Name: Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Erfahren Sie die intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mäusen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. Diese effiziente Methode ermöglicht die direkte Analyse immunologischer Reaktionen im unteren Respirationstrakt.

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Wir danken Dr. Carson Harrod für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Herrn Minghui Zeng und Dr. Mahesh Kathania und Dr. Prashant Khare für ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Cancer Society (Research Scholar Grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) und des Sammons Cancer Center (Pilot Project Grant) an K. Venuprasad unterstützt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von Baylor Research Institute durchgeführt. 1. Anzucht nicht typisierbaren Haemophilus influenzae (NTHi) und Vorbereiten des Inokulums <ol><li> Platte NTHi auf einem Schokolade - Agar - Platte und halten die Platte den Kopf in einem befeuchteten CO 2 Inkubator über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. Am folgenden Tag Kultur der Bakterien in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe. Dann fügen Sie 1 ml der Brühe in eine sterile 1,5 ml-Tube. </li><li> Zentrifuge bei 4.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Dann wird der Überstand verworfen und erneut zu suspendieren, das Pellet in 1 ml sterile 1x PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l der resuspendierten Lösung in 900 ul 1x PBS und Messen der Extinktion der verdünnten Kultur bei 600 nm Wellenlänge in einem Spektrophotometer. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und die Kolonie bildende Einheits (CFUs) des Inokulums durch Züchten 01.10 Reihenverdünnungen auf Schokolade - Agarplatten und über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert. </li><li> Bezogen auf die Lebensfähigkeit und die CFUs aus dem vorherigen Schritt bestimmt wird , das Inokulum auf eine Endkonzentration von 20 x 10 6 CFU / ml einzustellen. </li></ol> 2. intratracheale (it) Einträufeln <ol><li> Injizieren Sie die Maus intraperitoneal (ip) mit 0,1 ml / 10 g Körpergewicht der Maus mit einer 150 mg / ml Ketamin + 20 mg / ml Xylazin Lösung. Das Verfahren sollte mit einer Lichtquelle in der Haube getan werden, um das Tier warm zu halten. </li><li> Drücken Sie den Zehenzwischenraum der Maus, um zu überprüfen, dass die Maus ausreichend betäubt. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken. Shave den ventralen Bereich des Halses und desinfizieren mit Chlorhexidin und 70% Ethylalkohol. </li><li> Heben Sie die Haut des oberen ventralen Teil des Halses unter Verwendung von Rattenzahnzange. Machen Sie einen kleinen Schnitt (0,5-1,0 cm) über dem Thymus mit einem Skalpellund sorgfältig den Muskel sezieren, um die Luftröhre aus. <ol><li> Unter Verwendung einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel, die Injektion sollte langsam 0,05 ml Luft, gefolgt von 0,05 ml NTHi erhalten von Abschnitt 1 oder Salzlösung als Kontrolle, gefolgt von einem weiteren 0,05 ml Luft. Halten Sie Tier vertikal für ca. 1 min. </li></ol></li><li> Schließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Klebstoff. Halten Sie die Maus seitlich liegend und warm für ca. 10 min. </li></ol> 3. BALF Sammlung <ol><li> Opfere die Maus durch Genickbruch 24 Stunden nach der Infektion. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhöhle der Maus mit anatomischen Schere und schneiden Sie die Bauchaorta zu bluten. Setzen Sie das ventrale Teil der Lunge. </li><li> Setzen Sie die Luftröhre und intubieren es mit einem 20-Gauge-Katheter. Instill 0,8 ml BALF Puffer (1x PBS, 0,1% Dextrose, 10 U / ml Heparin) und die Spülung durch leichtes Ansaugen sammeln. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li><li> Zählen der Gesamtzahl der Zellen in 100 &amp; mgr; l BALF Suspension unter Verwendung eines hemocytoMeter unter 10-facher Vergrößerung mit Trypan-Blau-Färbung. </li><li> Bereiten Sie Folien für modifizierte Giemsa. Aliquot 100 ul BALF in die entsprechenden Vertiefungen der Cytospin und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Trocknen der Objektträger für 10 min und färben die Zellen modifiziert Giemsa-Färbung unter Verwendung von nach Protokollen des Herstellers. </li><li> Verwenden , um die verbleibenden Zellen für eine nachfolgende Analyse, wie beispielsweise Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung (FACS), die konfokale Mikroskopie, die Genexpression und die Western - Blot - 11-13. </li></ol> 4. Histopathologie Vorbereitung <ol><li> Für histopathologische Analyse, infizieren Mäuse mit NTHi wie in Schritt 2.4 beschrieben. Nach 24 Stunden der Infektion opfern, um die Tiere durch Genickbruch. Schneiden Sie die Brusthöhle mit anatomischen Schere öffnen die Lunge und die Luftröhre freizulegen, wie bereits erwähnt. Dann legen Sie die 20-Gauge-Katheter