Name: Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Krebsstammzellen aus Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom-Zelllinien mittels Hoechst-Farbstoff-Assay und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von CD44-hoch/ALDH-hoch Zellpopulationen für die Tumorforschung.

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Wir danken Thibault Andrieu und Sebastien Dussurgey von der Durchflusszytometrie-Plattform von UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) für ihre Beratung und Hilfe während unserer Sortierung. Diese Arbeit wurde im wissenschaftlichen Rahmen von ETOILE und Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063) durchgeführt.

Alle Tier Verfahren wurden nach den örtlichen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. Alle Details dieser Studie wurden von der CECCAPP genehmigt, eine Französisch Ethikkommission. 1. Auswahl eines Side Population (SP) von der Hoechst Dye Efflux Assay <ol><li> Das Anfärben 50 Millionen Zellen mit Hoechst 33342 Farbstoff. <ol><li> Bereiten zwei 15 ml sterile Röhrchen mit konischem Boden: ein Rohr mit &quot;Hoechst&quot; und eine Bezeichnung &quot;Hoechst und Verapamil&quot;. Bereiten Sie 10 ml 5 mM Verapamil-Hydrochlorid-Lösung in sterilem Wasser. Bereiten Sie das Kulturmedium (CM) für Stammzellen. <ol><li> Zur Herstellung von CM für CSC (CM-CSC), vereinige die folgenden: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% fötales Kälberserum (FCS), 0,04 mg / l Hydrocortison , 100 U / ml Penicillin, 0,1 g / l Streptomycin und 20 ug / L des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR). </li></ol></li><li> Unter einem Laminar-Flow-Haube, trypsinize Zellen. Entfernen Sie das Medium, waschen mit sterile phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 1 ml Trypsin-EDTA (0,5 g / L) für einen 75 cm²-Kolben. Inkubieren 3 min bei 37 ° C. Die Reaktion durch Zugabe von Kulturmedium für die elterliche Zelllinie verwendet. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. <ol><li> Um CM für die elterliche Zelllinie (CM-P) vorbereiten, ergänzen DMEM mit 10% FCS, 0,4 mg / l Hydrocortison, 100 U / ml Penicillin und 0,1 g / l Streptomycin). </li></ol></li><li> Verdünne die Zellsuspension in dem Schritt 1.1.2 erhaltenen 10 7 Zellen / ml in CM-P zu erhalten. Spaltete die Zellsuspension in den 2 Röhrchen hergestellt: setzen 100 ul (10 &amp; sup6 ; Zellen) in dem Rohr &quot;Hoechst und Verapamil&quot; und 4 ml (4 x 10 7 Zellen) in dem Rohr &quot;Hoechst&quot;. </li><li> In der Probe &quot;Hoechst und Verapamil&quot;, mit 10 ul 5 mM Verapamil-Hydrochlorid-Lösung (Endkonzentration: 0,5 mM) und vorsichtig mischen. Zugabe von 5 &amp; mgr; l von 1 g / L Hoechst-Lösung (Endkonzentration: 0,1 g / L). In der Probe &amp; #34; Hoechst &quot;, fügen Sie 5 ul 1 g / l Hoechst Lösung pro 10 6 Zellen (200 ul insgesamt) Fortan halten Proben vor direkter Lichteinwirkung geschützt Aluminiumfolie.. </li><li> Inkubieren Alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h 30 min. Vorsichtig mischen alle 15 min zu verhindern, dass Zellen aus sesshaft. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren jedes Pellet mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen. Resuspendieren &quot;Hoechst und Verapamil&quot; Pellet in 500 &amp; mgr; l von 5 mg / L Propidiumiodid (PI) in PBS-Puffer verdünnt und &quot;Hoechst&quot; Pellet in 4 ml von 5 mg / L PI verdünnt in PBS-Puffer. </li><li> Übertragen Probenlösungen durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb Aggregate zu entfernen und einzelne Zellen in Röhrchen für die Probenaufnahme auf dem Durchflusszytometer zu sammeln. Halten Sie Proben auf Eis und schützen vor direkter Lichteinwirkung Aluminiumfolie. </li></ol></li><li> ichsolation der Side Population von Zellsortierung Ohne Hoechst-Farbstoff. <ol><li> Führen Hoechst negative Zell Trennung auf einer Durchflusszytometrie Sortierer mit den folgenden Parametern: UV-Laser (355 nm), 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen Hoechst (450/50 BP) und rot Hoechst (610/20 BP) Filter und 2 Sammler. <ol><li> Zunächst analysieren Probe &quot;Hoechst&quot;, die für die Färbung und Durchflusszytometer Set-up als eine positive Kontrolle dient. </li><li> Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der &quot;Globalen Arbeitsblatt&quot; Fenster, klicken Sie auf &quot;Dot Plot&quot; (fünftes Bild rechts oben) und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen Sie FSC-A (Vorwärtsstreuung) und Abszisse, SSC-A (Seitenstreuung) (Abbildung 1A). In der gleichen Weise, ein SSC-W im Vergleich zu SCC-H-Punktediagramm erstellen. Auf dieser zweiten Punktdiagramm, eine P1 - Region zu erstellen, klicken Sie auf &quot;Polygon gate&quot; (vierzehnten Bild rechts oben) (Abbildung 1B) 33. Hinweis: Der P1 Regioneinzelne Zellen umfassen und Dubletten zu unterscheiden. </li><li> Optional: Ausschließen PI-positiven Zellen durch eine FSC-A im Vergleich zu PI auf P1 gated zu schaffen. Auf dieser Punktdiagramm, wählen Sie die PI-negativen