Die Beurteilung Primäre Neurogenese in Xenopus Embryonen Immunostaining

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine schnelle und bequeme Visualisierung verschiedener Populationen von neuronalen Zellen im sich entwickelnden embryonalen Xenopus-Gehirn zu ermöglichen. Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der primären Neurogenese zu beantworten, wie z.B. die Beobachtung des Regulationsprozesses der neuronalen Differenzierung im Xenopus-Zentralnervensystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Beobachtung des Vorläuferpools der neuralen Stammzellen sowie eines differenzierten primären neuronalen Pools innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

Um diesen Vorgang zu beginnen, saugen Sie vorsichtig fünf bis zehn Embryonen mit einer Plastik- oder Glaspipette aus dem Glasfläschchen ab, ohne Luftblasen einzuführen. Übertragen Sie die Embryonen in die Eindeckkammer und beobachten Sie sie unter einem Stereoskop. Füllen Sie die Montagekammer mit Gelatinelösung, um die Steifigkeit des Profilblocks zu gewährleisten.

Ordnen Sie dann die Embryonen mit einer Pinzette mit feiner Spitze nebeneinander an. Markieren Sie die Ausrichtung des Kopfes, indem Sie mit einem kryogenkompatiblen Marker einen Pfeil auf den Rand der Kammer zeichnen. Bei mehreren Gruppen von Embryonen notieren Sie die Beschreibung jeder Gruppe auf den Rand der entsprechenden Kammer.

Stellen Sie die Kammer dann vorsichtig horizontal in eine Schaumstoffbox, die zur Hälfte mit Trockeneis gefüllt ist. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Einbettkammer nacheinander fünf bis zehn Minuten lang einfrieren. Fahren Sie danach mit der Kryosektion fort oder bewahren Sie gefrorene Proben mindestens ein bis zwei Wochen lang bei 80 Grad Celsius auf, ohne die Immunogenität zu verlieren.

Bei diesem Verfahren wird der gefrorene Probenblock aus der Kammer genommen, indem man mit einem stumpfen Stock oder einem Finger auf den Boden der Kammer drückt. Geben Sie dann einige Tropfen Gewebegefriermedium auf die Probenhaltescheibe. Montieren Sie den Probenblock mit dem vorderen Ende der Embryonen nach oben und lassen Sie den montierten Block etwa eine Minute lang in der Kryostatenkammer stehen oder bis das Gefriermedium undurchsichtig wird.

Setzen Sie die Probenhaltescheibe sofort mit der Unterseite des Probenblocks nach oben auf das Mikrotom ein. Schneiden Sie einen Teil des Probenblocks mit einer Klinge ab, wenn der Probenblock noch relativ weich ist. Lassen Sie dann die Probenhaltescheibe mindestens fünf Minuten lang auf dem Mikrotom, damit die Temperatur ein Gleichgewicht erreichen kann.

Schneiden Sie anschließend den Probenblock nach und nach nach ab, bis die Köpfe der Kaulquappen durch die durchscheinende Gelatine sichtbar sind. Um die Beschnittgeschwindigkeit zu erhöhen, erhöhen Sie die Schnittdicke. Überwachen Sie die Leistung des Kryostaten, z. B. die Schärfe und den Winkel der Klinge, um sicherzustellen, dass nachfolgende Abschnitte in einem langen Streifen erzeugt werden.

Sobald die Kaulquappenköpfe sichtbar sind, stellen Sie die Einstellungen des Kryostaten wieder auf normal ein, um sicherzustellen, dass die fertigen Scheiben Streifen bilden können und sich nicht überlappen oder an der Klinge kleben. Schneiden Sie dann weiter, bis die Köpfe der Kaulquappen fast freigelegt sind. Bürsten Sie alle Reste auf dem Tisch ab, bevor Sie mit dem Sammeln der Probenabschnitte beginnen.

Machen Sie etwa 10 bis 15 Abschnitte und lassen Sie sie einen langen Streifen bilden. Drehen Sie die dicke Deckglasplatte zur Seite und entfernen Sie den Streifen vorsichtig mit einem feinen Pinsel von der Klinge. Ordnen Sie es dann mit der Längsachse parallel zur Klinge auf dem Tisch an.

Machen Sie 10 bis 15 Abschnitte und lassen Sie sie einen langen Streifen bilden, ohne zu brechen. Es ist vielleicht nicht einfach und erfordert Übung. Ein Trick ist, zu versuchen, die Geschwindigkeit nicht zu hoch auf das Handrad zu bringen.

Drehen Sie das Handrad lieber vorsichtig und langsam. Pflücken Sie danach einen positiv geladenen Objektträger bei Raumtemperatur und beschriften Sie ihn mit einem Bleistift. Drücken Sie es dann mit der beschrifteten Seite nach unten schnell und fest auf den Streifen.

Sie anschließend den Objektträger aus der Kryostatkammer. Wiederholen Sie diesen Schritt, um 20 bis 30 Scheiben parallel auf jeder Folie anzuordnen. Trocknen Sie die Seiten 10 Minuten lang an der Luft und fahren Sie dann sofort mit der Immunfärbung fort oder lagern Sie die Objektträger in einer Objektträgerbox bei 80 Grad Celsius für bis zu drei bis sechs Monate, bevor die Immunfärbung stattfindet.

Hier sehen wir die entsprechenden Schnittebenen des Vorderhirns, des Mittelhirns, des Hinterhirns und des Rückenmarks einer Xenopus-Kaulquappe, die als Positionsreferenzen für die folgenden Bilder verwendet werden. Die entsprechenden Querschnitte, die mit Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin und DAPI gefärbt wurden, zeigen die relativen Lokalisationen von neuralen Stammzellpools sowie Neurofilamenten innerhalb des Neuralrohrs. Und hier sind die entsprechenden Querschnitte, die mit Anti-MyT1 und DAPI gefärbt wurden und die relativen Positionen der differenzierten primären Neuronen innerhalb des Neuralrohrs zeigen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass der Probenblock in Trockeneis ausreichend abkühlen muss. Andernfalls kann es sein, dass der Probenblock nicht hart genug ist und somit schwer zu schneiden ist.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsneurowissenschaften, um die neuronale Differenzierung im Xenopus-Zentralnervensystem zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Schnitte erstellt und bestimmte Pools von neuronalen Zellen in einem Xenopus-Zentralnervensystem beobachtet.