Name: Eine ganze Berg In Situ Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc Spitzschlammschnecke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Lernen Sie die effiziente Whole-Mount-In-Situ-Hybridisierung an Embryonen und Larven von Lymnaea stagnalis. Diese Methode ermöglicht die räumliche Visualisierung von Genexpressionsmustern in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung zu DJJ durch DFG-Projekt # JA2108 / 2-1 unterstützt.

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben , unser Verfahren für eine in - situ - Experiment an embryonalen und Larvenstadien von L. Durchführung stagnalis. Wenn ein Schritt , um die Verwendung eines gefährlichen chemischen beinhaltet dies durch das Wort &quot;ACHTUNG&quot; gekennzeichnet ist und alle entsprechenden Sicherheitsverfahren erlassen werden. Links zu repräsentativen Sicherheitsdatenblätter für gefährliche Chemikalien werden in Ergänzungs Datei 1 zur Verfügung gestellt. Rezepte für alle Reagenzien werden in Ergänzungs Datei 2 zur Verfügung gestellt. 1. Montage von Decapsulation Vorrichtung <ol><li> Um dies zu tun, schließen eine 20 ml Einwegspritze auf Silikonschlauch (mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einem Außendurchmesser von 3 mm) , um eine P1,000 Spitze geschnitten auf eine geeignete Länge , wie in 2A gezeigt. </li><li> Band mit einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit einem invertierten großen Petrischale. Band der Silikonschlauch unmittelbar neben der Mikroskop - Objektträger , wie in Abbildung gezeigt60; 2C und 2D. </li><li> Rest ist eine zog Glasnadel auf dem Objektträger und vorsichtig in den Silikonschlauch einführen , bis die Spitze der Nadel etwa 20% des Weges ragt über den Innendurchmesser des Rohres (siehe Abbildung 2C und 2D). Sobald die Nadel darin Position Band auf der Petrischale nach unten. </li><li> Lassen Sie das freie Ende des Silikonschlauch in einer anderen Petrischale ruhen, die die entkapselten Material sammeln. </li></ol> 2. Probenentnahme, Fixierung und Decapsulation HINWEIS: Alle Schritte werden bei RT durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. <ol><li> Ei Saiten von den Wänden eines Aquariums sorgfältig sammeln. Um dies zu tun, ein flaches Stück aus flexiblem Kunststoff wie einem Spatel verwenden, um die Ei-String aus dem Substrat zu kratzen, und mit einem Kunststoff-Teesieb das schwebende Ei Schnur aus dem Wasser zu fischen. Bühne und sortieren das Material unter einem Mikroskop mit der Führung in Abbildung versehen1. </li><li> Legen Sie das Ei Zeichenfolge auf einem Papiertuch und machen einen Längsschnitt entlang der Eimasse mit Hilfe der Federzange. Rollen Sie die Ei-Kapseln aus dem Ei-String und entfernen Sie so viel von der Jelly-Material wie möglich aus jeder Kapsel durch sie um das Papiertuch drückt die Feder Pinzette. </li><li> Mit Hilfe der Federzange, übertragen Sie die Ei-Kapseln in eine Petrischale mit 5 ml Leitungswasser. Weiter de-Sülze Ei-Kapseln der gewünschten Entwicklungsstadien in diesem Gericht zu sammeln. Sammeln Sie genug Kapseln aus allen Entwicklungsstadien für die geplante WMISH Experiment dann mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Wenn sie mit weiter entwickelten Larven arbeiten (5 Tage nach der ersten Spaltung (DPFC) und älter) betäuben sie vor der Fixierung. HINWEIS: Dadurch werden die Muskeln von Vertrags verhindern , die die Interpretation der in situ Färbemustern sehr schwierig macht. <ol><li> Relax-Larven (während sie noch in ihrer capsu sindles) in einer 2% igen w / v Lösung von MgCl 2 • 6H 2 O für 30 min vor der Fixierung. </li><li> Beurteilen Sie den Grad der Entspannung nach 30 Minuten durch mehrere Larven während Untertauchen noch in ihrer Ei-Kapseln in Fixierungslösung und die Überwachung ihrer Antwort unter dem Mikroskop. Unvollständig entspannt Larven werden in ihren Schalen zurückziehen, während völlig entspannt Larven nicht reagieren. Sobald diese Larven gelockert worden, um mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Ei - Kapseln eine große Bohrung Plastikpipette in ein verschließbares Röhrchen verwenden , das 10 - fache des Volumens von Ei - Kapseln bietet (z. B. 1 ml der abgewickelten Kapseln würden typischerweise mehr als 10 - ml - Röhrchen erfordern). </li><li> Absaugen so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr und ersetzen mit einem Volumen von Fixierungslösung, die 10-fache Volumen der abgesetzten Ei-Kapseln ist. Vorsichtig drehen für jede Entwicklungsstufe für die entsprechende Zeit bei RT (siehe Abbildung 1) , um die Ei - Kapseln in Fixiermittel. </li><li> Discontinue Rotation und lassen Sie die Kapseln die Fixierungslösung in einen geeigneten Abfallbehälter zu sinken und absaugen. </li><li> Waschen Sie die Ei-Kapseln durch die Fixierungslösung mit Phosphat-gepufferte Saline mit 0,1% Tween-20 (PBTw) ersetzt und Drehen bei RT für 5 min. Saugen Sie das PBTw und zweimal wiederholen. </li><li> Entfernen Embryonen und Larven aus ihren Kapseln unter Verwendung der Vorrichtung in 2 gezeigt ist . Zeichnen Sie die Kapseln bis in die 20 - ml - Spritze (Abschnitt 1 für Details), den Schlauch befestigen und zerstreuen dann die Kapseln durch den Schlauch und vorbei an der Glasnadel aus in die Auffangschale. HINWEIS: Normalerweise ist die Mehrheit (&gt; 90%) aller Kapseln sollten nur einen Durchlauf durch das Gerät benötigen. In vielen Fällen wird die Kapselmembran beschädigt, aber Embryonen und Larven bleiben innerhalb der aufgebrochenen Kapsel. Reprocess dieses Material, indem es einfach nach oben in die Spritze aufgezogen und wieder auszuräumen. </li><li> Sammeln Sie die decapsulated Embryonen und Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen ein Mikrofon mitropipette (a P20 für 0 bis 3 Tage alten Larven und eine P200 für ältere Larven mit dem Ende der Spitze abgeschnitten). Hinweis: eine Pause (bis zu mehreren Monaten) in dem Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wenn dies erforderlich ist, sollte die decapsuled Material in ein 1,5 ml Röhrchen für die Lagerung gesammelt werden (mit dem nächsten Schritt fortgesetzt). Andernfalls sofort weiter zu Protokoll 3. </li><li> Erlauben Embryonen und Larven auf den Boden des Röhrchens zu sinken und den Überstand absaugen. Ersetzen Sie mit 33% Ethanol (EtOH) in PBTw und lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 66% EtOH in PBTw und 100% EtOH. Waschen Larven zweimal in 100% EtOH bei RT. Lagern Sie das Material bei -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Wenn Sie bereit sind, um fortzufahren, rehydrieren die Proben durch die 100% EtOH zu entfernen und mit 66% EtOH in PBTw ersetzt, lassen Sie sich für 5 sitzen - 10 min. Wiederholen Sie mit 33% EtOH in PBTw, sitzen lassen 5 - 10 min. Schließlich waschen mit 3x 5 min Wäschen von PBTw, um sicherzustellen, alle EtOH entfernt wird. </li></ol> 3. Proteinase-K, TEA und Post-fixation HINWEIS: Wir finden die folgenden Schritte in kleinen Körben mit einem Gitterboden, die effizienteste und schonende Methode für die schnelle zeitkritische Lösungen auszutauschen. Während diese können zu Hause gemacht werden, verwenden wir Körbe (mittlere Größe) , die mit der Flüssigkeit InSituPro -Vsi Intavis kompatibel sind Handhabungsroboter (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Solche Körbe können schnell und einfach zwischen den Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturschale (TCD), um Lösungen für den Austausch oder die Lösung abgesaugt werden kann, aus dem Bohrloch mit einer Pipette bewegt werden. Alternativ können alle Lösungsaustausch ohne diese Körbe durchgeführt werden, indem man einfach den Überstand aus den Larven Ansaugen. In diesem Fall wird eine sanfte Wirbelbewegung werden alle Embryonen und Larven in die Mitte des Tellers konzentrieren so dass der Überstand aus dem Rand des Brunnens entfernt werden. Im Folgenden wird angenommen der Benutzer Körbe für Lösungsaustausch verwendet wird. <ol><li> Mit einer Pipette, Transfer Embryonen und Larven in einen Korb in einer 12-Well-TCD mit 2 ml PBTw sitzen. . HINWEIS: Die Anzahl der