Population (P2) PI positive tote Zellen auszuschließen. </li><li> Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der &quot;Globalen Arbeitsblatt&quot; Fenster, klicken Sie auf &quot;Dot Plot&quot; und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen Sie blau Hoechst-A und Abszisse, rot Hoechst-A. Mit einem Rechtsklick auf die Bevölkerung, wählen Sie &quot;Show Bevölkerung&quot; und P1. Auf dieser Punktdiagramm, erstellen Sie einen Bereich (P2) , die negativen Hoechst - Farbstoff Side Population (SP) Zellen auszuwählen , die auf der linken Seite der Hauptpopulation von Zellen (1C) als Seitenarm erscheint. </li></ol></li><li> Analysieren Sie die Probe &quot;Hoechst&quot; und 10.000 Ereignisse sammeln. Um sicherzustellen, daß das Gate P2, die die SP Population darstellt, gut positioniert ist, analysieren, um die Probe &quot;Hoechst und Verapamil&quot; (10.000 Ereignisse)das Verschwinden von SP Bevölkerung (1D) zu beobachten. </li><li> Sammeln Sie die SP Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in einem 15 ml-Röhrchen mit 1 ml CM-CSC in 1.1.1.1 vorbereitet. </li><li> Am Ende der Zellsortierung, Zentrifuge die Zellsuspension bei 250 × g für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 1 ml CM-CSC. Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen mit einem Zellzähler und übertragen entsprechende Anzahl von Zellen zu einer Kulturflasche (siehe Tabelle 1). In CM-CSC und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 -Atmosphäre. </li><li> Pflegen Zellen in Kultur unter den gleichen Bedingungen für maximal 2 Passagen , bis mindestens 5 x 10 7 Zellen ist (siehe Schritt 3, &quot;Zellkulturverfahren&quot;). </li></ol></li></ol> 2. Auswahl des CD44 - hoch / ALDH hohe Subpopulation in der Side Population Sortiert <ol><li> Das Anfärben 50 Millionen von SP-Zellen mit dem ALDH Detection Kit und CD44 Antikörper. <ol><li> Bereiten sieben 15 ml sterilen Röhrchen wie folgt gekennzeichnet: &quot;Unstained&quot; (a) Das &quot;CD44-APC&quot; (Röhre b) &quot;IgG1-APC&quot; (Röhre c) &quot;ALDH&quot; (U-d), &quot;ALDH und DEAB &quot;(U-e),&quot; ALDH und CD44-APC &quot;(U-f),&quot; ALDH, DEAB und CD44-APC &quot;(Röhre g). Halten Sie alle Rohre und Reagenzien bei 4 ° C während der Färbung. </li><li> Bereiten Puffer A mit 4,5 ml des Puffers 1 (im Kit enthalten) und 45 ul CD44-APC (Allophycocyanin) Antikörper (Verdünnung 1: 100). Bereiten Puffer B mit 100 ul Puffer 1 und 1 ul IgG1-APC-Antikörper (Verdünnung 1: 100). Bereiten Puffer C mit 4 ml Puffer 1 und 20 &amp; mgr; l des Reagenz des Kits. </li><li> Vorbereitung einer Zellsuspension der zuvor sortierten Zellen (Schritt 1.2.5) bei 10 7 Zellen / ml. Füge 100 &amp; mgr; l (10 &amp; sup6 ; Zellen) der Zellsuspension a, b und c zu den Röhrchen und 4 ml (4 x 10 7 Zellen) zu Rohr f. Zur Zeit stellen keine Zellen in Röhrchen d, e und g. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen, die Zellen bei 250 xg für 5 min enthält. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Pellets in Rohren a, b und c in 100 ul Puffer 1. In 5 ul Diethylaminobenzaldehyd (DEAB), eine ALDH-Hemmstoff, um Rohre e und g. <ol><li> Die Zellen in Rohr f mit 4 ml Reagenz C und sofort übertragen, 100 &amp; mgr; l in Röhrchen, d, e und g. Inkubieren Alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min und zum Schutz vor direkter Lichteinwirkung Aluminiumfolie verwendet wird. Mischen Sie die Zellsuspension sanft durch Verwirbelung nach 15 min Zellen zu verhindern Absetzen. </li></ol></li><li> Von diesem Moment an, halten Sie die Röhrchen auf Eis und vor direkter Lichteinwirkung mit Aluminiumfolie geschützt. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 250 g für 5 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren Rohr f in 4 ml und Röhren b und g mit 100 ul Puffer A resuspendieren Rohr c mit 100 &amp; mgr; l Puffer B. Zu den anderen Röhrchen werden 100 &amp; mgr; l Puffer 1 Inkubiere 10 Minuten bei 4 &amp; deg;; C. </li><li> Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 250 g für 5 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Spülen einmal mit 1 ml Puffer 1 (4 ml für Rohr f) und zentrifugiert erneut bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Re-suspendieren Rohr f Pellet in 4 ml und alle anderen Rohre in 1 ml Puffer 1. </li><li> Übertragen Sie die Probenlösungen durch 70 um Zellsiebe Aggregate zu entfernen und einzelne Zellen in geeigneten Röhrchen für die Probenaufnahme auf Durchflusszytometer zu sammeln. </li></ol></li><li> Die Isolierung des CD44 hoch / ALDH hohe Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting. <ol><li> Führen Sie CD44 hoch / ALDH hohe Zelle auf einem Durchflusszytometrie Sortierer mit den folgenden Parametern Sortierung: Blau - Laser (488 nm) und Rot - Laser (633 nm), 1 Detektor auf dem blauen Laser-Pfad mit einem FITC - Filter (530/30), 1 Detektor auf dem roten Laser-Pfad mit einem APC-Filter (660/20) und 2 Sammler. </li><li> Mit Hilfe der cytometer Software, klicken Sie auf &quot;Dot Plot &quot;(das fünfte