in die Trachea. </li><li> Füllen Sie die Lunge mit 2% warme Agarose-Lösung in 4% Formalin präpariert. Sobald derLungen sind voll aufgeblasen, statt Eis auf der Oberseite der Lunge die Agarose-Lösung zu verfestigen. </li><li> Dann entfernen Sie vorsichtig die Brust Stecker und steckte es in eine 50 ml-Lösung von 4% Formalin in 1x PBS, bis sie für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Abschnitte verarbeitet wird. </li></ol> 5. FACS Zellen in der BALF Anfärben <ol><li> Stellen 1 x 10 5 Zellen von der BALF Fluid in einer 96-Well - V-Boden Mikrotiterplatte. </li><li> Wasche die Zellen mit 300 ul kaltem PBS 1x und Schleudern bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Stain die Zellen mit Zellfarblösung in 100 ul 1x PBS (1: 1000 Verdünnung) und halten bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Wasche die Zellen mit 300 ul kaltem PBS 1x bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Halten Zellen in 100 &amp; mgr; l FACS-Waschpuffer [Waschpuffer (1x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% Natriumazid], das 1: 100 verdünnt Fc-Block-für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge Zellen bei 4.000 × g für 3 min und entsorgen supernatant. </li><li> Stain Zellen mit 100 &amp; mgr; l Oberflächenfärbung Cocktail (1: 100 Verdünnung) in FACS-Waschpuffer für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 300 &amp; mgr; l FACS-Waschpuffer bei 4.000 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Fix-Zellen in 100 &amp; mgr; l von 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit 300 ul 1x PBS bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 &amp; mgr; l FACS-Waschpuffer. </li><li> Machen Sie einfarbige Färbung Kontrollen unter Verwendung von Durchflusszytometrie Perlen. <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Perlen in den 96-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte und waschen mit 200 ul 1x PBS. </li><li> 1 &amp; mgr; l-Färbung Antikörper auf 100 ul 1x PBS und Perlen und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie Perlen zweimal mit 300 ul 1x PBS. </li></ol></li><li> Analysieren Sie einzelne gebeiztem Kontrollen und Zellen mittels Durchflusszytometrie 14. </li></ol> 6. Homogenisieren von Lungengewebe RNA zu isolieren <ol><li> Nach der Infektion über Nacht ein kleines Stück Lunge (20-40 mg) und halten Sie sie in RNA-stabilisierende Reagenz bei 4 ° C zu sammeln. Dann speichern Sie es bei -80 ° C bis zum nächsten Schritt. </li><li> Waschen Sie die Lungengewebe in kaltem 1x PBS loswerden der RNA-Stabilisierung Reagenz zu erhalten. </li><li> Platzieren das Gewebe in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, das Lyse-Puffer (1 ml Lyse-Puffer + 10 &amp; mgr; l β-Mercaptoethanol). </li><li> Hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke spitzen Schere und homogenisieren für 20-40 sec ein schnurloses Motor Pellet zerstoßen. </li><li> Halten Sie das Lysat auf Eis für 5 min und fahren Sie mit Schritt 7.1. </li></ol> 7. RNA-Isolierung aus der Lunge <ol><li> Zentrifugieren Sie das Lysat bei 18.000 × g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und vorsichtig Transfer in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> 1 Volumen von 70% Ethanol zu dem Lysat. Mischen Sie sofort durch Pipettieren und warten 2-4 min. </li><li> Übertragen Sie bis zu 700 &amp; mgr; l Lysat auf eine Spin-Säule platziertin einem 2 ml Sammelröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden und den Durchlauf verwerfen. </li><li> In 350 ul strengen Waschpuffer und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> In 80 ul DNase I direkt auf die Spinsäule Membran und halten Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> In 350 ul strengen Waschpuffer auf die Spin-Säule und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> In 500 ul RNA Waschpuffer und Zentrifuge bei 9.600 × g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> In 500 ul RNA Waschpuffer und Schleudern bei 9.600 × g für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen und Zentrifuge bei 9.600 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Hinzufügen 30-50 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser direkt auf die spin-Säule zentrifugieren bei 9.600 × g für 1 min. Store RNA bei -80 ° C. </li><li> Führen RNA-Seq - Analyse 14. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir eine einzigartige und minimal-invasive Verfahren, um die Lungen von Mäusen, die mit einer bakteriellen Lungen Pathogen zu beimpfen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren verwendet werden kann, um die Funktion der verschiedenen Gene zu untersuchen, die in Mäusen unter Verwendung von Genen von Entzündungssignalwege defizient sind. Dieses Verfahren kann auch die Entzündungsreaktionen gegen virale und fungale Infektionen der Lunge zu untersuchen verwendet werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber and...

