Name: Ein Roman Ex Ovo Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Lernen Sie eine reproduzierbare Ex-Ovo-Banding-Technik zur Veränderung der intrakardialen Hämodynamik in Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Konsequenzen veränderter Blutflussbedingungen.

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Die Autoren möchten Dr. Robert Price und den Mitarbeitern der Instrumentation Resource Facility an der University of South Carolina School of Medicine danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein SPARC Graduate Research Grant des Office of the Vice President for Research an der University of South Carolina (JDP/VM) unterstützt. Darüber hinaus wurden diese Arbeiten durch das Cook Biotech Research Agreement (JDP) sowie durch FirstString Research Inc (JDP) und NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP) unterstützt. Darüber hinaus wurde der Zuschuss des NIH IDeA Networks of Biomedical Research Excellence (INBRE) für die South Carolina P20GM103499 (JE) gewährt

Avian Embryonen werden nicht an Wirbeltieren unter IUCAC Vorschriften berücksichtigt. 1. Gewinnung Embryonen für Chirurgie <ol><li> Inkubieren 80-90 befruchtete Bovan Hühnereier (stumpfes Ende nach oben) in einem befeuchteten (60%) rocker Inkubator bei 40 ° C für etwa 72 Stunden Embryonen bei Hamilton und Hamburger (HH) Stufe 17. Bestimmen Sie genaue Anzahl der Eier zu erhalten, basierend auf Leistungsanalyse und Überlebensrate von Embryonen 17. Verwenden Sie Kunststoff-Ei-Tabletts für die Inkubation, um eine angemessene Luftzirkulation zu ermöglichen. </li><li> Sobald diese gewünschte Entwicklungsstufe erreicht wird, gieße ca. 20 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer (mit Natriumbicarbonat supplementiert (1 g / L)) in eine 100 mm x 26 mm Petrischale. </li><li> Sterilisieren eine Eierschale mit 70% Ethanol. </li><li> knacken Sie vorsichtig die Schale mit einem Skalpell Griff und sorgfältig lösen seinen Inhalt in die Schüssel Tyrode-Puffer enthält. Entsorgen Embryonen, wenn (i) sie visuell abnormal erscheinen (ii) sienicht im richtigen Entwicklungsstadium sind, (iii) sie auf dem Dotter unsachgemäß ausgerichtet sind und / oder (iv) auftritt jede Blutungen. Behalten alle Embryonen nicht der Operation unterzogen , unmittelbar nach dem bei 40 ° C platziert ex ovo , um keine Entwicklung zu beeinträchtigen. Hinweis: Die Zuschaltung wird durchgeführt basierend auf Hamilton und Hamburger 18. Abnormality von Hühnerembryonen ist mit dem bloßen Auge und unter der Dissektion Umfang bestimmt. Stellen Sie sicher, dass der Embryo entsprechende Faltung hat und Biegen und Gefäßen. </li></ol> 2. OFT Banding <ol><li> Tweeze aus einzelnen 1 cm lange Fäden aus einem einzigen 11/0 Nylon chirurgisches Naht und bilden einen losen Knoten. UV alle vorgefertigten Knoten sterilisieren. </li><li> Unter einem Präpariermikroskop sicher visuell, dass das Herz mit einer normalen Rate schlägt (~ 120 Schläge / min). Wenn nicht, werfen Sie den Embryo. </li><li> Kurz vor der Operation anwenden 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer auf die Embryooberfläche eine Transferpipette. </li><li> Führen Sie einen freien Ende des vorgeformten Knoten unter der OFT, positionieren Sie die Naht an der OFT / Ventrikel Übergang (OVJ) (oder gewünschte Position), und das freie Ende in den Knoten passieren, wodurch die OFT einzuengen einschließlich der Membranen, die das Herz. </li><li> Nach der Operation benetzen die Oberfläche des Eigelbs mit 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer, der eine Transferpipette. </li><li> Behalten