Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Krebsstammzellen aus Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses oder HNSCC-Zelllinien zu isolieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsbehandlung zu beantworten, wie Chemotherapie zur Überwindung des Strahlenwiderstands von Tumoren eingesetzt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Kombination von Markern verwendet, um eine hohe Spezifität in Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien zu erreichen.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Prescillia Battiston-Montagne, unserer Technikerin, und Marion Gilormini, einer Doktorandin aus meinem Labor, durchgeführt. Um eine Seitenpopulation von Krebsstammzellen mit dem Hoechst-Farbstoff-Efflux-Assay auszuwählen, markieren Sie zunächst ein konisches Röhrchen von Hoechst und ein von Hoechst und Verapamil. Waschen Sie anschließend eine HNSCC-Zellkultur mit sterilem PBS, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Tripsyn EDTA.

Nach drei Minuten bei 37 Grad Celsius wird die Reaktion mit frischem Zellkulturmedium gestoppt und die Zellen gezählt. Verdünnen Sie die Kultur auf eins mal 10 bis siebte Zellen pro Milliliter und vervollständigen Sie das Medium der elterlichen Zelllinie. Geben Sie dann 100 Mikroliter in das Hoechst- und Verapamil-Röhrchen und vier Milliliter Zellen in das Hoechst-Röhrchen.

Als nächstes mischen Sie vorsichtig 10 Mikroliter einer fünf millimolaren Verapamilhydrochloridlösung in die Hoechst- und Verapamil-Probe, gefolgt von fünf Mikrolitern Hoechst pro einmal 10 bis den sechsten Zellen in beide Röhrchen. Decken Sie dann die Proben mit Alufolie ab und legen Sie sie bei 37 Grad Celsius ab. Nach 90 Minuten mit sanftem Mischen alle 15 Minuten zentrifugieren Sie die Röhrchen und resuspendieren die Pellets in zwei Millilitern PBS.

Nach einer Zentrifugation in der Mitte resuspendieren Sie das Hoechst- und das Verapamil-Pellet in 500 Mikrolitern Propidiumiodid in PBS und das Hoechst-Pellet in vier Millilitern desselben. Filtern Sie nun die Proben durch 70-Mikron-Zellsiebe in FACS-Röhrchen, um alle Aggregate zu entfernen, und legen Sie die Proben auf lichtgeschütztes Eis. Laden Sie anschließend die Hoechst-Probe auf das Durchflusszytometer und öffnen Sie das Fenster Globales Arbeitsblatt in der Durchflusszytometer-Software.

Klicken Sie auf Punktdiagramm, um ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt zu erstellen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung auszuwählen. Erstellen Sie auf die gleiche Weise ein Seitenstreudiagramm, das um ein Punktdiagramm mit Seitenpunkthöhe breit ist, und klicken Sie dann auf Polygon-Gate, um einen P1-Bereich im zweiten Diagramm zu erstellen, um die einzelnen Zellen auszuwählen und die Dubletten zu unterscheiden. Erstellen Sie als Nächstes ein rotes Hoechst-Gebiet durch ein blaues Hoechst-Gebiets-Punktdiagramm und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zellen, um die P1-Population hervorzuheben.

Erstellen Sie dann einen P2-Bereich, um die negative Hoechst-Farbstoffseitenpopulation von Zellen auszuwählen, die als Seitenarm links von der Hauptzellpopulation angezeigt wird, und erfassen Sie 10.000 der Hoechst-Probenereignisse. Um zu bestätigen, dass das P2-Gate, das die Seitenpopulation darstellt, korrekt positioniert ist, sammeln Sie ebenfalls 10.000 Hoechst- und Verapamil-Probenereignisse. Die Seitenbevölkerung sollte verschwinden.

Sortieren Sie dann die Seitenpopulation der Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter vollständiges krebsstammähnliches Zellmedium enthält. Am Ende der Sortierung schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren das Pellet der Seitenpopulation in einem Milliliter frischem, vollständigem Krebsstammzellmedium. Zählen Sie dann die Zellen und säen Sie sie in der entsprechenden Anzahl in einen neuen Zellkulturkolben aus.

Um die CD44-hohe/ALDH-hohe Untergruppe aus den sortierten Seitenpopulationszellen auszuwählen, markieren Sie zunächst sieben sterile konische 15-Milliliter-Röhrchen wie angegeben. Als nächstes verdünnen Sie die sortierten Zellen auf eins mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in Stammzellmedium und aliquotieren Sie 100 Mikroliter Zellen in die ungefärbten CD44-APC- und IGG1-APC-Röhrchen und vier Milliliter Zellen in das ALDH- und CD44-APC-Röhrchen, alles auf Eis. Schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie die ungefärbten CD44-APC- und IGG1-APC-Pellets in 100 Mikrolitern Puffer eins aus dem ALDEFLUOR-Kit.