Die Entzündung ist eine grundlegende Immunabwehrmechanismus gegen infektiöse Erreger. Es fördert die Erreger Beseitigung und Reparatur von beschädigtem Gewebe. Es erleichtert auch die Erholung zu einem normalen , gesunden Zustand 1. Jedoch führt dysregulated Entzündung oft zu chronischen entzündlichen Erkrankungen 2. Entzündung der Atemwege ist ein erster Auslöser für verschiedene Lungenerkrankungen wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Asthma und Lungenfibrose 3. Die nicht-typisierbaren (nicht eingekapselten) Haemophilus influenzae (NTHi) mit chronischen oberen und unteren Lungenentzündungserkrankungen 4,5 verbunden. Es ist die dominante Spezies aus den unteren Atemwege von Kindern und Erwachsenen mit chronisch - obstruktiver Lungenerkrankung 4,6,7 isoliert. Die Entzündungsantwort nach der NTHi-Infektion wird durch die Hochregulation von proinflammatorischen Zytokinen (wie TNF und IL-1β) gekennzeichnet, und es wird vermittelt by Mitogen - aktivierte Proteinkinase (MAPK) und nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) über Toll-like Rezeptoren (TLR) 8. Mausmodelle sind sehr nützliche Werkzeuge zur Analyse der zugrundeliegenden Pathologie der Lungenentzündungskrankheit aufgrund der Verfügbarkeit der verschiedenen Gen-defizienten Linien. Live / attenuierten Bakterien und bakterielle Produkte zu inokulieren, einschließlich intranasale Instillation und aerosolized Inhalations 9,10 mehrere Verfahren verwendet worden. Hier zeigen wir, intratracheale Instillation. Obwohl weniger häufig verwendet wird, ist dieser Ansatz effizienter und hoch reproduzierbare wegen der direkten Abgabe des Inokulums auf den unteren Atemwege.

<table><tbody><tr><td>Schokoladen-Agar-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose wasserfrei</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Geschickte Schnelllösung</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel 20/26G&nbsp;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml-Spritze</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Katheter 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Präparierschere, gerade, 10 cm lang</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Irispinzette, gezahnt, 10 cm lang</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #5 Edelstahl, 11 cm lang</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pellet-Pestil-Motor (Gewebehomoginizer)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten V-Boden</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Arbeitsverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Arbeitsverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/tot fixierbares Aqua Totzellen-Färbekit</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs Röhrchen Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intratracheale verabreichung von<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; in mausmodelle zur untersuchung atemwegsentzündung

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren , um effizient und direkt Haemophilus influenzae liefern in die unteren Atemwege von Mäusen. Wir zeigen das Verfahren zur Herstellung von H. influenzae Inokulum, intratracheale Instillation von H. influenzae in die Lunge, Sammlung von broncho-alveolären Lavage (BALF), Analyse von Immunzellen in der BALF und RNA - Isolation für Differentialgenexpressionsanalyse. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Lungenentzündungsreaktion auf alle Bakterien, Viren oder Pilze zu untersuchen. Direkt tracheale Instillation wird meist über intranasale oder Aerosolinhalationsverfahren bevorzugt, da es effizienter das bakterielle Inokulum in die unteren Atemwege mit geringer Mehrdeutigkeit liefert.

Intratracheale Instillation führte zu einer deutlich erhöhten Anzahl von Leukozyten in der BALF (1A, linkes Feld) als Anlage mit Kochsalzlösung. Die Differentialzählung Analyse der Leukozyten zeigte deutlich erhöhte neutrophile Infiltration (Abbildung 1, rechts). Die FACS - Analyse der Zellen in der BALF bestätigt weiter die erhöhte Anzahl von Neutrophilen (1B). Histologische Analyse von H &amp; E-gefärbten Schnitten des Lungengewebes ze...