Embryonen und / oder Larven , die hinzugefügt werden können , hängt von der Entwicklungsphase untersucht, aber eine Faustregel ist , mindestens 25% der Bodenfläche frei von Embryonen / Larven (dh zu halten, nicht überladen Warenkorb). </li><li> Bereiten Sie eine angrenzende gut mit 2 ml der entsprechenden Proteinase-K - Lösung (siehe Abbildung 1), und weitere 2 Brunnen mit 2 ml 0,2% Glycin je. Bewegen Sie jeden Korb in den Brunnen der entsprechenden Konzentration von Proteinase-K enthält, und sofort Timing starten. </li><li> Nach 10 Minuten jeden Korb in ein gut mit 0,2% Glycin bewegen und für 5 min inkubiert. Dann bewegen Sie jeden Korb in die zweite gut mit 0,2% Glycin und Inkubation für 5 min. Waschen Sie die Glycine mit 3x 5 min Austausch von 3 ml PBTw. </li><li> Entfernen Sie die PBTw Lösung und behandeln die Proben einmal mit frisch zubereiteten Triethanolamin (TEA) solution für 5 min ACHTUNG! schütteln Sie nicht. Ersetzen mit 3 ml frisch zubereitete TEA-Lösung für 5 min. Nicht aufregen. Aspirieren die Mehrheit der TEA-Lösung aus den Proben. Fügen Sie den frisch zubereiteten Triethanolamine mit Essigsäureanhydrid (TEAAA) Lösung und Inkubation für 5 min. ACHTUNG! Sie agitieren nicht. </li><li> Optional - Während der obige Schritt brütet, bereiten eine weitere neue Charge von TEAAA Lösung und wiederholen Sie den Schritt. HINWEIS: Diese zweite Behandlung mit TEAAA optional ist, aber helfen kann vollständig alle Hintergrund mit Sonden zu erzeugen, Hintergrund anfällig zu beseitigen. </li><li> Entfernen Sie die TEAAA Lösung, indem sie es aus dem Brunnen Ansaugen und ersetzen mit 3 ml PBTw. Nicht aufregen. Entfernen Sie die PBTw und gelten 3 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw. verwirbeln sanft gelegentlich während einer 30-minütigen Inkubation. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel durch sie aus dem Bohrloch abgesaugt und ersetzen mit 3 ml PBTw. Übertragen Sie das Material in ein 1,5-ml-Röhrchen. REDie PBTw mit Hybridisierungspuffer und Inkubation bei RT für 5 min - VORSICHT. </li><li> Die Röhrchen in einen heißen Block bei RT, und stellen Sie die Temperatur auf die gewünschte Hybridisierungstemperatur. HINWEIS: Die Hybridisierungstemperatur Sonde, die spezifisch und müssen empirisch optimiert werden, jedoch finden wir, 55 ° C, um anfänglich Versuch eine gute Temperatur. Lassen Sie den Block auf die Hybridisierungstemperatur zu kommen, und damit die Proben vorzunehmen hybridisieren ca. 15 min (dh, es ist die Zeit , die Ribosonden vorzubereiten stattfindet, ist nicht länger erforderlich). Bereiten Sie ausreichende Mengen (in der Regel 100 &amp; mgr; l) der verdünnten Riboproben. Wir in der Regel Studie Sondenkonzentrationen von 100 und 500 ng / ml als Anfangsbereich. Wir bereiten Riboproben nach 12. </li><li> Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer aus den Proben und fügen Sie die Sonde in Hybridisierungspuffer zu den Proben. Overlay mit 100 &amp; mgr; l (oder einer ausreichenden Volumen einer Phase über die Hybridisierung buffe zu bildenr) von Mineralöl. HINWEIS: Das Mineralöl umfangreiche Kondensation verhindert, dass während der langen Hybridisierungsschritt bilden. Extensive Kondensations deutlich sowohl die Chemie der Hybridisierungslösung und die Konzentration der Sonde zu verändern. </li><li> Denaturieren der Sonde und der Ziel-RNA durch Erhitzen der Proben auf 75 ° C für 10 min, dann reduzieren die Wärme an die Hybridisierungstemperatur erwünscht. Zulassen der Hybridisierung für mindestens 12 h (O / N) oder länger ablaufen (von 24 bis 48 h). </li><li> Während der Hybridisierung ein einzelnes Rohr aus dem Wärmeblock entfernen, drehen Sie es schnell zwischen Daumen und Zeigefinger die Larven zu suspendieren, ohne die Ölphase zu stören, und ersetzen Sie es in den Wärmeblock. Wiederholen Sie einmal dies jedes von 6 bis 12 Stunden oder so. </li></ol> 4. Hot Wäscht und Immunnachweis HINWEIS: Während wir eine Flüssigkeitshandhabungsroboter für die folgenden Schritte verwenden, können diese auch leicht manuell erfolgen. In diesem Fall, Embryonen und Larven shoULD in den 1,5-ml-Röhrchen gehalten werden, die sie in hybridisiert wurden. Alle nachfolgenden Lösung tauscht werden abgesaugt und mit einer P1,000 Pipette zugegeben. Wenn manuell durchgeführt für jede der folgenden Schritte sollten 1 ml jeder Lösung einzusetzen. <ol><li> Wärme ausreichende Volumina (je 3 ml für jede Probe) des 4x, 2x und 1x Waschlösungen auf die Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen alle Proben dreimal in Waschpuffer 4x für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen alle Proben dreimal in 2x Waschpuffer für 15 min jeweils bei der Hybridisierungstemperatur. Waschen Sie alle Proben dreimal in 1x Waschpuffer für jeweils 15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur. </li><li> Waschen Sie alle Proben einmal mit 1x Natriumchlorid Natriumcitrat Puffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) bei der Hybridisierungstemperatur. Erlauben Proben auf RT abkühlen. </li><li> Waschen Sie alle Proben zweimal in 1x SSC + 0,1% Tween 15 min Ersetzen Sie diese 1x SSC-Lösung mit Maleinsäure-Puffer (MAB) und lassen Sie sich für 10 Minuten sitzen Wiederholen Sie die MAB wAsche. Ersetzen MAB mit Blocklösung und Inkubation für 1,5 Stunden. </li><li> Tauschen Sie die Blocklösung für Antikörperlösung (1: 10.000 Verdünnung des Antikörpers in Blocklösung) und Inkubation für 12 Stunden (O / N) bei RT unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Farbentwicklung und Montage <ol><li> Absaugen der Antikörperlösung und waschen 15-mal mit PBTw für jeweils 10 min. Ersetzen PBTw mit 1x alkalische Phosphatase-Puffer (AP) und für 10 min inkubiert. </li><li> Während die oben genannten Inkubationsschritt fortschreitet, die Färbelösung AP vorbereiten (siehe Zusatz Datei 2) - VORSICHT. Übertragen Sie das Material in einen TCD gut und ersetzen Sie die 1x AP-Lösung mit AP-Färbelösung. Beachten Sie jetzt die Zeit, so dass die Länge der Zeit, die Farbreaktion stattfindet, für aufgezeichnet werden. Überwachen Sie die Entwicklung des Verfärbungsmuster, bis das Signal-Hintergrund-Verhältnis optimal ist. </li><li> Um die Farbentwicklung zu stoppen, entfernen Sie die 1x AP Färbelösung (entsorgen in der entsprechenden waste-Container) und 2 ml PBTw einsetzen und die Zeit jetzt beachten. Spülen Sie zweimal mit PBTw für jeweils 5 Minuten. Verwenden Sie eine dieser Spülungen das Material in einem 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. </li><li> Entfernen Sie die PBTw und anwenden 1 ml 3,7% Formaldehyd in PBTw und agitieren oder drehen für mindestens 30 min bei RT (dies auch O getan werden kann / N). </li><li> Waschen Sie die Fixiermittel mit 3 Waschungen von PBT (entsorgen den Abfall Fixiermittel in einem geeigneten Abfallbehälter). Waschen Sie die Proben 3 mal bei 50 ° C in entionisiertem Wasser. Hinweis: Diese Waschungen eliminieren die Ausfällung von Salzen, die während der Clearing- und Visualisierungsschritte sichtbar werden können. </li><li> Entscheiden Sie, ob die Proben sollten in Benzylbenzoat montiert werden: Benzylalkohol (BB: BA, die auch als Murray klar bekannt) oder Glycerin. HINWEIS: Wir bevorzugen die leistungsfähigeren Clearingstelle BB: BA als L. stagnalis Embryonen sind etwas undurchsichtig. Proben in BB montiert werden: BA wird zunächst durch eine Ethanolreihe dehydratisiert werden müssen. Proben in 60% zu montierendenGlycerin kann sofort montiert werden. </li><li> Übertragen Sie die Proben in die Montagelösung (BB: BA oder 60% Glycerin) mit einer Pipette. HINWEIS: Wenn in BB Montage: BA muss dies auch in einem Glas erfolgen (BB: BA wird Polycarbonat-Kunststoff schmelzen). </li><li> Lassen Sie die Proben für 5 zu löschen - 10 min, und dann montieren sie auf einen Objektträger eine entsprechende Anzahl von gestapelten Deckgläser als Abstandshalter unter Verwendung von (1 Deck für Proben &lt;1 DPFC, 2 Deckgläser für Proben&gt; 1 DPFC). HINWEIS: Vollständige Halterungen können nun eine Verbindung Mikroskop mit DIC-Optik abgebildet werden. </li></ol>