Sie die Kontrolle Embryonen ex ovo wie die gebänderte Embryonen; aber sie unterliegen nicht dem chirurgischen Eingriff. </li><li> Inkubiere die Embryonen, für die gewünschte Zeitdauer, bei 40 ° C in einem befeuchteten (60%) Inkubator. </li><li> Sobald der gewünschte Zeitpunkt erreicht ist, auszuschneiden, den Embryo aus dem Dotter mit geraden Schere. Präparieren Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und verwenden für mehrere Downstream - Studien wie zum Beispiel Veränderungen der kardialen Morphologie aufgrund veränderter Hämodynamik 17. </li></ol> 3. Bestätigen, dass der Banding Intervention eine Veränderung der Hämodynamik Ursachen Anmerkung: Die teilweise durch die banding Eingriff verursachte Verengung führt zu einer Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit an der OVJ. Dieser hämodynamische Parameter wird zweckmßigerweise unter Verwendung von 2D-Ultraschallbildgebungs beurteilt, die bei dem gewünschten Zeitpunkt des Experiments durchgeführt wird. <ol><li> Da nur ein einziger Embryo zu einem Zeitpunkt abgebildet werden, halten alle anderen zur Ultraschallbildgebung bezeichnet Embryonen in einem 40 ° C Inkubator. </li><li> Legen Sie die Petrischale den Embryo enthält, auf einem Heizkissen bei 40 ° C eingestellt abgebildet werden. </li><li> Füllen Sie die Schüssel, bis zum Rand, mit warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer. Gießen Sie langsam die Pufferlösung in die Schale, um das Eigelb intakt zu halten. Wenn jedoch die Integrität des Eigelbs bei diesem Schritt kompromittiert, verwerfen den Embryo. </li><li> Orient der Embryo, so dass die Mittelachse des Embryos senkrecht zu der Ultraschallsonde, die aus einem einstellbaren Ständer aufgehängt ist. </li><li> Mit dem Ultraschallgerät Operting in B-Modus, ein 2D-Bild des schlagenden Herzens auf dem Bildschirm zu erhalten und die Stufe (Heizkissen), so dass das OFT, Ventrikel und OVJ sind deutlich sichtbar bewegen. </li><li> Umschalten auf die gepulste Wellen (PW) -Modus, bei der gewünschten Impulswiederholungsfrequenz (zB 20 kHz) und erhalten Geschwindigkeitsdaten genau an der OVJ. Ein B-Modus-Bild des schlagenden Herzens wird auf dem Bildschirm erhalten. <ol><li> Bewegen Sie die Stufe der OFT, Ventrikel und die OVJ zu sehen. Mit Hilfe der Ultraschall-Maschine-Software, erhalten Geschwindigkeitsmessungen genau an der OVJ. </li></ol></li></ol> Hinweis: Wenn der Herzfrequenz eines Embryos während der Bilderzeugung verringert, die Geschwindigkeit so erhaltenen Daten nicht für die Analyse verwendet werden. Alle Embryonen für die Geschwindigkeitsmessungen verwendet werden, sollten vorzugsweise nicht für andere Experimente nach der Ultraschall-Bildgebung verwendet werden.

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<li>Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+dynamics+reflect+degree+of+outflow+tract+banding+in+Hamburger-Hamilton+stage+18+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos.</a> J R Soc Interface. 11 (100), (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Technik relativ schnell und einfach durchzuführen, jedoch bestimmte Schlüsselpunkte müssen im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerten Ergebnisse zu erzielen. Embryonen ex ovo in einer Petrischale gehalten werden , die Tyrode-Puffer enthält ausreichende Rehydratisierung vorzusehen. Es ist auch wichtig, den Dotter nach der Operation mit Tyrode-Puffer, um Hydrat und sicher, dass die Inkubationskammer zu machen, ist ausreichend mit Flüssigkeit versorgt. Chirurgie sollte nicht auf einem Embryo durchgefü...