Wir demonstrieren das Verfahren zur intratrachealen Inokulation von Haemophilus influenzae in die unteren Atemwege von Mäusen. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, um Signalwege zu untersuchen, die die Entzündung der Atemwege in Mausmodellen regulieren.

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Immunantworten in der Lunge während einer bakteriellen Infektion zu untersuchen. Diese Fragestellung kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lungenerkrankungen zu beantworten, beispielsweise, welche regulatorischen Mechanismen und Gene die Lungenentzündung hemmen oder fördern. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt darin, dass sie aufgrund der direkten Applikation des bakteriellen Inokulums in die unteren Atemwege sehr effizient und hochgradig reproduzierbar ist.Als Erstes werden die NTHi auf einer Schokoladen-Agar-Platte ausgestrichen. Die Platte wird über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid invertiert inkubiert. Am folgenden Tag werden die Bakterien in einer Gehirn-Herz-Infusionsbrühe kultiviert.Dann fügen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein Milliliter der Brühe hinzu. Zentrifugieren Sie die Mischung fünf Minuten bei 4.000 g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS.Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal. Verdünnen Sie anschließend 100 Mikroliter der resuspendierten Lösung in 900 Mikrolitern PBS und messen Sie die Extinktion der Kultur bei 600 Nanometern. Verwenden Sie diese Information, um den Inokulum auf 20 Millionen KBE pro Milliliter einzustellen.Als Nächstes bestimmen Sie die Vitalität und die koloniebildenden Einheiten (CFU) des Inokulums. Kultivieren Sie eine bis zehn serielle Verdünnungen der Brühe auf Schokoladen-Agar-Platten und inkubieren Sie die Platten über Nacht. Beginnen Sie damit, die Maus zu anästhesieren, und überprüfen Sie, ob die Anästhesie ausreichend ist, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen.Danach das Tier in Rückenlage positionieren und den ventralen Bereich des Halses rasieren. Die freigelegte Haut desinfizieren. Nun die Haut des oberen ventralen Halsbereichs mit Rattenzahn-Zangen anheben und mit einem Skalpell einen halb bis einen Zentimeter langen Schnitt über dem Thymus durchführen.Danach vorsichtig den Muskel präparieren, um die Luftröhre freizulegen. Langsam 50 µL Luft in die Luftröhre injizieren, gefolgt von 50 µL vorbereiteten NTHi, gefolgt von weiteren 50 µL Luft. Als negative Kontrolle Salzlösung anstelle von NTHi injizieren.Nach der Injektion das Tier etwa eine Minute lang vertikal halten. Anschließend die Inzision mit Gewebekleber verschließen und die Maus etwa 10 Minuten lang seitlich liegend und warm halten. 24 Stunden nach der Infektion das infizierte Tier euthanasieren und die Bauchhöhle mit anatomischen Scheren öffnen.Danach die Vena aorta durchtrennen, um das Tier zu bluten. Anschließend den ventralen Teil der Lunge freilegen, um Zugang zur Trachea zu erhalten. Die Trachea mit einem Katheter der Größe 20 intubieren.Über den Katheter 0,8 Milliliter BALF-Puffer einbringen und die Lavage durch dentale Aspiration sammeln. Dieses Verfahren insgesamt dreimal wiederholen und die vier Lavageproben zu einer einzigen Suspension vereinigen. Einen 100-Mikroliter-Aliquot entnehmen und zwei Minuten bei 2.000 U/min zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Pellet in RBC-Lysispuffer. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie den Pellet in 1x PBS. Zählen Sie nun die Gesamtzahl der Zellen in 100 Mikrolitern der Suspension mit einem Hämozytometer unter 10x-Vergrößerung mit Trypanblau-Färbung.Danach bereiten Sie Objektträger zur Färbung der Zellen vor. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter der BALF-Suspension in die entsprechenden Vertiefungen von Zytospin-Objektträgern und zentrifugieren Sie die Objektträger fünf Minuten lang mit 500 g. Anschließend trocknen Sie die Objektträger zehn Minuten bei Raumtemperatur und färben Sie die Zellen mithilfe einer modifizierten Giemsa-Färbung gemäß den Herstellerprotokollen.Verwenden Sie die verbleibenden Zellen für nachfolgende Analysen, wie beispielsweise FACS, konfokale Mikroskopie und dergleichen. Nach der Sammlung der Lavage aus der infizierten Lunge, entnehmen Sie ein 20–40 Milligramm großes Stück Lunge und inkubieren es über Nacht bei vier Grad Celsius in einem RNA-stabilisierenden Reagenz, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei 80 Grad Celsius. Wenn bereit, waschen Sie die Lungengewebeproben in kaltem PBS, um das RNA-Stabilisierungsreagenz zu entfernen.Danach das Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Lysepuffer und Beta-Mercaptoethanol geben. Anschließend das Gewebe mit einer kleinen Schere in Stücke schneiden und die Stücke mit einem motorisierten Stößel 20–40 Sekunden lang homogenisieren. Den Lysat fünf Minuten auf Eis stellen, dann drei Minuten bei 18.000 g zentrifugieren.