Bild oben rechts) mit einem FSC-A gegen SSC-A-Dot-Plot zu erstellen, wie in Abschnitt 1.2.1.2 beschrieben, Zellmorphologie zu überprüfen und eine Bevölkerung wählen, bestehend aus einzelnen Zellen mit einem SSC-W gegen SSC-H Punktdiagramm. </li><li> Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der &quot;Globalen Arbeitsblatt&quot; Fenster, klicken Sie auf &quot;Dot Plot&quot; und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen APC-A und Abszisse, FITC-A, um die Doppel gefärbten Bevölkerung zu wählen. Erstellen Sie eine Gate - Rohre d und e zur Wahl von ALDH hohe Zellen (2A) verwendet wird . Hinweis: Positive Zellen verschwinden in Rohr e behandelt mit DEAB (2B). <ol><li> Auf dem gleichen Chart, erstellen Sie eine zweite Gate - Röhren b und c , um unter Verwendung von CD44 hohen Zellen (2C und 2D) zu wählen. Positive Zellen verschwinden in dem Röhrchen, das IgG1-APC. Analysieren Rohre f und g und schaffen ein drittes Tor , das CD44 - hoch / ALDH enthält &lt;sup&gt; Hoch Zellen (Abbildung 2E und 2F). Hinweis: Wenn positive Zellen in dem Rohr vorhanden sind , enthält IgG1-APC (2D), die Wechselwirkung zwischen Zellen und der APC-gefärbten Antikörper nicht spezifisch ist. </li></ol></li><li> Sammeln Sie CD44 hoch / ALDH hohe Zellen in einen 15 - ml - Röhrchen mit 1 ml CM-CSC. Sammeln Sie auch CD44 low / ALDH niedrig in einem 15 - ml - Röhrchen mit 1 ml CM 19. Anmerkung: Bereiten CM-CSC, wie in Schritt 1.1.1.1 beschrieben. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 × g für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 1 ml CM-CSC. Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen. </li></ol></li></ol> 3. Zellkulturverfahren <ol><li> Nach dem zwei Sortierung der Zellen , wie oben beschrieben, bei 37 ° C mit 5% CO 2 die sortierten Zellen in einem geeigneten Kulturkolben (Tabelle 1) mit CM-CSC plattieren. Nach 18 bis 24 Stunden,überprüfen, ob die Zellen anhaften und das Kulturmedium ändern. Ändern des Kulturmedium alle 3 Tage bis die wachsenden Kolonien von mehr als 50% konfluent. </li><li> Verwenden Sie das entsprechende Volumen von Trypsin 0,5 g / l - EDTA (Tabelle 1) Zellen aus der Kulturflasche zu trypsinize. Inkubiere Zellen 3 bis 5 min bei 37 ° C. Fügen Sie das entsprechende Volumen von CM-CSC (Tabelle 1) die Wirkung von Trypsin zu stoppen. </li><li> Zählen der Anzahl von Zellen erhalten wird und die Platte 4 x 10 5 Zellen in einer 175 cm² Kulturflasche mit CM-CSC. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. Bei dieser Konzentration die Zellen mit einer Verdopplungszeit von 24 h werden nach 7 Tagen 70% konfluent sein. </li><li> Verwenden KSZ für in vitro- oder in vivo - Experimente , bevor sie 3 Passagen unterzogen wurden. </li></ol> 4. Bestätigung der Tumorpotenzial und CSC Merkmale <ol><li> Tumor Kugelbildung des Tumors Potential des CD44 - hoch / ALDH zu bestätigenhohe Zellen. <ol><li> Trypsinize Zellen, wie in 3.2 beschrieben. 1 x 10 6 Zellen in ein 15 ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem DMEM: F12 (3: 1) Medium FCS frei, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l Heparin und 1x B27. Inkubiere Zellen in einer 6 - Well - Platten niedrigen Verankerungskulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2. Anmerkung: Mit DMEM: F12 (3: 1) -Medium, enthaltend 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l Heparin und 1x B27 wenn Zelle wachsen nicht ohne FCS. </li><li> Achten Sie auf die Tumorbildung Kugel mit einem optischen Mikroskop von 4 bis 10 Tage nach der Aussaat (3A). Hinweis: Tumor Kugeldurchmesser sollte mehr als 35 um betragen. CD44 hoch / ALDH hohe Zellen zeigen eine schnellere und verbesserte Bildung Kugel Tumor in Bezug auf die Anzahl und Größe im Vergleich zu CD44 low / ALDH niedrig. </li></ol></li><li> Auswertung von In - vivo - Tumorigenität NachDie subkutane Injektion von CD44 hoch / ALDH hohe Zellen in NOD-SCID - Mäusen. <ol><li> Nach dem Sortieren Zellen in PBS bei drei verschiedenen Konzentrationen (10 4 Zellen / ml, 10 5 Zellen / ml und 10 &amp; sup6 ; Zellen / ml) re-suspendieren. Injizieren subkutan 100 &amp; mgr; l von 10 4 Zellen / ml (10 3 Zellen) in dem rechten Flankenbereich von 6 Mäusen. Das gleiche für 10 5 Zellen / ml (10 &amp; sup4 ; Zellen) und 10 6 Zellen / ml (10 5 Zellen). Hinweis: Lower Verdünnungs als 10 3 Zellen getestet werden kann. </li><li> Injizieren Sie die gleiche Konzentration von CD44 low / ALDH niedrigen Zellen in der linken Flankenbereich. Monitor - injizierten Mäusen für bis zu 10 Wochen , um zu sehen Tumorprogression 19. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die erfolgreiche Isolierung von CSCs aus einer bestimmten Zelllinie, die auf andere HNSCC Zelllinien anwendbar ist. Isolierte Kopf und Hals CSCs eignen sich dann für die weitere molekulare Charakterisierung in vitro und funktionale Validierung durch Transplantation in immundefizienten Mäusen 19. Allerdings können einige Änderungen in Abhängigkeit von der Seiten Bevölkerung getestet werden oder die CD44 hoch / ALDH hohen P...

Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist eine häufige Malignität weltweit und trotz der Fortschritte bei laufenden Behandlungen, Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung haben eine schlechte Prognose. Die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate des Patienten liegt bei etwa 30% trotz der Kombination von therapeutischen Ansätzen, einschließlich der Operation, Chemo-Strahlentherapie und gezielte-Therapien. Jüngste Studien Attribut Lokalrezidiv und Fernmetastasen auf das Überleben von Krebsstielartigen Zellen (CSCs) im Anschluss an Anti - Krebs - Therapien 1. Es gibt vermehrt Beweise für die Existenz von präsentierenden Zellen Stammzellen Eigenschaften (undifferenzierten Status, Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazitäten und Telomerase - Aktivität) in verschiedenen soliden Tumoren wie Brust-, Hirn-, Prostata-, Lungen-, Dickdarm-, Pankreas, Leber und Haut unterstützen 2- 10. Jedoch bleibt der Ursprung des CSCS unklar 11,12. Sie können sich von der malignen Transformation von normalen Stammzellen 3,13 oder dedifferen führenhandlungen von Tumorzellen , die 14,15 CSCs-ähnliche Funktionen zu erwerben. Daher unverwechselbare Wege Verständnis zu CSCs Zusammenhang wird Einblick in die frühe Diagnose und Behandlung von resistenten HNSCC bieten. Es wurde vorgeschlagen , dass CSCs auch resistent Phänotypen besitzen , die Standard - Chemotherapie und Strahlentherapie entziehen, was zu einer Tumorrückfall im Vergleich zu der Masse der Tumorzellen 16-19 und sind lokalisiert in hypoxischen Nischen 20. Zahlreiche Faktoren haben diese Widerstände von CSCs, wie Neigung zur Ruhe, erhöhte DNA - Reparatur, hochreguliert Zellzyklus - Kontrollmechanismen und Radikalfänger 21 zu erklären vorgeschlagen. Darüber hinaus können mehrere onkogene molekularen Wege speziell in CSCs 17 aktiviert werden. Um weitere gezielte-Therapien Wissen von CSCs zu verbessern, brauchen wir zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs, ist wegen der Heterogenität der Stammzellbezogenen Marker inverschiedene Arten von Krebserkrankungen 22. In HNSCC, stielartigen Tumor-initiierenden Zellen von primären Patienten Tumoren isoliert wurden durch Zellen, die unterschiedliche CSC - Biomarker (wie Drogen Efflux - Transporter Ausdruck 23, CD44 hoch, CD24 niedrig CD133 hoch, c-Met + Phänotyp 10,24 Sortierung, 25 oder ALDH hohe Aktivität 26) oder primären Patiententumor Kultivierung squamospheres zu bilden , die CSC - Eigenschaften haben. Dennoch nimmt die Anzahl der squamospheres dramatisch nach zwei Durchgängen, so dass eine kleine Stichprobengröße für die weitere Charakterisierung geben 27 studiert. Daher werden in - vitro - Assays von etablierten Zelllinien beginnt , ist eine einfachere Lösung Experimente zu entwerfen , um Wissen von CSCs zu verbessern. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren vorzuschlagen CSCs von HNSCC Zelllinien multiparametrischer durchflusszytometrische Analyse ein zu isolierennd Zellsortierung. Die Expression von CD44 in Korrelation mit mehreren CSCs Eigenschaften einschließlich ALDH-Aktivität, Side Population (SP) Phänotyp, sind Sphäroidformation Fähigkeit und tumorigenicity verwendet, um dieses Subpopulation von CSCs zu isolieren und zu charakterisieren. CD44 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, ist in der Zelladhäsion und Migration beteiligt. CD44 wird in hohem Grade in vielen soliden Tumoren CSCs 28 ausgedrückt, auch in Kopf- und Halskrebs Modelle 29-31. Darüber hinaus können CD44 hohe Zellen in vivo einen heterogenen Tumor während CD44 niedrigen Zellen erzeugen kann nicht 10. Der SP - Test wird auf dem Differenzpotential von Zellen auf der Basis des Hoechst - Farbstoff 22 über die ATP-bindenden Kassette (ABC) Familie von Transporterproteine ​​überexprimiert in der CSC - Membran zu Ausströmen. Dieser Test umfasst die Verwendung von ABC-Transporter-Inhibitoren wie Verapamil in Kontrollproben. Aldehyddehydrogenase (ALDH) ist ein intrazelluläres Enzym, das bei der Umwandlung von Retinol beteiligt ist zu retinoic Säure während der frühen Differenzierung von Stammzellen 25,26. Die Zellen , die hohe ALDH Aktivität zeigen stielartigen Zellverhalten in HNSCC 26 und eine sehr geringe Anzahl von ALDH hohe Zellen zeigen können Tumoren in vivo 26,32 zu erzeugen. Die Kombination dieser Marker und die Eigenschaften wurde erfolgreich von Bertrand e t al. , Den Widerstand in vitro zu untersuchen und in vivo dieser CSCs zu Photonen- und Kohlenstoffionenstrahlung 19. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Kombination von verschiedenen Zellmarkern und Eigenschaften sind selektiver für nützliche Untersuchungen über HNSCC CSCs Populationen als single-Marker Ansätze.