Abnormal geformte Abflussklappen sind die häufigste Art von angeborenen Herzfehlern 1. Eine defekte Herzklappenstruktur und -funktion kann, auch wenn sie bei der Geburt vorhanden ist, erst im Erwachsenenalter symptomatisch werden. Tatsächlich können mehrere Klappenerkrankungen bei Erwachsenen auf einen angeborenen Ursprung zurückgeführt werden. Die Behandlung solcher Patienten beinhaltet oft den Austausch defekter Klappen, und vor allem haben sich bei ersetzten Aortenklappen angeborene Anomalien gezeigt 2. Angesichts der Tatsache, dass kritische Prozesse, die an der Klappenentwicklung beteiligt sind, früh während der Embryogenese beginnen, wird hervorgehoben, wie wichtig es ist, die Mechanismen, die diese Ereignisse regulieren, besser zu verstehen. 
Der primitive Herzschlauch, der das erste funktionierende Organ in einem Embryo ist, weist zwei unterschiedliche Schichten auf - ein endotheliales Endokard, das von Myokard umgeben ist - getrennt durch eine extrazelluläre Matrix (Herzgelee), die hauptsächlich vom Myokard 3-5 produziert und sezerniert wird. Im weiteren Verlauf der Entwicklung bilden sich nach der Rechtsschleife des embryonalen Herzens Klappenprimordien (endokardiale Polster) durch lokale Ausdehnung des Herzgeldes am atrioventrikulären (AV) Kanal und am Ausflusstrakt (OFT) 4,6. Diese Expansion wird durch den stark regulierten Prozess der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) vermittelt, bei dem das Herzgelee von endokardialen mesenchymalen Zellen besiedelt wird 6. Neben der mesenchymalen Population, die durch EMT gewonnen wird, sind auch Neuralleistenzellen an der Valvulogese des OFT 3 beteiligt. 
Hämodynamische Reize, wie z.B. Scherstress, sind wichtige epigenetische Faktoren, die die Herzentwicklung im Embryo regulieren 7,8. Unter Verwendung eines 3D-In-vitro-Systems haben wir zuvor gezeigt, dass Scherspannung ein Faktor ist, der die Expression und Ablagerung von Proteinen der fibrösen extrazellulären Matrix (ECM) in AV- und OFT-Polstern beeinflusst 9,10. Darüber hinaus haben Studien, die von mehreren Forschern durchgeführt wurden, gezeigt, dass ein veränderter Blutfluss zu einer falschen Bildung von Klappen und Septen führt 11-16. Kürzlich haben wir mit dem hier vorgestellten neuartigen Banding-Verfahren gezeigt, dass eine veränderte Hämodynamik im embryonalen Kükenherzen die frühen Prozesse beeinflusst, die an der Bildung der OFT-Klappe beteiligt sind 17.
Die hier beschriebene Technik bietet ein neuartiges Modell zur Veränderung der Hämodynamik im sich entwickelnden Kükenherzen, indem das OFT ex ovo teilweise verengt wird. Dieses reproduzierbare Verfahren ist relativ schnell und ermöglicht es den Forschern, eine ausreichende Anzahl von Embryonen/ganzen Herzen/OFT-Gewebe usw. für nachgelagerte Analysen, einschließlich Genexpressionsstudien, zu gewinnen. Darüber hinaus kann dieses neue Modell verwendet werden, um "chronische" Auswirkungen einer veränderten Hämodynamik auf die Entwicklung der OFT-Klappe zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Befruchtete Bovan-Hühnereier</td><td>Clemson University, Clemson, SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 / 0 Nylon-Naht</td><td>Ashaway</td><td>S30001</td><td>UV-sterilisieren Knoten vor der Operation</td></tr><tr><td>100 x 26 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>25387-030</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tyrodes Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2145-10L</td><td>Vor Gebrauch Filter sterlizieren&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Ultraschall-Bildgebungssystem</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11392</td><td></td></tr><tr><td>708 Ultraschall-Schallkopf&nbsp;</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11171</td><td></td></tr></tbody></table>

ein roman<em&gt; ex ovo</em&gt; banding-technik intrakardialer hämodynamik in einem embryonalen hühner system ändern