<ol><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrusca%2C+RC+%22Invertebrates%22">Invertebrates</a>. , Sinauer. Sunderland. (2002).</li>
<li>Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en">http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en</a> (2013).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+in+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Week.+Epi.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li>
<li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slipper+snail%2C+Crepidula.%3A+an+emerging+lophotrochozoan+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc%2C+Crepidula+fornicata%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rep%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li>
<li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+gene+expression+with+larval+competence%2C+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li>
<li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel%2C+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li>
<li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li>
<li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+set+of+maternal+genes%3F+Insights+from+a+molluscan+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li>
<li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage%2C+with+special+reference+to+its%27+chemical+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neth.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li>
<li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li>
<li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod%2C+Lymnaea+palustris.%2C+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li>
<li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Emb.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li>
<li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li>
<li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li>
<li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li>
<li>Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).</li>
<li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li>
<li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li>
<li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li>
<li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15(2013).</li>
<li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li>
<li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).</li>
<li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited%2C+lateralized+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li>
<li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li>
<li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li>
<li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745(2011).</li>
<li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+%28LCav-beta%29+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).</li>
<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li>
<li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+genome+size+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Visualisierung von RNA - Transkripte mit vermutlich unterschiedlichen Expressionsniveaus in allen Entwicklungsstadien der Spitzschlammschnecke. Die Embryonen und Larven aus ihren Kapseln entfernen wir eine Vielzahl von chemischen, osmotischen Schock und physikalische Behandlungen trialed für andere encapsulated- berichtet Entwicklung von Modellorganismen. in unseren Händen Allerdings ist die Methode, die wir hier beschreiben, die nur mit hohem Durchsatz ...

