Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Krebsstammzellen aus Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom- oder HNSCC-Zelllinien zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbehandlung zu beantworten, insbesondere wie Chemotherapie eingesetzt werden kann, um die Strahlenresistenz von Tumoren zu überwinden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Kombination von Markern verwendet, um eine hohe Spezifität bei der Isolierung von Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien zu erreichen.

Die Durchführung des Verfahrens wird von Prescillia Battiston-Montagne, unserer Technikerin, und Marion Gilormini, einer Doktorandin aus meinem Labor, übernommen. Um eine Side-Population von krebsstammähnlichen Zellen mittels Hoechst-Farbstoff-Efflux-Assay auszuwählen, beschriften Sie zunächst ein kegelförmiges Reagenzglas mit „Hoechst“ und ein weiteres mit „Hoechst und Verapamil“. Anschließend waschen Sie eine HNSCC-Zellkultur mit steriler PBS, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Tripsyn-EDTA.

Nach drei Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit frischem Zellkulturmedium stoppen und die Zellen zählen. Die Kultur auf 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter verdünnen und komplettes Medium für die parentale Zelllinie hinzufügen. Anschließend 100 Mikroliter in das Hoechst- und Verapamil-Röhrchen sowie vier Milliliter Zellen in das Hoechst-Röhrchen geben.

Danach vorsichtig 10 µL einer fünf Millimolar starken Verapamilhydrochlorid-Lösung in die Hoechst- und Verapamil-Probe sowie fünf µL Hoechst pro eine mal 10 hoch 6 Zellen in beide Röhrchen geben. Anschließend die Proben mit Aluminiumfolie abdecken und für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, wobei alle 15 Minuten vorsichtig gemischt wird. Danach die Röhrchen zentrifugieren und die Pellets in zwei Milliliter PBS resuspendieren.

Nach einer Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet aus Hoechst und Verapamil in 500 Mikrolitern Propidiumiodid in PBS und das Hoechst-Pellet in vier Millilitern desselben. Filtern Sie die Proben anschließend durch 70-Mikrometer-Zellseihen in FACS-Röhrchen, um Aggregate zu entfernen, und stellen Sie die Proben lichtgeschützt auf Eis. Laden Sie danach die Hoechst-Probe in den Durchflusszytometer und öffnen Sie das Globale Arbeitsblatt-Fenster in der Software des Durchflusszytometers.

Klicken Sie auf „Dot Plot“, um ein Diagramm im globalen Arbeitsblatt zu erstellen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Parameter für Streuung vorwärts und seitlich auszuwählen. Erstellen Sie auf die gleiche Weise ein Dot Plot mit seitlicher Streuung (Breite) gegen seitliche Streuung (Höhe) und klicken Sie anschließend auf „Polygon Gate“, um im zweiten Diagramm einen P1-Bereich zu definieren, um Einzelzellen auszuwählen und Doppelzellen auszuschließen. Erstellen Sie danach ein Dot Plot mit rotem Hoechst-Flächenbereich gegen blauen Hoechst-Flächenbereich und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zellen, um die P1-Population hervorzuheben.

Erstellen Sie anschließend einen P2-Bereich, um die negative Seite der mit Hoechst gefärbten Zellpopulation auszuwählen, die als seitlicher Ausläufer links von der Hauptpopulation der Zellen erscheint, und sammeln Sie 10.000 Ereignisse der Hoechst-Probe. Um zu bestätigen, dass das P2-Tor, das die Seitenpopulation darstellt, korrekt positioniert ist, sammeln Sie zusätzlich 10.000 Ereignisse der Hoechst- und Verapamil-Probe. Die Seitenpopulation sollte daraufhin verschwinden.

Sortieren Sie anschließend die Side-Population der Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das ein Milliliter vollständiges Medium für krebsstammähnliche Zellen enthält. Am Ende des Sortiervorgangs werden die Zellen abzentrifugiert und das Pellet der Side-Population in ein Milliliter frischem, vollständigem Medium für krebsstammähnliche Zellen resuspendiert. Anschließend die Zellen zählen und in der geeigneten Anzahl in einen neuen Zellkulturgefäß säen.

Um den CD44-hoch/ALDH-hoch-Teilpopulation aus den sortierten Side-Population-Zellen auszuwählen, beschriften Sie zunächst sieben sterile kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen wie angegeben. Verdünnen Sie anschließend die sortierten Zellen auf eine Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter in Stammzellmedium und pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellen in die unbehandelten CD44-APC- und IgG1-APC-Röhrchen sowie vier Milliliter Zellen in das ALDH- und CD44-APC-Röhrchen, jeweils auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets aus den unbehandelten CD44-APC- und IgG1-APC-Röhrchen in jeweils 100 Mikrolitern Puffer 1 aus dem ALDEFLUOR-Kit.

