Immobilisierung von Multi-Biokatalysatoren in Alginatbeads für Kofaktorregenerierung und verbesserte Reusability

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Verwendung eines gekoppelten biokatalytischen Ganzzellsystems zu demonstrieren, das in Alginatkügelchen immobilisiert ist, um die Produktionsausbeute und Wiederverwendbarkeit zu verbessern. Dies ist mein Fach, ich habe Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Biokatalyse beantwortet, wie z. B. Immobilisierung von Biokatalysatoren, Stabilität, Regeneration von Cofaktoren und Biokatalysatoren für ganze Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen einfachen, aber flexiblen Ansatz für eine verbesserte Produktion vieler wichtiger Biomoleküle durch Cofaktor-abhängige Wege bietet.

In diesem Protokoll werden zwei rekombinante E-Coli-Stämme verwendet. SpNOx E coli, das die NADH-Oxidase exprimiert, und HjLAD E coli, das die L-Arabinitol-Dehydrogenase exprimiert. Da dieses Verfahren für beide E-Coli-Stämme gleich ist, wird es nur für HjLAD E-coli demonstriert.

Eine einzelne Kolonie von HjLAD E coli wird in drei Milliliter LB-Medium geimpft, ergänzt mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Ket-A-My-Sin, und über Nacht in einem Inkubatorschüttler inkubiert. Am folgenden Tag verdünnen Sie die Kultur um eins auf 100 auf 200 Milliliter frisches LB, das 15 Mikrogramm pro Milliliter Ket-A-My-Sin enthält, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius bei 250 U/min, bis das OD 600 etwa 0,6 erreicht. Induzieren Sie die HjLAD-Proteinexpression, indem Sie 0,1 millimolares IPTG zum Kulturmedium hinzufügen und sechs Stunden lang bei 25 Grad Celsius und 200 U/min inkubieren.

Ernten Sie die induzierten Zellen durch Zentrifugation bei 3200 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie mit der Verarbeitung des Zellpellets fort, wie im nächsten Segment gezeigt. Um dieses Verfahren zu beginnen, suspendieren wir die Zellpellets von HjLAD E coli und SpNox E coli separat in 50 Millimolar Tris-Hcl-Puffer bei einer Zelldichte von fünf Gramm Trockenzellgewicht pro Liter.

Mischen Sie in einem 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen 600 Mikroliter fünf Gramm Trockenzellgewicht pro Liter HjLAD E coli, 600 Mikroliter fünf Gramm Trockenzellgewicht pro Liter SpNOx E coli, 100 Mikroliter 20 Millimolar NAD plus und 150 Mikroliter zwei molare L-Aribinit. Bringen Sie das Reaktionsvolumen auf zwei Milliliter, indem Sie 550 Mikroliter 50 millimolare Tris-HCl hinzufügen. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 30 Grad Celsius und 200 U/min für acht Stunden.

Nach acht Stunden zentrifugiert man das Gemisch bei 3200 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten und sammelt den Reaktionsüberstand. Um die L-Xylulose-Produktion durch einen kolorimetrischen Assay zu quantifizieren, aspirieren Sie 100 Mikroliter des gesammelten Überstands in ein 1,5-Milliter-Röhrchen. Fügen Sie 50 Mikroliter 1,5 % Cystein, 900 Mikroliter 70 % Schwefelsäure und 50 Mikroliter 0,1 % Kar-Piz-All, gelöst in Ethanol, hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen dreimal umdrehen.

Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für 20 Minuten. Messen Sie die optische Absorption des Reaktionsgemisches bei 560 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Beginnen Sie das Immobilisierungsprotokoll mit der Zubereitung einer 4%igen Alginatlösung.

Fügen Sie 0,8 Gramm Natriumalginat zu 20 Millilitern destilliertem Wasser hinzu und erhitzen Sie die Mischung, um das Natriumalginat aufzulösen. Fügen Sie 600 Mikroliter fünf Gramm Trockenzellgewicht pro Liter HjLAD E coli und 600 Mikroliter fünf Gramm Trockenzellgewicht pro Liter SpNOx E coli zu 1,2 Millilitern der 4%igen Alginatlösung hinzu. Mischen Sie die Zellen und das Alginat durch sanftes Pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden.

Um die Bildung von Alginatkügelchen mit einheitlicher Größe, Morphologie und Steifigkeit zu gewährleisten, ist es entscheidend, die Zellalginatsuspension für einen optimalen Abstand langsam und tropfenweise in ein ausreichendes Volumen Calciumchloridlösung zu geben, um alle Kügelchen zu bedecken. Die Alginat-Zellsuspension wird mit einer Nadel in eine Spritze aspiriert und dann die Mischung tropfenweise in eine 0,3-molare Calciumchloridlösung in einem 100-Milliliter-Becherglas unter ständigem Rühren gegeben. Lassen Sie die Kügelchen zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Calciumchloridlösung ohne Rühren, damit die Vernetzung stattfinden kann.