Mollusken sind eine Gruppe von Tieren, die das Interesse einer breiten Vielfalt wissenschaftlicher Disziplinen halten. Trotz ihrer morphologischen Vielfalt 1, Artenreichtum ( an zweiter Stelle nach den Arthropoden in Bezug auf die Artenzahl 2) und der Relevanz für eine breite Palette von kommerziellen 3, medizinischen 4 und wissenschaftlichen Fragen 5-8, gibt es relativ wenige Mollusken - Arten , die zu behaupten kann , sein beide gut ausgestattete wissenschaftliche Modelle und einfach in einer Laborumgebung zu halten. Ein Mollusken , die viel von Disziplinen wie Neurobiologie 9 verwendet wird, Ökotoxikologie 10 und in jüngerer Zeit die Evolutionsbiologie 11,12, ist Spitzschlammschnecke, in erster Linie wegen seiner weiten Verbreitung und extrem einfache Wartung. Trotz seiner Popularität als &quot;Modell&quot; Organismus und seine lange Geschichte der Verwendung von Entwicklungsbiologen 13-19, die Reichweite und Leistung von molekularen Werkzeugen zur Verfügung, die L. StAGNalis wissenschaftliche Gemeinschaft liegt weit hinter der traditionellen Tiermodellen (Drosophila, Maus, Seeigel, Nematoden). Unser Wunsch zu entwickeln Lymnaea als ein molekulares Modell von einem Interesse an den molekularen Mechanismen ergibt sich die Schalenbildung führen. Dies motiviert uns eine Reihe von Techniken zu verfeinern , die für die effiziente, konsistente und sensible Darstellung der Genexpression während der Lymnaea &#39;s Entwicklung ermöglichen würde. Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist weit verbreitet für eine Vielzahl von Modellorganismen eingesetzt und ist seit mehr als 40 Jahren im Einsatz 20. In seinen verschiedenen Ausprägungen können, ISH räumlich eingesetzt werden, um spezifische Loci auf den Chromosomen, rRNA, mRNA und Mikro-RNAs zu lokalisieren. Eine der Herausforderungen , mussten wir vor der Raffination eine WMISH Verfahren zur L. zu adressieren stagnalis war die Frage der sanft und effizient Embryonen und Larven von verschiedenen Stadien von t Extrahierener Ei-Kapseln, in denen sie abgelegt werden. Diese Extraktion oder &quot;decapsulation &#39;muss effizient angemessene Material zu sammeln eine bestimmte in situ - Experiment, während zur gleichen Zeit die Aufrechterhaltung morphologischen und Zellintegrität um erreicht werden. Während andere Modellorganismen auch gekapselter Entwicklung durchlaufen, konnte erfolgreich in L. eingesetzt werden in unseren Händen keine der Methoden für diese Spezies berichtet stagnalis. Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens sind daher: L. zu extrahieren stagnalis Embryonen und Larven aus ihren Kapseln in einem Hochdurchsatzverfahren , Pre-Hybridisierung Behandlungen anwenden, das den WMISH Signal zu optimieren, Embryonen und Larven mit zufriedenstellender WMISHsignals für die Bildgebung vorzubereiten.