<table><tbody><tr><td>Fötales Kälberserum Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison wasserlöslich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nussmischung (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>Die Lösung muss kurz vor Gebrauch zubereitet werden, da sie sehr instabil</td></tr><tr><td>ist Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Ätzend, akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) Kategorie 4</td></tr><tr><td>Verapamilhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) Kategorie 3</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) Kategorie 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stammzelle</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, humaner Antikörper</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, humaner Antikörper</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Scharpartikel</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B Zelllinie</td><td>Geschenk von John Little' s</td> <td>Labor-FaDu</td><td></td></tr> <tr><td>Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Niedrige Verankerungsplatten</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung eines kopf-hals-plattenepithelkarzinom subpopulation nach stammzelleigenschaften

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Trotz der Fortschritte im Verständnis von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) Progression, die Fünf-Jahres-Überlebensrate niedrig bleibt aufgrund der lokalen Rezidiven und Fernmetastasen. Eine Hypothese diese Wiederholung zu erklären, ist das Vorhandensein von Krebs stielartigen Zellen (CSCs), die mit inhärenten Chemo- und Radioresistenz vor. Um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, ist es notwendig, experimentelle Modelle zu haben, die die Wirksamkeit von gezielten Behandlungen zu validieren und somit zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs zu haben. Zu diesem Zweck stellen wir ein Protokoll für die Isolierung des CSCS aus humanen HNSCC Zelllinien, die auf der Kombination von zwei aufeinanderfolgenden Zell Sortierungen durchgeführt durch Fluoreszenz-aktivierte Zell beruht Sortierung (FACS). Die erste ist auf dem Grundstück von CSCs basiert überexprimiert ATP-Binding Cassette (ABC) Transporterproteine ​​und damit ausschließen, unter anderem lebenswichtige DNA-Farbstoffe wie Hoechst 33342. Die Zellen mit th sortiertwird Verfahren werden als &quot;Side Population&quot; (SP) identifiziert. Da die SP-Zellen einen geringen Anteil (&lt;5%) der parentalen Zellen darstellen, eine Wachstumsphase erforderlich, um ihre Anzahl vor dem zweiten Zellsortierung zu erhöhen. Der nächste Schritt ermöglicht die Selektion von Zellen , die zwei anderen HNSCC Stammzelleigenschaften wie zB hohe Expressionsniveau der Zelloberflächenmarker CD44 (CD44 hoch) und die Überexpression von Aldehyd - Dehydrogenase (ALDH hoch) besitzen. Da die Verwendung eines einzigen Marker zahlreiche Einschränkungen und Gefahren für die Isolierung von CSCs hat, liefert die Kombination von SP, CD44 und ALDH-Marker ein nützliches Werkzeug, um CSCs für weitere analytische und funktionelle Assays erfordern lebenden Zellen zu isolieren. Die stielartigen Eigenschaften des CSCS wurde schließlich in vitro durch die Bildung von tumorispheres und die Expression von β-Catenin validiert.