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Das hier vorgestellte neue Modell kann verwendet werden, um den Einfluss der Hämodynamik auf spezifische kardiale Entwicklungsprozesse auf zellulärer und molekularer Ebene zu verstehen. Um die intrakardiale Hämodynamik zu verändern, werden befruchtete Hühnereier in einer befeuchteten Kammer inkubiert, um Embryonen des gewünschten Stadiums (HH17) zu erhalten. Sobald dieses Entwicklungsstadium erreicht ist, wird der Embryo ex ovo erhalten und die Hämodynamik im embryonalen Herzen wird verändert, indem der Ausflusstrakt (OFT) mit einer chirurgischen Naht an der Verbindung von OFT und Ventrikel (OVJ) teilweise verengt wird. Kontrollembryonen werden ebenfalls ex ovo kultiviert, aber nicht dem chirurgischen Eingriff unterzogen. Die gebänderten und kontrollierten Embryonen werden dann für den gewünschten Zeitraum in einem befeuchteten Inkubator inkubiert, wonach 2D-Ultraschall eingesetzt wird, um die Änderung der Blutflussgeschwindigkeit am OVJ als Folge des OFT-Bandings zu analysieren. Sobald die Embryonen ex ovo aufbewahrt werden, ist es wichtig, eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr in der Inkubationskammer sicherzustellen, um ein Austrocknen und schließlich den Tod der Embryonen zu verhindern. Mit diesem neuen gebänderten Modell ist es nun möglich, Analysen von Veränderungen in der Expression von Schlüsselakteuren durchzuführen, die an der Klappenentwicklung beteiligt sind, und die Rolle der Hämodynamik auf die zellulären Reaktionen in vivo zu verstehen, was bisher nicht möglich war.

In Abbildung 1 dargestellt sind Instrumente für OFT Banding erforderlich empfohlen. Die Petrischale (1A) , um den Embryo ex ovo enthält , sollte tief genug sein, um nicht den Embryo zu zerstören , wenn sie mit dem Deckel bedeckt. Tiefpetrischalen (1C) sollte auch für die Ultraschall - Bildgebung verwendet werden , ein ausreichendes Volumen an Tyrode-Puffer zu ermöglichen , oben auf dem Dotter gegossen werden. <p class="jove_...

Zum ersten Mal stellen wir hier ein reproduzierbares Banding-Verfahren vor, um die Hämodynamik im sich entwickelnden Herzen ex ovo zu verändern. Dies wird durch eine partielle Verengung des Abflusstrakts (OFT) erreicht.

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Ex-Ovo-Banding-Verfahrens besteht darin, eine reproduzierbare, nicht tödliche Veränderung der kardialen Hämodynamik herbeizuführen, um die daraus resultierenden genetischen Konsequenzen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Entwicklung zu beantworten, beispielsweise zur Entwicklung der Herzklappen und assoziierter Krankheitszustände. Die Stärke dieses Systems liegt darin, dass es genetische Signalwege untersuchen kann, die auf veränderte Hämodynamik im sich entwickelnden Herzen und den Klappen reagieren, sowie dabei helfen kann, einen kritischen Punkt zu identifizieren, ab dem die Rettung eines Herzens keine langfristigen nachteiligen Effekte mehr zeigt.Die Demonstration des Verfahrens wird Lorain Junor, eine Technikerin aus meinem Labor, und Herr Vinal Menon, ein Doktorand im Labor, übernehmen, die den Umgang mit den Eiern sowie die Bedienung des Ultraschallgeräts zeigen werden. Inkubieren Sie 80 bis 90 befruchtete Bovan-Hühnereier mit den stumpfen Enden nach oben in Kunststoff-Eierschalenhaltern in einem befeuchteten Schüttelinkubator, der auf 40 Grad Celsius eingestellt ist. Lassen Sie sie etwa 72

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