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und überführen Sie ihn in ein neues Gefäß. Geben Sie anschließend ein Volumen 70 %igen Ethanol hinzu und pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab. Lassen Sie die Mischung zwei bis vier Minuten bei 25 Grad Celsius ruhen.Übertragen Sie anschließend bis zu 700 Mikroliter auf eine Säule in einem Sammelröhrchen mit zwei Milliliter Volumen und zentrifugieren Sie die Säule 15 Sekunden lang bei 9600 g. Entsorgen Sie den Durchlauf, geben Sie 350 Mikroliter Waschpuffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Inkubieren Sie die Membran danach 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 80 Mikrolitern DNase-I-Lösung.Danach 350 Mikroliter Waschpuffer auf die Säule geben und die Zentrifugation erneut durchführen. Anschließend 500 Mikroliter RNA-Waschpuffer hinzufügen. Die kurze Zentrifugation erneut durchführen und den Durchlauf entsorgen.Führen Sie zwei Waschungen mit RNA-Waschpuffer durch. Geben Sie abschließend 30–50 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt auf die Säule und zentrifugieren Sie diese für eine Minute, um die RNA-Probe im Durchlauf in einem neuen Sammelröhrchen zu sammeln. Das Verfahren wurde wie beschrieben mit normalen, gesunden Mäusen durchgeführt.Die intratracheale Applikation führte im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen zu einer deutlich erhöhten Anzahl von Leukozyten in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von mit NTHi infizierten Mäusen. Die Differenzialzählung der Leukozyten zeigt eindeutig eine verstärkte Neutrophileninfiltration. Die FACS-Analyse der Zellen in der BALF bestätigt weiterhin die erhöhte Anzahl an Neutrophilen.HNE-gefärbte Schnitte des Lungengewebes zeigen eine erhöhte Atemwegsentzündung. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass eine intratracheale Applikation bei Mäusen eine Atemwegsentzündung auslöst. In einem ähnlichen Experiment mit mutierten und Kontrollmäusen wurde die RNA des Lungengewebes mittels Ganztranskriptom-Sequenzierung analysiert.Im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen führte der Mangel an Itch zu einer differenziellen Expression mehrerer Gene. Es wird angenommen, dass Itch ein Regulator entzündlicher Signalwege ist, sodass dieses Ergebnis genutzt werden kann, um neue Studien zu fördern. Während ihrer gesamten Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Lungenerkrankungen den Weg, um die Zellsignalgebung in Immunzellen während Lungenerkrankungen und Entzündungen zu untersuchen.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, besondere Vorsichtsmaßnahmen bei Schritten wie der Freilegung der Trachea und der Applikation von Bakterien in die Trachea zu beachten. Sobald das Verfahren beherrscht ist, kann die intratracheale Applikation innerhalb von zehn Minuten durchgeführt werden, und die Sammlung der Flüssigkeit aus dem Reagenzglas erfolgt innerhalb von 10–15 Minuten. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Analysen wie die RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie und immunologische Blockade durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu klären, beispielsweise, welche Gene hoch- oder herunterreguliert sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Durchführung der intratrachealen bakteriellen Verabreichung in einem Mausmodell

Quelle: Venuprasad, K., et al. Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mausmodellen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Entnahme und Verarbeitung von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einer euthanasierten Maus, die mit nicht typisierbaren Haemophilus influenzae infiziert war, für die nachgelagerte Analyse.

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Intubation bei Mäusen<em&gt; Über</em&gt; Direkte Laryngoskopie Mit einem Otoskop

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