Die Isolierung von CSCs von HNSCC Zelllinien benötigt, um zwei aufeinanderfolgende Sortierung wegen des sehr geringen Anteil an CSCs in der elterlichen Zelllinie. Die erste Sortierung wurde auf die Fähigkeit von CSCs Basis des Hoechst-Farbstoff wegen Drogen Efflux-Transporter auszuschließen. Dies resultierte in Erwerb von 1-5% der Gesamtzellpopulation sortiert (Abbildung 1). Während der Hoechst - Farbstoff negativen Zellsortierung, überprüfen Sie die Größe und die Granul...

Das Verständnis der Rolle von Krebsstammzellen beim Wiederauftreten von Tumoren und der Resistenz gegen Therapien ist in den letzten zehn Jahren zu einem Thema von großem Interesse geworden. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung und Charakterisierung der Subpopulation von Krebsstammzellen aus Plattenepithelzelllinien des Kopf- und Halses (HNSCC).

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Krebsstammzellen aus Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom- oder HNSCC-Zelllinien zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbehandlung zu beantworten, insbesondere wie Chemotherapie eingesetzt werden kann, um die Strahlenresistenz von Tumoren zu überwinden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Kombination von Markern verwendet, um eine hohe Spezifität bei der Isolierung von Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien zu erreichen.Die Durchführung des Verfahrens wird von Prescillia Battiston-Montagne, unserer Technikerin, und Marion Gilormini, einer Doktorandin aus meinem Labor, übernommen. Um eine Side-Population von krebsstammähnlichen Zellen mittels Hoechst-Farbstoff-Efflux-Assay auszuwählen, beschriften Sie zunächst ein kegelförmiges Reagenzglas mit „Hoechst“ und ein weiteres mit „Hoechst und Verapamil“. Anschließend waschen Sie eine HNSCC-Zellkultur mit steriler PBS, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Tripsyn-EDTA.Nach drei Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit frischem Zellkulturmedium stoppen und die Zellen zählen. Die Kultur auf 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter verdünnen und komplettes Medium für die parentale Zelllinie hinzufügen. Anschließend 100 Mikroliter in das Hoechst- und Verapamil-Röhrchen sowie vier Milliliter Zellen in das Hoechst-Röhrchen geben.Danach vorsichtig 10 µL einer fünf Millimolar starken Verapamilhydrochlorid-Lösung in die Hoechst- und Verapamil-Probe sowie fünf µL Hoechst pro eine mal 10 hoch 6 Zellen in beide Röhrchen geben. Anschließend die Proben mit Aluminiumfolie abdecken und für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, wobei alle 15 Minuten vorsichtig gemischt wird. Danach die Röhrchen zentrifugieren und die Pellets in zwei Milliliter PBS resuspendieren.Nach einer Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet aus Hoechst und Verapamil in 500 Mikrolitern Propidiumiodid in PBS und das Hoechst-Pellet in vier Millilitern desselben. Filtern Sie die Proben anschließend durch 70-Mikrometer-Zellseihen in FACS-Röhrchen, um Aggregate zu entfernen, und stellen Sie die Proben lichtgeschützt auf Eis. Laden Sie danach die Hoechst-Probe in den Durchflusszytometer und öffnen Sie das Globale Arbeitsblatt-Fenster in der Software des Durchflusszytometers.Klicken Sie auf „Dot Plot“, um ein Diagramm im globalen Arbeitsblatt zu erstellen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Parameter für Streuung vorwärts und seitlich auszuwählen. Erstellen Sie auf die gleiche Weise ein Dot Plot mit seitlicher Streuung (Breite) gegen seitliche Streuung (Höhe) und klicken Sie anschließend auf „Polygon Gate“, um im zweiten Diagramm einen P1-Bereich zu definieren, um Einzelzellen auszuwählen und Doppelzellen auszuschließen. Erstellen Sie danach ein Dot Plot mit rotem Hoechst-Flächenbereich gegen blauen Hoechst-Flächenbereich und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zellen, um die P1-Population hervorzuheben.Erstellen Sie anschließend einen P2-Bereich, um die negative Seite der mit Hoechst gefärbten Zellpopulation auszuwählen, die als seitlicher Ausläufer links von der Hauptpopulation der Zellen erscheint, und sammeln Sie 10.000 Ereignisse der Hoechst-Probe. Um zu bestätigen, dass das P2-Tor, das die Seitenpopulation darstellt, korrekt positioniert ist, sammeln Sie zusätzlich 10.000 Ereignisse der Hoechst- und Verapamil-Probe. Die Seitenpopulation sollte daraufhin verschwinden.Sortieren Sie anschließend die Side-Population der Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das ein Milliliter vollständiges Medium für krebsstammähnliche Zellen enthält. Am Ende des Sortiervorgangs werden die Zellen abzentrifugiert und das Pellet der Side-Population in ein Milliliter frischem, vollständigem Medium für krebsstammähnliche Zellen resuspendiert. Anschließend die Zellen zählen und in der geeigneten Anzahl in einen neuen Zellkulturgefäß säen.Um den CD44-hoch/ALDH-hoch-Teilpopulation aus den sortierten Side-Population-Zellen auszuwählen, beschriften Sie zunächst sieben sterile kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen wie angegeben. Verdünnen Sie anschließend die sortierten Zellen auf eine Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter in Stammzellmedium und pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellen in die unbehandelten CD44-APC- und IgG1-APC-Röhrchen sowie vier Milliliter Zellen in das ALDH- und CD44-APC-Röhrchen, jeweils auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets aus den unbehandelten CD44-APC- und IgG1-APC-Röhrchen in jeweils 100 Mikrolitern Puffer 1 aus dem