Artikel beschrieben entwickelt. Ein Protokoll für die allgemeine DoE Verfahren wurde kürzlich 20 veröffentlicht. Kleines Geräte sind ab sofort verfügbar für das Hochdurchsatz - Screening von Flockungsbedingungen 21. Jedoch können diese Vorrichtungen nicht realistisch Bedingungen während der Ausflockung von Pflanzen simulieren extrahiert, da die Abmessungen des Reaktionsgefäßes (~ 7 mm für die Vertiefungen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen) und die Partikel oder Flocken kann weniger als eine Größenordnung auseinander. Dies kann Mischmuster beeinflussen und damit die Vorhersagekraft des Modells. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Prozesse zu verringern Präzipitation denen aufgrund nicht-linearen Änderungen des Mischungsverhalten und Präzipitat stabilität 22. Daher beschreibt dieser Artikel eine Bank-top-Skala - Screening - System mit einem Durchsatz von 50 bis 75 Proben pro Tag, Ergebnisse liefert , die von der anfänglichen 20 ml Reaktionsvolumen auf einer 100 l - Pilotmaßstab Prozess 16 skalierbar sind. Wenn es mit einem DoE Ansatz kombiniert, ermöglicht dies die Vorhersagemodelle für die Prozessoptimierung und Dokumentation im Rahmen eines Qualitäts-by-Design-Konzept verwendet werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren kann auch auf Biopharmazeutika angepasst werden produziert in der Zellkultur-basierten Verfahren, bei denen Flockungsmittel auch als kostensparende Werkzeug 23 in Betracht gezogen werden. Es kann auch die Ausfällung von Zielproteinen aus einem Rohextrakt zu modellieren als Teil eines Reinigungsstrategie verwendet werden, wie für die β-Glucuronidase in Raps, Mais und Soja 24,25 hergestellt demonstriert. Eine detaillierte Beschreibung der Flockungsmittel Eigenschaften können an anderer Stelle werden 16,26 und es ist wichtig , um sicherzustellen , dass das Polymer Konzentr gefundentionen sind entweder nicht-toxische oder unter schädlichen Mengen im Endprodukt 11.

<table><tbody><tr><td>2100P Tragbares Trübungsmessgerät</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>Trübungsmessgerät</td></tr><tr><td>2G12 Antikörper</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Referenzantikörper</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>SPR-Gerät</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Beutelfilter</td></tr><tr><td>Catiofast VSH</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Flockungsmittel</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Reaktionsröhrchen</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 ml freistehend</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Reaktionsröhrchen</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>Flockungsmittel</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>Software</td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp; 4984.3&nbsp;</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Dünger</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT Gefrierschrank</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Gefrierschrank</td></tr><tr><td>Gewächshaus</td><td>n.a.n.a.Für</td><td></td> <td>die Pflanzenzucht</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Rockwool Block</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>Tiefenfilterschicht</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Tiefenfilterschicht</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>Filtertuch</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020 pH-Messgerät</td><td>/ Leitfähigkeitsmessgerät</td></tr><tr><td>Osram kaltweiß 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Lichtquelle</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.v.Für</td> <td>den Pflanzenbau</td></tr><tr><td>Polymin P</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Flockungsmittel</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>Kinematica</td><td>11010110</td><td>Homogenisierungsgerät mit speziellem Klingenwerkzeug</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Life technologies</td><td>10-1006</td><td>Antikörper-bindendes Protein</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Fluoreszenzplatten-Reader</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Filtergehäuse</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS Messung der Partikelgrößenverteilung</td></tr></tbody></table>

vorgehensweise um die effizienz von flockungsmittel für die beseitigung von dispersed partikel aus pflanzenextrakten zur bewertung

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Pflanzen sind für den Menschen nicht nur wichtig, weil sie Rohstoffe wie Nahrung, Futtermittel und Rohstoffe liefern, sondern zunehmend, weil sie als Produktionsplattformen für Mehrwertprodukte wie Biopharmazeutika verwendet werden können. In beiden Fällen müssen unter Umständen flüssige Pflanzenextrakte geklärt werden, um Partikel zu entfernen. Eine optimale Klärung reduziert die Kosten für Filtration und Zentrifugation durch Erhöhung der Kapazität und Langlebigkeit. Dies kann durch die Einführung von geladenen Polymeren, den sogenannten Flockungsmitteln, erreicht werden, die dispergierte Partikel vernetzen, um die Fest-Flüssig-Trennung zu erleichtern. Für komplexe Mischungen wie Pflanzenextrakte gibt es keine mechanistischen Flockungsmodelle, daher werden stattdessen empirische Modelle verwendet. Hier wird ein Design-of-Experiments-Verfahren beschrieben, das ein schnelles Screening verschiedener Flockungsmittel ermöglicht, die Klärung von Pflanzenextrakten optimiert und die Trübungen deutlich reduziert. Die daraus resultierenden Vorhersagemodelle ermöglichen die Identifizierung robuster Prozessbedingungen und Sätze von Polymeren mit komplementären Eigenschaften, z.B. effektive Flockung in Extrakten mit spezifischen Leitfähigkeiten. Die vorgestellten Ergebnisse für Tabakblattextrakte können leicht auf andere Pflanzenarten oder Gewebe übertragen werden und werden so die Entwicklung kostengünstigerer nachgelagerter Prozesse für Rohstoffe und pflanzliche Arzneimittel erleichtern.