Geben Sie dann fünf Mikroliter des ALDH-Inhibitors DEAB in die Röhrchen ALDH und DEAB sowie ALDH DEAB und CD44-APC. Resuspendieren Sie die Zellen im ALDH- und CD44-APC-Röhrchen in vier Millilitern Reagenz C, das vier Milliliter Puffer eins und 20 Mikroliter des Reagenzes aus dem Kit enthält, und überführen Sie sofort 100 Mikroliter dieser Zellen in die ALDH-, ALDH- und DEAB- sowie ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhrchen. Legen Sie dann alle Röhrchen für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, das vor Licht geschützt ist, und mischen Sie die Proben nach 15 Minuten durch sanftes Vortexen.

Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie alle Proben und verwerfen die Überstände. Legen Sie dann alle Röhrchen auf Eis und resuspendieren Sie das ALDH- und CD44-APC-Pellet in vier Millilitern Puffer A, ein CD44-APC- und ALDH-DEAB- und CD44-APC-Granulat in 100 Mikrolitern desselben. Resuspendieren Sie das IGG1-APC-Pellet in 100 Mikrolitern Puffer B und die ungefärbten ALDH- und ALDH- und DEAB-Röhrchen in 100 Mikrolitern Puffer eins.

Nach 10 Minuten werden alle Proben erneut heruntergeschleudert, gefolgt von einem Waschen in 1 Milliliter Puffer eins für alle Proben mit Ausnahme der ALDH- und CD44-APC-Probe, die in vier Millilitern Puffer eins gewaschen wird. Nach der zweiten Zentrifugation werden alle Pellets in einem Milliliter frischem Puffer eins resuspendiert, mit Ausnahme der ALDH- und CD44-APC-Probe, die in vier Millilitern Puffer eins resuspendiert wird. Laden Sie nun das ALDH- und CD44-APC-Rohr auf das Durchflusszytometer und erstellen Sie ein APC-by-Fitsy-Punktdiagramm, um die doppelt gefärbte Population zu visualisieren.

Laden Sie als Nächstes die ALDH-Röhre, um ein Gate für ALDH-hohe Zellen zu erstellen. Die positiven Zellen sollten verschwinden, wenn die ALDH- und DEAB-Sonde geladen wird. Erstellen Sie im selben Diagramm ein zweites Gate mit den CD44-APC- und IGG1-APC-Röhren, um die CD44-High-Zellen auszuwählen.

Die positiven Zellen verschwinden, wenn die IGG1-APC-Röhre geladen wird. Laden Sie dann die ALDH- und CD44-APC- und ALDH-DEAB- und CD44-APC-Röhren, um ein drittes Gate zu erstellen, das die CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen enthält. Verwenden Sie ein doppelt gefärbtes ALDH-CD44-Röhrchen, um das letzte Gate auf den doppelt positiven Zellen zu positionieren.

Sortieren Sie dann die CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter vollständiges krebsstammähnliches Zellmedium enthält, und sammeln Sie die CD44-niedrigen/ALDH-niedrigen Zellen in einem Milliliter vollständigem Zellkulturmedium wie gewünscht. Nach der zweiten Sortierung werden die CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen 18 bis 24 Stunden lang im Zellkulturinkubator in einen geeigneten Zellkulturkolben mit vollständigem krebsstammähnlichen Zellmedium gefüllt. Wenn sich die Zellen am Boden des Kolbens festgesetzt haben, wechseln Sie das Nährmedium und stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator.

Um das Tumorpotenzial der CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen zu bestätigen, trypsinisiert man die krebsstammartige Monoschicht, wie gezeigt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und überträgt sie einmalig 10 auf die sechs Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Schleudern der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in einem serumarmen Medium, das mit rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor Heparin und B27 ergänzt ist, und inkubieren Sie die Zellen in einer Petrischale mit niedriger Verankerung im Zellkultur-Inkubator, bis Tumorkugeln durch optische Mikroskopie beobachtet werden. Wenn die Sortierung zum ersten Mal an einer neuen Zelllinie durchgeführt wird, ist es notwendig, das Tumorpotenzial der Zelllinie zu bestätigen, was sich in ihrer Fähigkeit zeigt, Tumorkugeln in serumfreiem Medium in vitro zu bilden.

Darüber hinaus sollte die QPCR eine hohe Expression von Beta-Catenin und anderen stammähnlichen Zellmarkern durch die CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen zeigen. Die CD44-hohen/ALDH-hohen Zellen sollten auch in situ in der Lage sein, Tumore zu bilden, wenn sie in geringen Mengen injiziert werden, im Vergleich zu CD44-niedrigen/ALDH-niedrigen Zellen. Einmal gemeistert, sollte jede Zellsortierung in fünf Stunden abgeschlossen werden können, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die mit Fluorochrom markierten Proben vor direkter Lichteinwirkung zu schützen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Invasionsmigrationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Beteiligung von Krebsstammzellen am Metastasierungsprozess zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Krebses, um die Mechanismen der Tumorflucht bei HNSCC-Krebs zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Krebsstammzellen aus HNSCC-Zelllinien mithilfe multiparametrischer, durchflusszytometrischer Analyse und Zellsortierung isoliert werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tumorzellen und das Interkalieren von DNA-Wirkstoffen äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen getroffen werden sollten.