Fügen Sie anschließend fünf µL des ALDH-Inhibitors DEAB zu den ALDH- und DEAB- sowie ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen im ALDH- und CD44-APC-Röhrchen in vier mL Reagenz C, das vier mL Puffer 1 und 20 µL des Reagenzes aus dem Kit enthält, und übertragen Sie unverzüglich 100 µL dieser Zellen in die ALDH-, ALDH- und DEAB- sowie ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen. Anschließend alle Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 °C stellen, dabei vor Licht geschützt halten und die Proben nach 15 Minuten durch vorsichtiges Vortexen mischen.

Am Ende der Inkubation alle Proben zentrifugieren und die Überstände verwerfen. Anschließend alle Röhrchen auf Eis stellen und das Pellet aus ALDH und CD44-APC in vier Milliliter Puffer A resuspendieren, die CD44-APC- und ALDH-DEAB- sowie die CD44-APC-Pellets in jeweils 100 Mikroliter desselben Puffers. Das IGG1-APC-Pellet in 100 Mikroliter Puffer B resuspendieren und die unbehandelten ALDH- sowie ALDH- und DEAB-Röhrchen in jeweils 100 Mikroliter Puffer eins.

Nach 10 Minuten alle Proben erneut centrifugieren und anschließend mit 1 Milliliter Puffer eins waschen, wobei die Probe mit ALDH und CD44-APC mit 4 Milliliter Puffer eins gewaschen wird. Nach der zweiten Centrifugation alle Pellets in 1 Milliliter frischem Puffer eins resuspendieren, außer die Probe mit ALDH und CD44-APC, die in 4 Milliliter Puffer eins resuspendiert wird. Laden Sie nun die Probe mit ALDH und CD44-APC in den Durchflusszytometer und erstellen Sie ein APC-gegen-FITC-Dotplot, um die doppelt gefärbte Population zu visualisieren.

Laden Sie anschließend das ALDH-Röhrchen, um ein Tor für ALDH-hohe Zellen zu erstellen. Die positiven Zellen sollten verschwinden, wenn das ALDH- und DEAB-Röhrchen geladen wird. Erstellen Sie im selben Diagramm ein zweites Tor unter Verwendung der CD44-APC- und IGG1-APC-Röhrchen, um die CD44-hohen Zellen auszuwählen.

Die positiven Zellen verschwinden, wenn das IGG1-APC-Röhrchen beladen wird. Danach beladen Sie die ALDH- und CD44-APC- sowie die ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen, um ein drittes Tor zu erstellen, das die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen einschließt. Verwenden Sie das doppelt gefärbte ALDH-CD44-Röhrchen, um das letzte Tor auf den doppelt positiven Zellen zu positionieren.

Sortieren Sie anschließend die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das ein Milliliter vollständiges Medium für krebsspezifische Stamm-ähnliche Zellen enthält, und sammeln Sie die CD44-niedrig/ALDH-niedrig-Zellen nach Bedarf in ein Milliliter vollständiges Zellkulturmedium. Nach der zweiten Sortierung werden die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen in einen geeigneten Zellkulturkolben mit vollständigem Medium für krebsspezifische Stamm-ähnliche Zellen gegeben und im Zellkulturgehäuse 18 bis 24 Stunden inkubiert. Sobald die Zellen am Boden des Kolbens angeheftet sind, wechseln Sie das Kulturmedium und stellen Sie den Kolben erneut in den Inkubator.

Um das Tumorpotenzial der CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen zu bestätigen, die krebsstammähnliche Monoschicht wie gezeigt mit Trypsin behandeln, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und 1 × 10⁶ Zellen in ein 15-milliliter-Konischglas überführen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen das Zellpellet in serumarmem Medium resuspendieren, das mit rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor, Heparin und B27 ergänzt wurde, und die Zellen in einer niedrig haftenden Petrischale im Zellkulturtinkubator inkubieren, bis Tumorsphäroide mittels optischer Mikroskopie nachgewiesen werden. Wenn die Sortierung zum ersten Mal an einer neuen Zelllinie durchgeführt wird, ist es notwendig, das Tumorpotenzial der Zelllinie zu bestätigen, das sich durch die Fähigkeit zur Bildung von Tumorsphäroiden in serumfreiem Medium in vitro zeigt.

Außerdem sollte die QPCR eine hohe Expression von Beta-Catenin und anderen Stammzell-ähnlichen Markern durch die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen nachweisen. Die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen sollten außerdem in der Lage sein, bei Injektion in geringen Mengen im Vergleich zu CD44-niedrig/ALDH-niedrig-Zellen Tumoren *in situ* zu bilden. Wenn der Vorgang einmal beherrscht ist, sollte jede Zellsortierung innerhalb von fünf Stunden abgeschlossen werden können, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die mit Fluorochrom markierten Proben vor direkter Lichteinwirkung zu schützen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Invasion-Migrations-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Beteiligung von Krebsstammzellen am metastatischen Prozess zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, die Mechanismen der Tumorausweichung beim HNSCC-Krebs zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien mittels multiparametrischer, durchflusszytometrischer Analyse und Zellsortierung isoliert. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Tumorzellen und interkalierenden DNA-Agenzien äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.