<table><tbody><tr><td>Federleichte Pinzette</td><td>Ehlert & Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschläuche</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 Well Gewebekulturschalen</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>ACHTUNG - Kann Krebs erzeugen. Giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Giftig: Gefahr schwerwiegender irreversibler Wirkungen durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>VORSICHT - VERURSACHT AUGENREIZUNGEN. KANN REIZUNGEN DER ATEMWEGE UND DER HAUT VERURSACHEN. Vermeiden Sie das Einatmen von Staub. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung. Nur bei ausreichender Belüftung verwenden</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>VORSICHT - Kann beim Einatmen gesundheitsschädlich sein. Kann Reizungen der Atemwege verursachen. Kann schädlich sein, wenn es über die Haut aufgenommen wird. Kann Hautreizungen verursachen. Kann Augenreizungen verursachen. Kann beim Verschlucken schädlich sein.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Typ 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>VORSICHT - Kann beim Einatmen gesundheitsschädlich sein. Kann Reizungen der Atemwege verursachen. Kann schädlich sein, wenn es über die Haut aufgenommen wird. Kann Hautreizungen verursachen. Kann Augenreizungen verursachen. Kann beim Verschlucken schädlich sein.</td></tr><tr><td>NukleasefreiRinderserum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Lachssperma</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>VORSICHT - ZU DEN NEBENWIRKUNGEN GEHÖREN BLUTUNGEN UND LOKALE REIZUNGEN. MÖGLICHE ALLERGISCHE REAKTION BEI EINATMEN, VERSCHLUCKEN/KONTAKT. AUGEN-/HAUT-/ATEMWEGSREIZEND. MÖGLICHE HYPERSENSIBILISIERUNG. ES WURDE BERICHTET, DASS ES WÄHREND DER SCHWANGERSCHAFT DAS RISIKO EINER TOTGEBURT ERHÖHT</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Formamid</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>VORSICHT - Reizt Augen und Haut. Kann beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken gesundheitsschädlich sein. Kann das ungeborene Kind schädigen. Hygroskopisch.</td></tr><tr><td>Standard-Formamid</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>VORSICHT - Reizt Augen und Haut. Kann beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken gesundheitsschädlich sein. Kann das ungeborene Kind schädigen. Hygroskopisch.</td></tr><tr><td>Triethanolamin</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>VORSICHT - Vermeiden Sie das Einatmen von Dampf oder Nebel. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen. Vermeiden Sie längeren oder wiederholten Kontakt mit der Haut. Nach der Handhabung gründlich waschen.</td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>VORSICHT - VERURSACHT SCHWERE VERBRENNUNGEN DER HAUT UND DER AUGEN. REAGIERT HEFTIG MIT WASSER. GESUNDHEITSSCHÄDLICH BEIM VERSCHLUCKEN. DAMPF, DER DIE AUGEN UND DIE ATEMWEGE REIZT</td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>VORSICHT - Sehr gefährlich bei Augenkontakt (reizend), bei Verschlucken, . Gefährlich bei Hautkontakt (reizend), bei Einatmen (lungenreizend). Leicht gefährlich bei Hautkontakt (Permeator). Ätzend für Augen und Haut.</td></tr><tr><td>Benzylbenzoat</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>VORSICHT - Kann beim Einatmen schädlich sein. Kann Reizungen der Atemwege verursachen. Kann schädlich sein, wenn es über die Haut aufgenommen wird. Kann Hautreizungen verursachen. Kann Augenreizungen verursachen. Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.</td></tr><tr><td>Benzylalkohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>VORSICHT - Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Verursacht schwere Augenreizungen.</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungspulver</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab Fragmente AP konjugiert</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid in Dimethylformamid</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>VORSICHT - Kann dem ungeborenen Kind Schaden zufügen. Gesundheitsschädlich durch Einatmen und bei Berührung mit der Haut. Reizt die Augen.</td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>VORSICHT - Potenziell gesundheitsschädlich bei Verschlucken. Nicht auf die Haut, in die Augen oder auf die Kleidung gelangen. Potenziell haut- und augenreizend.</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>VORSICHT - Kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Kann Reizungen der Atemwege und des Verdauungstrakts verursachen. Die toxikologischen Eigenschaften dieses Materials sind noch nicht vollständig untersucht.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>VORSICHT - Kann beim Einatmen schädlich sein. Kann Reizungen der Atemwege verursachen. Kann schädlich sein, wenn es über die Haut aufgenommen wird. Kann Hautreizungen verursachen. Kann Augenreizungen verursachen. Kann beim Verschlucken schädlich sein.</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>VORSICHT - Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Giftig bei Kontakt mit der Haut. Verursacht Hautreizungen. Verursacht schwere Augenschäden. Kann Atemwegsreizungen verursachen.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>VORSICHT - Kann Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen verursachen. Die toxikologischen Eigenschaften dieses Materials sind noch nicht vollständig untersucht.</td></tr><tr><td>Mineralöl&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-VSI&nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