ALDEFLUOR-Kit.Fügen Sie anschließend fünf µL des ALDH-Inhibitors DEAB zu den ALDH- und DEAB- sowie ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen im ALDH- und CD44-APC-Röhrchen in vier mL Reagenz C, das vier mL Puffer 1 und 20 µL des Reagenzes aus dem Kit enthält, und übertragen Sie unverzüglich 100 µL dieser Zellen in die ALDH-, ALDH- und DEAB- sowie ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen. Anschließend alle Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 °C stellen, dabei vor Licht geschützt halten und die Proben nach 15 Minuten durch vorsichtiges Vortexen mischen.Am Ende der Inkubation alle Proben zentrifugieren und die Überstände verwerfen. Anschließend alle Röhrchen auf Eis stellen und das Pellet aus ALDH und CD44-APC in vier Milliliter Puffer A resuspendieren, die CD44-APC- und ALDH-DEAB- sowie die CD44-APC-Pellets in jeweils 100 Mikroliter desselben Puffers. Das IGG1-APC-Pellet in 100 Mikroliter Puffer B resuspendieren und die unbehandelten ALDH- sowie ALDH- und DEAB-Röhrchen in jeweils 100 Mikroliter Puffer eins.Nach 10 Minuten alle Proben erneut centrifugieren und anschließend mit 1 Milliliter Puffer eins waschen, wobei die Probe mit ALDH und CD44-APC mit 4 Milliliter Puffer eins gewaschen wird. Nach der zweiten Centrifugation alle Pellets in 1 Milliliter frischem Puffer eins resuspendieren, außer die Probe mit ALDH und CD44-APC, die in 4 Milliliter Puffer eins resuspendiert wird. Laden Sie nun die Probe mit ALDH und CD44-APC in den Durchflusszytometer und erstellen Sie ein APC-gegen-FITC-Dotplot, um die doppelt gefärbte Population zu visualisieren.Laden Sie anschließend das ALDH-Röhrchen, um ein Tor für ALDH-hohe Zellen zu erstellen. Die positiven Zellen sollten verschwinden, wenn das ALDH- und DEAB-Röhrchen geladen wird. Erstellen Sie im selben Diagramm ein zweites Tor unter Verwendung der CD44-APC- und IGG1-APC-Röhrchen, um die CD44-hohen Zellen auszuwählen.Die positiven Zellen verschwinden, wenn das IGG1-APC-Röhrchen beladen wird. Danach beladen Sie die ALDH- und CD44-APC- sowie die ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen, um ein drittes Tor zu erstellen, das die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen einschließt. Verwenden Sie das doppelt gefärbte ALDH-CD44-Röhrchen, um das letzte Tor auf den doppelt positiven Zellen zu positionieren.Sortieren Sie anschließend die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das ein Milliliter vollständiges Medium für krebsspezifische Stamm-ähnliche Zellen enthält, und sammeln Sie die CD44-niedrig/ALDH-niedrig-Zellen nach Bedarf in ein Milliliter vollständiges Zellkulturmedium. Nach der zweiten Sortierung werden die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen in einen geeigneten Zellkulturkolben mit vollständigem Medium für krebsspezifische Stamm-ähnliche Zellen gegeben und im Zellkulturgehäuse 18 bis 24 Stunden inkubiert. Sobald die Zellen am Boden des Kolbens angeheftet sind, wechseln Sie das Kulturmedium und stellen Sie den Kolben erneut in den Inkubator.Um das Tumorpotenzial der CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen zu bestätigen, die krebsstammähnliche Monoschicht wie gezeigt mit Trypsin behandeln, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und 1 × 10⁶ Zellen in ein 15-milliliter-Konischglas überführen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen das Zellpellet in serumarmem Medium resuspendieren, das mit rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor, Heparin und B27 ergänzt wurde, und die Zellen in einer niedrig haftenden Petrischale im Zellkulturtinkubator inkubieren, bis Tumorsphäroide mittels optischer Mikroskopie nachgewiesen werden. Wenn die Sortierung zum ersten Mal an einer neuen Zelllinie durchgeführt wird, ist es notwendig, das Tumorpotenzial der Zelllinie zu bestätigen, das sich durch die Fähigkeit zur Bildung von Tumorsphäroiden in serumfreiem Medium in vitro zeigt.Außerdem sollte die QPCR eine hohe Expression von Beta-Catenin und anderen Stammzell-ähnlichen Markern durch die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen nachweisen. Die CD44-hoch/ALDH-hoch-Zellen sollten außerdem in der Lage sein, bei Injektion in geringen Mengen im Vergleich zu CD44-niedrig/ALDH-niedrig-Zellen Tumoren *in situ* zu bilden. Wenn der Vorgang einmal beherrscht ist, sollte jede Zellsortierung innerhalb von fünf Stunden abgeschlossen werden können, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die mit Fluorochrom markierten Proben vor direkter Lichteinwirkung zu schützen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Invasion-Migrations-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Beteiligung von Krebsstammzellen am metastatischen Prozess zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, die Mechanismen der Tumorausweichung beim HNSCC-Krebs zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien mittels multiparametrischer, durchflusszytometrischer Analyse und Zellsortierung isoliert. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Tumorzellen und interkalierenden DNA-Agenzien äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine Abschottung mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung von Krebsstammzellen Migration beschrieben. Diese neuartige Plattform schafft eine tragfähige zellulären Mikroumgebung und ermöglicht mikroskopische Visualisierung der lebenden Zelle Fortbewegung. Höchst beweglich Krebszellen isoliert sind, um molekularen Mechanismen von aggressiven Infiltration, was möglicherweise zur wirksameren zukünftige Therapien.