Dekantieren Sie die Calciumchloridlösung, ohne die Kügelchen zu stören, indem Sie die Calciumchloridlösung vorsichtig in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gießen. Die restlichen Kügelchen in ein weiteres konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Um überschüssiges Calciumchlorid und unverkapselte Zellen zu entfernen, waschen Sie die Kügelchen mit 50 millimolaren Tris-HCl-Puffern.

Geben Sie 10 Milliliter Puffer zu den Kügelchen und lassen Sie die Suspension drei bis fünf Minuten lang ungestört stehen. Sobald sich die Kügelchen am Boden abgesetzt haben, fülle den Puffer in einen anderen Behälter um. Waschen Sie die Perlen auf diese Weise dreimal.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen nicht in einem bestimmten Schritt, da sie sonst platzen. Entsorgen Sie den gebrauchten Tris-HCl-Waschpuffer nicht. Ziehen Sie die 30 Milliliter des gebrauchten Waschpuffers mit der zuvor gesammelten gebrauchten Calciumchloridlösung.

Die nicht immobilisierten E. coli-Zellen werden durch Zentrifugation des gezogenen Calciumchlorids und der Tris-HCl-Lösung bei 3200 mal G für 20 Minuten pelletiert. Die gewaschenen Kügelchen in eine Tube geben. Bewerten Sie anschließend die L-Xylulose-Biosynthese nach dem für die Zellpellets gezeigten Verfahren, jedoch unter Verwendung aller gewaschenen Kügelchen anstelle von Zellpellets.

Um die Stabilität der immobilisierten Biokatalysatoren für die L-Xylulose-Produktion zu beurteilen, sammeln Sie die Kügelchen nach ihrer Form. Und zweimal mit 10 Millilitern 50 Millimolar Tris-HCl Puffer waschen, ohne Zentrifugation, wie oben gezeigt. Verwenden Sie alle gewaschenen Kügelchen, um die Reaktion für die L-Xylulose-Produktion durchzuführen, wie zuvor gezeigt.

Quantifizieren Sie die L-Xylulose-Produktion durch einen kolorimetrischen Assay, ebenfalls wie zuvor gezeigt. Die L-Xylulose-Produktionsreaktion wird für die gewünschte Anzahl von Produktionszyklen wiederholt und die Menge an L-Xylulose gemessen, die in jedem Zyklus im Reaktionsüberstand produziert wird. Die L-Xylulose-Produktion wird durch dieses gekoppelte biokatalytische Ganzzellsystem erhöht.

Ausgehend von einer Anfangskonzentration von 150 millimolaren L-Aribinitol führte allein die Verwendung des Biokatalysators HjLAD E coli zu einer Ausbeute von 79 % L-Xylulose. Im Vergleich dazu ergab die Verwendung der HjLAD E coli und SpNOx E coli Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins eine Ausbeute von 96 % L-Xylulose. Eine Auswertung der Parameter, die die Immobilisierungseffizienz von Biokatalysatoren beeinflussen, ergab, dass der Wirkungsgrad mit zunehmender Natriumalginatkonzentration im Bereich von einem bis drei Prozent steigt.

Natriumalginatkonzentrationen von mehr als 2 % führen jedoch zu einer verminderten L-Xylulose-Ausbeute. Unter Verwendung einer Natriumalginatkonzentration von 2% wurde die optimale Calciumchloridkonzentration für die Immobilisierung und L-Xylulose-Ausbeute mit 0,3 molar bestimmt. Die Wiederverwendbarkeit von Biokatalysatoren wurde bewertet.

In diesem Diagramm ist die L-Xylulose-Produktion für sieben aufeinanderfolgende Zyklen der Wiederverwendung von immobilisierten und frei gekoppelten Ganzzell-Biokatalysatoren in dunkel- bzw. hellgrau dargestellt. Obwohl die maximale L-Xylulose-Ausbeute durch immobilisierte gekoppelte Ganzzell-Biokatalysatoren geringer ist als durch ein frei gekoppeltes Ganzzellsystem, wird die Wiederverwendbarkeit durch die Immobilisierung verbessert. Am Ende von sieben Zyklen sukzessiver Wiederverwendung behielten die immobilisierten Biokatalysatoren ihre Stabilität bei und behielten 65 % der ursprünglichen L-Xylulose-Ausbeute bei.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biokatalyse, um die Ausbeute vollständiger mehrzelliger Biokatalysatoren und die Hauptreaktionen, an denen Cofaktoren beteiligt sind, zu erforschen.