Flockung von Tabakextrakt mit verschiedenen Polymeren Das oben beschriebene Verfahren wurde erfolgreich ein Verfahren zu entwickeln für die Ausflockung von Tabakextrakte bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (der HIV-neutralisierenden Antikörper 2G12) und ein fluoreszierendes Protein (DsRed) (Abbildung 1) 16 verwendet und ist seit übertragen auf andere Proteine ​​einschließlich Lektine,...

Das hier vorgestellte Versuchsdesign-Verfahren ermöglicht die Bewertung verschiedener Flockungsmittel im Hinblick auf ihre Fähigkeit, dispergierte Partikel in Pflanzenextrakten zu aggregieren und so die Trübung und die Kosten der nachgelagerten Verarbeitung zu reduzieren.

Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Flockungsmittel zu identifizieren, die die Entfernung dispergierter Partikel aus Pflanzenextrakten verbessern können. Dies wird erreicht, indem ein experimenteller Ansatz aufgestellt wird, um die wirksamsten Polymere und die steuernden Parameter für die Aggregation dieser dispergierten Partikel zu bestimmen. Der zweite Schritt definiert den Arbeitsablauf, der den Verfahrensschritten entspricht, die bei einer großtechnischen Anwendung verwendet werden.Anschließend werden Blattextrakte unter verschiedenen Bedingungen als Flockungsmittel hergestellt und analysiert, um die Trübung und die Produktausbeute zu messen. Die Ergebnisse zeigen die optimalen Flockungsbedingungen und Polymere basierend auf einer Bewertung nach einem Versuchsplanmodell, das wir mit DoE abkürzen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur traditionellen Klärung allein durch Tiefenfiltration besteht darin, dass die Filterkapazität um ein Vielfaches erhöht werden kann, wodurch die Gesamtkosten des Verfahrens gesenkt werden.Die Flockung kann den effektiven Durchmesser von Partikeln erhöhen und deren Entfernung durch Zentrifugation oder Filtration erleichtern. Daher müssen zunächst die umweltrelevanten Prozessparameter identifiziert werden, die für das Flockungsverfahren von Bedeutung sind. Typischerweise gibt es mehrere solcher Parameter.Daher ist ein DoE-Ansatz angesichts des Fehlens mechanistischer Modelle geeignet. Der DoE wird durch Auswahl von Parametern basierend auf Literaturdaten und vorherigem Wissen eingerichtet. Typische Parameter umfassen die Inkubationszeit sowie Art und Konzentration des Polymers.Die experimentellen Ergebnisse, die zur Beurteilung der Effizienz der Flockung verwendet werden, wie beispielsweise die Filtrierbarkeit, werden ebenfalls vor dem Experiment festgelegt. Diese Informationen werden anschließend in ein DoE-Verfahren eingespeist, das der Anzahl der zu untersuchenden Faktoren und dem bereits vorhandenen Kenntnisstand über das System angemessen ist. Ein Arbeitsablauf wird entwickelt, um alle Schritte abzudecken, die für die Flockung und die verfahrenstechnische Aufarbeitung von Pflanzenextrakten im Labor maßgeblich sind.Das Aliquotvolumen sollte klein genug sein, um einen hohen Probendurchsatz zu ermöglichen. Die Leistung der Laborgeräte sollte mit der von prozessskalierten Vorrichtungen korrelieren. Pflanzen werden in einer Weise kultiviert, die den endgültigen Prozess repräsentiert.Alle Hilfsmittel werden vor Beginn der Extraktions- und Flockungsexperimente vorbereitet. Die Stammlösungen der Flockungsmittel werden sorgfältig hergestellt, wobei eventuelle Vorverdünnungen durch den Hersteller berücksichtigt werden. Die Wahl derselben Stammkonzentration für alle Flockungsmittel vereinfacht das anschließende Pipettieren und verringert die Fehleranfälligkeit.Die Pufferbestandteile, der pH-Wert und die Leitfähigkeit jeder frischen Flockungsmittel-Stammlösung werden so eingestellt, dass sie den Bedingungen der Extrakte entsprechen. Der DoE-Plan wird in ein Pipettierschema umgewandelt, das die Volumina der hinzuzufügenden Stammlösungen für die Pflanzenextraktproben festlegt. Pflanzenextraktproben werden aus geernteten Tabakblättern unter Verwendung der Puffer hergestellt, die den zu testenden Bedingungen im DoE entsprechen.Während der Extrakt gerührt wird, werden Aliquote in dem vorab festgelegten Volumen vorbereitet. Dies gewährleistet eine homogene Partikelverteilung in allen Proben. Extraktionspuffer wird zu jedem Aliquot hinzugefügt, sodass jede Probe das gleiche