eine ganze berg<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierungsverfahren für die gastropod mollusc<em&gt; spitzschlammschnecke</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ Hybridisierung (WMISH) ist eine Technik , die für die räumliche Auflösung von Nukleinsäuremolekülen (oft mRNAs) innerhalb eines &quot;whole mount&quot; Gewebepräparation oder Entwicklungsstadium (wie ein Embryo oder Larve) von Interesse ermöglicht. WMISH ist extrem leistungsfähig, da sie wesentlich zur funktionellen Charakterisierung komplexer Metazoen Genome beitragen kann, eine Herausforderung, die mehr von einem Engpass bei der Flut der nächsten Generation Sequenzdaten immer. Trotz der konzeptionellen Einfachheit der Technik viel Zeit wird häufig benötigt, um die verschiedenen Parameter inhärent WMISH Experimente für neuartige Modellsysteme zu optimieren; subtile Unterschiede in den zellulären und biochemischen Eigenschaften zwischen Gewebetypen und Entwicklungsstadien bedeuten, dass eine einzige WMISH Methode nicht für alle Situationen geeignet sein können. Wir haben eine Reihe von WMISH Methoden für die wieder auftauchende gastropod Modell entwickelt , das Spitzschlammschnecke erzeugen konsistent undklar WMISH Signale für eine Reihe von Genen, und in allen Entwicklungsstadien. Diese Verfahren umfassen die Zuordnung von Larven unbekannter chronologischen Alter zu einem ontogenetischer Fenster die effiziente Entfernung von Embryonen und Larven von ihren Eier Kapseln, die Anwendung eines geeigneten Proteinase-K - Behandlung für jeden ontogenetischer Fenster und Hybridisierung, post-Hybridisierung und Immunnachweis Schritte. Diese Methoden stellen eine Grundlage, das resultierende Signal für eine bestimmte RNA-Transkript verfeinert werden kann weiter mit Sonde spezifische Anpassungen (in erster Linie Sondenkonzentration und Hybridisierungstemperatur).