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

In diesem Video beschreiben wir die Isolierung einer Subpopulation von Krebsstammzellen aus Plattenepithelzelllinien im Kopf- und Halsbereich mit Hilfe des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers oder FACS. Die isolierte Seitenpopulation von Zellen kann für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Cancer Side Population Discrimination Assay: Eine Methode zur Isolierung von krebsstammähnlichen Zellen mit dem Hoechst Dye Efflux Assay

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Die Isolierung von Krebsstammzellen (KSZ), die direkt aus menschlichen Geweben ist Voraussetzung für ihre biologische Charakterisierung. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Isolierung von Prostata-Krebsstammzellen aus menschlichen Geweben, aber auch mit Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

In-vitro-Kugel-Assays werden häufig verwendet, um Krebsstammzellen zu identifizieren. Hier vergleichen wir Einzel- mit Multizell-basierten Kugel-Assays. Die aufwendigeren einzelzellbasierten Assays oder die Methylcellulose-Supplementierung liefern genauere Ergebnisse, während mehrzellige Assays, die in flüssigem Medium durchgeführt werden, stark von der Zelldichte beeinflusst werden können.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Pankreaskrebs-Stammzellen (CSCs) können in vitro mit der Verankerungsunabhängigen Kugelkulturtechnik vermehrt werden, die ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der CSC-Biologie darstellt und als erster Schritt zur Entwicklung neuartiger CSC-Targeting-Therapien dienen kann. Hier wird die Methodik für die Erweiterung, Analyse und das Targeting von Pankreas-CSCs bereitgestellt.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (KSZ) in Knochensarkomen kürzlich ihrer Pathogenese in Verbindung gebracht worden. In diesem Artikel stellen wir die Isolierung des CSCS aus primären Zellkulturen aus humanen Biopsien herkömmlicher Osteosarkom (OS) mit der Fähigkeit des CSCS erhalten unter nichtadhärenten Bedingungen zu wachsen.

Gründung der Krebszellkulturen von Human Konventionelle Osteosarkom Stem

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Isolierung tumorinitiierender Zellen aus humanen Sarkom-Patienten-patienten-abgeleiteten Xenografts durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, unter Verwendung des humanen Leukozyten-Antigens-1 (HLA-1) als negativem Marker, und für die weitere Validierung und Charakterisierung dieser HLA-1-negativen tumorinitiierenden Zellen.

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Lernen Sie die Isolierung von Krebsstammzellen aus Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom-Zelllinien mittels Hoechst-Farbstoff-Assay und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von CD44-hoch/ALDH-hoch Zellpopulationen für die Tumorforschung.

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

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