Volumen aufweist, sobald ein Flockungsmittel-Stammlösung zugegeben wurde.Das in der DoE festgelegte Volumen der Stammlösung wird gemäß der randomisierten Reihenfolge nacheinander zur Probe hinzugefügt. Das Polymer wird durch unmittelbares Schütteln des Gefäßes nach der Zugabe gleichmäßig in der Probe verteilt, wodurch auch die Reproduzierbarkeit der Flockungsergebnisse sichergestellt wird. Die Methode kann leicht angepasst werden, um Kombinationen von Flockungsmitteln oder die wiederholte Zugabe desselben Flockungsmittels zu testen.Dies muss jedoch in der DoE umgesetzt werden. Die Flockenbildung erfordert typischerweise eine Inkubationszeit von drei bis 30 Minuten. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es notwendig, sich an die in der DoE festgelegten Inkubationszeiten zu halten.Entweder die Sinkgeschwindigkeit der Flocken oder die Trübung der Filtrate und die Filterkapazitäten können zur Beurteilung der Flockungsmittelwirkung herangezogen werden. Es ist ebenfalls wichtig zu überprüfen, ob die Polymere nicht mit Produkten wie Proteinen interferieren. Sobald die Datenqualität bestätigt ist, können die Informationen in die DoE-Software übertragen werden.Die experimentellen Daten werden mithilfe der in der DoE-Software integrierten Werkzeuge analysiert, einschließlich Daten­transformation, Faktorauswahl und Qualitätskontrollwerkzeuge. Neben der Nutzung dieser Werkzeuge sollte das endgültige Modell auch mit den grundlegenden Gesetzen der Physik und Thermodynamik übereinstimmen. Sobald die Modellqualität bestätigt ist, kann das Modell verwendet werden, um die optimalen Bedingungen für die Flockung vorherzusagen.Auf der Grundlage der Modellvorhersagen kann der Designraum auf den relevantesten Bereich eingegrenzt werden, für den ein neues DoE eingerichtet werden kann, wobei das zuvor beschriebene Verfahren wiederholt wird. Die Ergebnisse können anschließend im Pilot- oder Produktionsmaßstab bestätigt werden. In dieser repräsentativen Studie wurde die Leistung von 23 verschiedenen synthetischen und vier natürlichen Flockungsmitteln hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Tabakblattextrakte mittels eines DoE-Ansatzes zu flockulieren, getestet.Unter Berücksichtigung polymerspezifischer Parameter wie Polymerkonzentration und -typ sowie Prozessparameter wie Inkubationszeit, Temperatur, Puffer-pH-Wert und Leitfähigkeit. Mit der Abfolge von vier geschachtelten IV-optimalen Versuchsplänen, die insgesamt etwa 200 Aliquots zu je 20 mL Extrakt umfassten, stellten wir fest, dass Polymin P der wirksamste Flockungsmittel für Tabakextrakte im pH-Bereich von vier bis acht war, solange die Temperatur zwischen vier und 30 Grad Celsius lag. Eine Inkubationszeit von 15 Minuten war ausreichend für die Flockung, doch die Wirksamkeit nahm bei Leitfähigkeiten über 40 mS pro cm ab.Jedoch zeigte der DoE-Ansatz, dass Catiofast VSH komplementär zu Polymin P wirkte und eine wirksame Flockung bei Leitfähigkeiten von mehr als 40 mS pro cm ermöglichte. Bei Einführung dieser Flockungsmittel in die nachgeschaltete Aufarbeitung von Tabakextrakten stieg die Kapazität der eingesetzten Tiefenfilter um das 3,2- bis 5,7-fache, wodurch die Herstellkosten für diesen Schritt entsprechend gesenkt wurden. Wir konnten bestätigen, dass die Flockungsmittel die Ausbeute an Zielproteinen – darunter ein monoklonaler Antikörper, ein Fluoreszenzprotein, ein Lactin sowie verschiedene Impfstoffkandidaten – nicht verringerten.Die optimalen Flockungsbedingungen wurden ebenfalls in einem 100-L-Pilotmaßstab bestätigt. Die Ergebnisse des DoE konnten erfolgreich auch auf Tabakextrakte übertragen werden, die mit einer Schneckenpresse anstelle eines auf Klingen basierenden Homogenisierers hergestellt wurden, was unterstreicht, wie breit anwendbar die gewonnenen Informationen sind. Wir haben die Methode zudem angepasst, um Kombinationen von Flockungsmitteln zu testen, die ebenfalls gleich gut wirkten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man Flockungsexperimente für Pflanzenextrakte unter Verwendung eines DoE-Ansatzes einrichtet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung (Video) | JoVE Journal

Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung

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