Die repräsentativen WMISH Färbungsmuster in 3 gezeigt wurden die oben beschriebenen Technik erzeugt wurde, und eine Vielzahl von räumlichen Expressionsmuster für Gene , die in einem Bereich von molekularen Prozessen beteiligt reflektieren Bereich von Schalenbildung (Novel Gen 1, 2, 3 und 4), an Zell-Zell - Signalisierung (DPP) zur Transkriptionsregulation (Brachyurie) in einer Reihe von Entwicklungsstadien. Während wir die Expressionsn...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern eine Reihe von Methoden für die Hochdurchsatz-Entkapselung von Lymnaea stagnalis Embryonen und Larven zur Vorbereitung auf die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount und für nachfolgende Behandlungen vor und nach der Hybridisierung zur Verfügung zu stellen.

Eine ganze Berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierungsverfahren für die Gastropod Mollusc<em&gt; Spitzschlammschnecke</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die räumlichen Expressionsmuster einzelner Gene in Ganzpräparaten von Embryonen und Larven des Süßwasserschneckenart Lymnaea stagnalis effizient sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Evo-Devo und Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wo und wann Gene exprimiert werden, wie sie miteinander interagieren und welche funktionellen Rollen sie möglicherweise übernehmen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Entfernung von embryonalen und larvalen Geweben aus ihren Eikapseln schnell, einfach und effektiv ist.Dieses Material wird anschließend gemäß einer Entwicklungs-Roadmap, die wir im ergänzenden Material bereitstellen, kategorisiert und anschließend durch stagespezifische Vorhybridisierungsschritte verarbeitet. Um dieses Verfahren zu beginnen, verbinden Sie eine 20-milliliter-Entsorgungsspritze mit einem Silikonrohr. Als Nächstes befestigen Sie eine Standardmikroskopieobjektplatte mit Klebeband an einer großen umgedrehten Petrischale.Dann befestigen Sie den Silikonschlauch unmittelbar neben dem Objektträger mit Klebeband. Anschließend platzieren Sie eine gezogene Glasnadel auf dem Objektträger und führen Sie sie vorsichtig in den Silikonschlauch ein, bis die Spitze der Nadel etwa 20 % des Innendurchmessers des Schlauchs überragt.Wenn die Nadel in Position ist, befestigen Sie sie mit Klebeband am Petrischalenboden. Legen Sie das freie Ende des Silikonrohrs in eine weitere Petrischale, die das entkapselte Material auffängt. Um die Ei-Stämme von den Wänden eines Aquariums zu sammeln, verwenden Sie ein flaches, flexibles Plastikstück als Spatel, um die Ei-Stämme vom Substrat abzukratzen.Verwenden Sie einen Kunststoff-Teesieb, um die schwimmende Ei-Stammprobe aus dem Wasser zu fischen. Danach sortieren und einteilen Sie das Material gemäß dieser Anleitung unter dem Mikroskop. Legen Sie die Ei-Stammprobe auf ein Papiertuch und führen Sie mit der Federkraftzange einen Längsschnitt entlang der Eimasse durch.Dann rollen Sie die Eikapseln aus der Eistrain heraus und entfernen Sie so viel wie möglich vom Gelee-Material von jeder Kapsel, indem Sie es auf dem Papiertuch hin- und herbewegen. Übertragen Sie anschließend mit der feinen Pinzette die Eikapseln in eine Petrischale, die 5 Milliliter Leitungswasser enthält. Sammeln Sie weiterhin entgelterte Eikapseln der gewünschten Entwicklungsstadien in dieser Schale.Sammeln Sie ausreichend Kapseln aus allen Entwicklungsstadien für das geplante WMISH-Experiment, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Entspannen Sie nun Larven, die älter als fünf Tage nach der ersten Teilung sind, 30 Minuten lang in einer 2 %igen (Gewicht pro Volumen) Lösung von Magnesiumchlorid-Hexahydrat, bevor sie fixiert werden. Nach 30 Minuten bewerten Sie den Entspannungsgrad, indem Sie mehrere Larven zusammen mit ihren Eikapseln in die Fixierungslösung tauchen und ihre Reaktion unter dem Mikroskop überwachen.Larven, die nicht vollständig entspannt sind, werden sich in ihre Gehäuse zurückziehen. Vollständig entspannte Larven reagieren hingegen nicht. Sobald diese Larven entspannt wurden, überführen Sie die Eikapseln mithilfe einer Plastikpipette mit großer Öffnung in ein dicht verschließbares Gefäß, das das 10-fache Volumen der Eikapseln bietet.Als Nächstes saugt so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Röhrchen ab und ersetzt sie durch die Fixierlösung, die das 10-fache Volumen der abgesetzten Eikapseln hat. Dreht die Eikapseln vorsichtig in der Fixierlösung bei Raumtemperatur für die jeweils geeignete Dauer je nach Entwicklungsstadium. Danach wird die Drehung gestoppt und die Kapseln dürfen absinken. Die Fixierungslösung in einen geeigneten Abfallbehälter abpipettieren. Die Eikapseln waschen, indem die Fixierungslösung durch PBTw ersetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur rotiert wird.Aspirieren Sie das PBTw und waschen Sie zwei weitere Male. Danach entfernen Sie die Embryonen und Larven mithilfe der Vorrichtung aus ihren Kapseln. Ziehen Sie die Kapseln in eine 20-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie dann die Spritze am Schlauch. Geben Sie die Kapseln durch den Schlauch und die Glasnadel in die Sammelschale ab. Sammeln Sie anschließend die entkapselten Embryonen und Larven mit einer Mikropipette in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.Anschließend entweder das fixierte Material dehydrieren und lagern oder die Schritte mit Proteinase K, TEA und der Nachfixierung durchführen. Nach Abschluss dieser Schritte das Material kurz vorhybridisieren und die Ribosonden hinzufügen. Die Bedeutung einer geeigneten Proteinase-K-Behandlung für das endgültige Ergebnis eines In-situ-Experiments ist für Lymnaea stagnalis von entscheidender Bedeutung.Dies spiegelt sich in einem breiten Spektrum an Pro-K-Konzentrationen wider, die für unterschiedliche Entwicklungsstadien erforderlich sind und von 0 bis 500 Mikrogramm pro Milliliter reichen. Während der Hybridisierung entnehmen Sie ein einzelnes Reagenzglas aus dem Heizblock. Drehen Sie es schnell zwischen Daumen und Zeigefinger, um die Larven zu suspendieren, ohne die Ölphase zu stören, und stellen Sie es anschließend wieder in den Heizblock zurück.Wiederholen Sie diesen Vorgang alle sechs bis zwölf Stunden einmal. Die hier gezeigten Genexpressionsmuster wurden mit Larven aus verschiedenen Entwicklungsstadien erzeugt. Alle Proben wurden in Murray's Clear montiert und abgebildet.Die ungefähren Alter sind oben rechts in jedem Bild angegeben. Die Blickrichtung ist unten rechts angegeben, und die Genorthologie ist unten links angegeben. Diese Ergebnisse veranschaulichen die Expressionsmuster von Genen, die an einer Vielzahl molekularer Prozesse beteiligt sind, die von der Schalenbildung über die Transkription bis zur Zell-zu-Zell-Signalübertragung reichen.In allen F&auml;llen ist ein eindeutiges und klares zellul&auml;res F&auml;rbungsmuster sichtbar, und die Ergebnisse sind innerhalb eines Experiments unter einzelnen Larven hochgradig konsistent sowie zwischen Experimenten hochgradig reproduzierbar. Sobald die Methode beherrscht ist, ben&ouml;tigt die gesamte manuelle Arbeitszeit dieser Technik weniger als zwei Tage. Der gr&ouml;&szlig;te Teil der Zeit wird f&uuml;r das Sammeln und Vorbereiten von embryonalen und larvalen Proben f&uuml;r die Hybridisierung sowie f&uuml;r das Aufnehmen der Ergebnisbilder verwendet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass jede Ribosonde wahrscheinlich feine Anpassungen bei wichtigen Parametern wie der Hybridisierungstemperatur, der Sondenkonzentration und der Dauer der Hybridisierung erfordert. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte uns diese Technik, eine Reihe von Genen, die an der Schalenbildung beteiligt sind und zuvor durch transkriptomische und proteomische Analysen identifiziert wurden, recht gut zu charakterisieren.

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Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.

Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Die Erhaltung der Süßwassermuschel hängt von der Überwachung der Fortpflanzungsmuster und -prozesse von Arten ab. Diese Studie standardisiert ein nicht-tödliches Protokoll für die Probenahme von Kiemeninhalten, die Charakterisierung der Larvenentwicklung und die Bereitstellung eines digitalen Repositorys für gesammelte Daten. Dieses Protokoll-Datenbank-Paket wird ein wichtiges Werkzeug für Muschelforscher bei der Wiederherstellung gefährdeter Arten sein.

Standardisierung einer nicht-tödlichen Methode zur Charakterisierung des Fortpflanzungsstatus und der Larval-Entwicklung von Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida)

In der Arbeit werden Methoden für die Larvenkultur der Schnecke Crepidula fornicata in einem kleinvolumigen System im Labormaßstab und in einem Umgebungs-Meerwasser-Mesokosmen-System vorgestellt, die im Feld eingesetzt werden können.

Labor- und Feldkultur von Larven des Pantoffelzuwandes, Crepidula fornicata

Lernen Sie die effiziente Whole-Mount-In-Situ-Hybridisierung an Embryonen und Larven von Lymnaea stagnalis. Diese Methode ermöglicht die räumliche Visualisierung von Genexpressionsmustern in der Entwicklungsbiologie.

Eine ganze Berg

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